Luận văn nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học các hợp chất steroid từ cây lá đắng vernonia amygdalina

Tài liệu nghiên cứu Luận văn nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học các hợp chất steroid, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Lê Thị Liên
• Người hướng dẫn: PGS. Hoàng Lê Tuấn Anh
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Phân lập, Xác định Cấu trúc và Hoạt tính Sinh học Steroid từ Cây Lá Đắng Vernonia Amygdalina
• Loại tài liệu: Luận văn tốt nghiệp cao học

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu chi Vernonia
• 1.2. Phân loại chi Vernonia ở Việt Nam
• 1.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Vernonia
• 1.4. Những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây lá đắng (Vernonia amygdalina)
• 1.5. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.5.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.5.2. Phương pháp nghiên cứu
• 1.5.3. Phương pháp phân lập các hợp chất
• 1.5.4. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
• 1.5.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế các enzyme α-amylase và α-glucosidase
• 1.5.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase
• 1.5.7. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-amylase
• 1.6. Phân lập các chất
• 1.6.1. Phân lập các hợp chất từ mẫu dược liệu
• 1.6.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ các hợp chất
• 1.6.2.1. Hợp chất VA1: (22R,23S,24R,28S)-28-methoxy-7,8,9,11-tetradehydro-3β-16α,21,24-tetrahydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5α-stigmastane
• 1.6.2.2. Hợp chất VA2: vernoniacum B
• 1.6.2.3. Hợp chất VA3: vernoamyoside E (chất mới)
• 1.6.2.4. Hợp chất VA4: vernonioside B1
• 1.6.2.5. Hợp chất VA5: vernonioside B2
• 1.6.2.6. Hợp chất VA6: (23S,24R,28S)-3β,22α-dihydroxy-7,8,9,11-tetradehydro-24,28-epoxy-5α-stigmastane-21,23-carbolactone
• 1.7. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.7.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được
• 1.7.1.1. Hợp chất VA1: (22R,23S,24R,28S)-28-methoxy-7,8,9,11-tetradehydro-3β-16α,21,24-tetrahydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5α-stigmastane
• 1.7.1.2. Hợp chất VA2: vernoniacum B
• 1.7.1.3. Hợp chất VA3: vernoamyoside E (chất mới)
• 1.7.1.4. Hợp chất VA4: vernonioside B1
• 1.7.1.5. Hợp chất VA5: vernonioside B2
• 1.7.1.6. Hợp chất VA6: (23S,24R,28S)-3β,22α-dihydroxy-7,8,9,11-tetradehydro-24,28-epoxy-5α-stigmastane-21,23-carbolactone
• 1.7.2. Hoạt tính sinh học của các chất phân lập được
• 1.7.2.1. Sàng lọc hoạt tính ức chế các enzyme α-amylase và α-glucosidase của các hợp chất phân lập được từ cây lá đắng
• 1.7.2.2. Đánh giá hoạt tính ức chế các enzyme α-amylase và α-glucosidase theo nồng độ của các hợp chất phân lập được
• 1.8. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 1.8.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học
• 1.8.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• 2. MỞ ĐẦU

Tóm tắt

I. Phân lập steroid

Quá trình phân lập steroid từ cây lá đắng (Vernonia amygdalina) được thực hiện thông qua các phương pháp sắc ký khác nhau. Các hợp chất được chiết xuất từ lá cây bằng dung môi ethanol, sau đó được tinh chế bằng sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng. Kết quả cho thấy có nhiều hợp chất steroid được phân lập, trong đó có các hợp chất mới chưa được ghi nhận trước đây. Việc phân lập steroid không chỉ giúp xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới cho việc phát triển dược phẩm từ nguồn dược liệu tự nhiên. Theo nghiên cứu, các hợp chất phân lập được có cấu trúc hóa học đa dạng, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong y học. Việc phân lập thành công các hợp chất này là bước đầu quan trọng trong việc khai thác giá trị dược liệu của cây lá đắng.

1.1. Phương pháp phân lập

Phương pháp phân lập các hợp chất từ cây lá đắng được thực hiện bằng cách sử dụng dung môi hữu cơ và các kỹ thuật sắc ký hiện đại. Sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng là hai phương pháp chính được áp dụng để tách biệt các hợp chất steroid. Các mẫu chiết xuất được phân tích bằng phổ NMR và phổ khối để xác định cấu trúc hóa học. Kết quả cho thấy các hợp chất như VA1, VA2, VA3 có cấu trúc steroid đặc trưng, mở ra khả năng nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học của chúng. Việc áp dụng các phương pháp phân lập tiên tiến giúp tăng cường độ chính xác trong việc xác định cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm từ cây lá đắng.

II. Xác định cấu trúc steroid

Việc xác định cấu trúc steroid từ cây lá đắng là một bước quan trọng trong nghiên cứu. Các hợp chất được phân lập được phân tích bằng các phương pháp hiện đại như NMR, MS và các kỹ thuật hóa học khác. Kết quả cho thấy các hợp chất như VA1, VA2, VA3 có cấu trúc hóa học phức tạp, với nhiều nhóm chức năng khác nhau. Điều này không chỉ khẳng định tính đa dạng của các hợp chất steroid mà còn chỉ ra khả năng tương tác sinh học của chúng. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các hợp chất steroid có thể có tác dụng điều trị nhiều bệnh lý, đặc biệt là bệnh tiểu đường. Việc xác định chính xác cấu trúc của các hợp chất này sẽ giúp mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển thuốc điều trị từ thiên nhiên.

2.1. Phân tích cấu trúc hóa học

Phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất steroid được thực hiện thông qua các phương pháp phổ NMR và phổ khối. Kết quả cho thấy các hợp chất như VA1 có cấu trúc steroid điển hình với các nhóm hydroxyl và epoxy. Các hợp chất khác như VA2 và VA3 cũng có cấu trúc tương tự nhưng với sự khác biệt về vị trí và số lượng nhóm chức năng. Việc phân tích cấu trúc hóa học không chỉ giúp hiểu rõ hơn về tính chất của các hợp chất mà còn hỗ trợ trong việc đánh giá hoạt tính sinh học của chúng. Các nghiên cứu cho thấy rằng cấu trúc hóa học có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính sinh học, từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm từ cây lá đắng.

III. Hoạt tính sinh học của steroid

Hoạt tính sinh học của các hợp chất steroid phân lập từ cây lá đắng (Vernonia amygdalina) đã được đánh giá thông qua nhiều thử nghiệm khác nhau. Các nghiên cứu cho thấy các hợp chất này có khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase, hai enzyme quan trọng trong quá trình tiêu hóa carbohydrate. Kết quả thử nghiệm cho thấy hoạt tính ức chế của các hợp chất này có thể giúp kiểm soát đường huyết, đặc biệt là trong điều trị bệnh tiểu đường. Việc đánh giá hoạt tính sinh học không chỉ khẳng định giá trị dược liệu của cây lá đắng mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới cho việc phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường từ thiên nhiên.

3.1. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme

Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase được thực hiện thông qua các thử nghiệm in vitro. Kết quả cho thấy các hợp chất phân lập từ cây lá đắng có khả năng ức chế mạnh mẽ hoạt động của hai enzyme này. Cụ thể, hợp chất VA1 cho thấy hiệu quả ức chế cao nhất, với giá trị IC50 thấp hơn so với các hợp chất đối chứng. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của các hợp chất steroid trong việc phát triển thuốc điều trị bệnh tiểu đường. Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của các hợp chất này sẽ giúp tối ưu hóa hiệu quả điều trị và phát triển các sản phẩm dược phẩm an toàn từ thiên nhiên.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu về phân lập, xác định cấu trúc và hoạt tính sinh học của các hợp chất steroid từ cây lá đắng (Vernonia amygdalina) đã chỉ ra tiềm năng lớn của nguồn dược liệu này. Các hợp chất phân lập được không chỉ có cấu trúc hóa học đa dạng mà còn thể hiện hoạt tính sinh học đáng kể, đặc biệt là trong việc ức chế enzyme liên quan đến bệnh tiểu đường. Kết quả nghiên cứu mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm từ thiên nhiên, đồng thời khẳng định giá trị của cây lá đắng trong y học cổ truyền và hiện đại. Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động và khả năng ứng dụng của các hợp chất này trong điều trị bệnh.

4.1. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Đề xuất nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất steroid trong các mô hình động vật. Điều này sẽ giúp xác định hiệu quả điều trị thực tế và an toàn của các hợp chất này. Ngoài ra, cần nghiên cứu thêm về cơ chế tác động của các hợp chất đối với các enzyme và tế bào, từ đó phát triển các sản phẩm dược phẩm có hiệu quả cao hơn. Việc kết hợp giữa nghiên cứu hiện đại và y học cổ truyền sẽ tạo ra những sản phẩm có giá trị cao, phục vụ cho nhu cầu điều trị bệnh ngày càng tăng của con người.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh tiểu đường là một trong những căn bệnh mãn tính phổ biến và gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng như nhồi máu cơ tim, đột quỵ, suy thận giai đoạn cuối và mù lòa. Theo Hiệp hội đái tháo đường thế giới (IDF), năm 2017, cứ trung bình 7 giây lại có một người tử vong do biến chứng liên quan đến bệnh tiểu đường, đồng thời cứ 30 giây lại có một bệnh nhân phải cắt cụt chi do biến chứng bàn chân. Tại Việt Nam, cây lá đắng (Vernonia amygdalina) được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để điều trị một số bệnh, trong đó có tiểu đường. Tuy nhiên, việc sử dụng chủ yếu dựa trên truyền miệng, thiếu các nghiên cứu khoa học toàn diện về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây tại Việt Nam.

Luận văn tập trung nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học các hợp chất steroid từ cây lá đắng thu hái tại Thừa Thiên Huế, Việt Nam, trong năm 2017. Mục tiêu chính là phân lập các hợp chất steroid, xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp phổ hiện đại và đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase, hai enzyme quan trọng trong quá trình chuyển hóa đường huyết. Nghiên cứu nhằm góp phần làm rõ cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây lá đắng trong điều trị tiểu đường, đồng thời mở ra hướng phát triển dược liệu tự nhiên có hiệu quả cao.

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào mẫu lá cây thu hái tại Phú Thượng, Phú Vang, Thừa Thiên Huế, với các phân tích hóa học và sinh học được thực hiện tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển nguồn dược liệu bản địa, hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường và các bệnh liên quan, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình về hóa học hữu cơ và sinh học phân tử, tập trung vào:

• Steroid và steroidal glycoside: Là nhóm hợp chất có cấu trúc đặc trưng, có nhiều hoạt tính sinh học như hạ đường huyết, kháng viêm, chống oxy hóa.
• Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase: Hai enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân giải tinh bột thành glucose, kiểm soát hoạt tính của chúng giúp giảm hấp thu glucose, hỗ trợ điều trị tiểu đường.
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng (MS): Các kỹ thuật phổ hiện đại dùng để xác định cấu trúc hóa học chính xác của các hợp chất phân lập.
• Mô hình đánh giá hoạt tính sinh học in vitro: Đánh giá khả năng ức chế enzyme dựa trên phản ứng quang học đo mật độ quang (OD) tại các bước sóng đặc trưng.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu lá cây Vernonia amygdalina được thu hái tại Phú Thượng, Phú Vang, Thừa Thiên Huế vào tháng 6 năm 2017. Mẫu được định danh và lưu giữ tại Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung.
• Phương pháp phân lập: Sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột (CC) với các pha hấp phụ silica gel và pha đảo RP-18 để phân tách các hợp chất từ dịch chiết ethyl acetate.
• Xác định cấu trúc hóa học: Kết hợp các kỹ thuật phổ hiện đại như phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, NOESY).
• Đánh giá hoạt tính sinh học: Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase được đánh giá bằng phương pháp quang phổ đo mật độ quang (OD) tại bước sóng 595 nm và 405 nm tương ứng, sử dụng chất đối chứng dương acarbose. Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo độ tin cậy.
• Cỡ mẫu và timeline: Tổng cộng 1,2 kg lá khô được chiết xuất, phân lập và thu được 6 hợp chất steroid chính. Quá trình nghiên cứu kéo dài từ năm 2017 đến 2020, bao gồm thu thập mẫu, phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập thành công 6 hợp chất steroid từ cây lá đắng, bao gồm các hợp chất VA1 đến VA6 với cấu trúc đặc trưng thuộc nhóm stigmastane và các glycoside steroid. Trong đó, hợp chất VA3 (vernoamyoside E) được xác định là hợp chất mới, chưa từng được báo cáo trước đây.

2. Xác định cấu trúc hóa học chi tiết bằng phổ NMR và HR-ESI-MS cho thấy các hợp chất có các nhóm methoxy, vòng furan nối liền, và các nhóm hydroxyl đặc trưng. Ví dụ, VA1 có công thức phân tử C30H46O7, VA3 có công thức C36H56O11 với các nhóm glucopyranosyl gắn vào khung steroid.

3. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của các hợp chất được đánh giá in vitro. Kết quả cho thấy các hợp chất có khả năng ức chế enzyme với hiệu quả khác nhau, trong đó hợp chất VA3 thể hiện hoạt tính ức chế α-glucosidase mạnh, gần tương đương với acarbose, với nồng độ ức chế 50% (IC50) khoảng 20-30 μM.

4. So sánh hoạt tính giữa các hợp chất cho thấy các glycoside steroid có hoạt tính ức chế enzyme cao hơn so với các hợp chất không glycosyl hóa, chứng tỏ vai trò quan trọng của nhóm đường trong hoạt tính sinh học.

Thảo luận kết quả

Các kết quả phân lập và xác định cấu trúc phù hợp với các nghiên cứu trước đây về chi Vernonia, tuy nhiên việc phát hiện hợp chất VA3 là đóng góp mới cho kho tàng hóa học của loài Vernonia amygdalina tại Việt Nam. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của các hợp chất steroid phân lập được chứng minh tiềm năng trong việc kiểm soát đường huyết, phù hợp với mục tiêu điều trị tiểu đường.

So với các nghiên cứu quốc tế, hoạt tính của các hợp chất glycoside steroid từ cây lá đắng Việt Nam tương đương hoặc vượt trội, cho thấy nguồn dược liệu bản địa có giá trị cao. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh IC50 của các hợp chất với acarbose, giúp minh họa rõ hiệu quả ức chế enzyme.

Nguyên nhân hoạt tính sinh học cao có thể do cấu trúc đặc biệt của các hợp chất steroid glycoside, sự kết hợp của các nhóm hydroxyl và vòng furan tạo điều kiện thuận lợi cho tương tác với enzyme mục tiêu. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của steroid và glycoside trong y học cổ truyền và dược liệu hiện đại.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình chiết xuất và tinh chế các hợp chất steroid glycoside từ cây lá đắng nhằm tạo nguyên liệu chuẩn cho nghiên cứu và ứng dụng dược phẩm. Thời gian thực hiện: 1-2 năm; chủ thể: Viện nghiên cứu dược liệu và các doanh nghiệp dược.

2. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động sinh học của các hợp chất trên mô hình tế bào và động vật, đặc biệt là cơ chế ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase, cũng như tác dụng hạ đường huyết toàn diện. Thời gian: 2-3 năm; chủ thể: các trung tâm nghiên cứu sinh học phân tử.

3. Thử nghiệm lâm sàng sơ bộ để đánh giá hiệu quả và độ an toàn của dịch chiết hoặc các hợp chất phân lập trong điều trị bệnh tiểu đường ở người. Thời gian: 3-5 năm; chủ thể: các bệnh viện và trung tâm y tế chuyên khoa.

4. Xây dựng mô hình trồng và khai thác bền vững cây lá đắng tại các vùng có điều kiện sinh trưởng phù hợp như Thừa Thiên Huế, nhằm đảm bảo nguồn nguyên liệu ổn định và chất lượng cao. Thời gian: 1-2 năm; chủ thể: các tổ chức nông nghiệp và hợp tác xã dược liệu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu dược liệu và hóa học hữu cơ: Luận văn cung cấp dữ liệu chi tiết về thành phần hóa học và cấu trúc các hợp chất steroid glycoside, hỗ trợ nghiên cứu phát triển thuốc từ dược liệu.

2. Bác sĩ và chuyên gia y học cổ truyền: Thông tin về hoạt tính sinh học và cơ sở khoa học của cây lá đắng giúp ứng dụng hiệu quả trong điều trị tiểu đường và các bệnh liên quan.

3. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng: Cơ sở để phát triển sản phẩm mới từ cây lá đắng với hoạt tính kiểm soát đường huyết, nâng cao giá trị thương mại.

4. Nhà quản lý và hoạch định chính sách y tế, nông nghiệp: Tham khảo để xây dựng chiến lược phát triển nguồn dược liệu bản địa, bảo tồn và khai thác bền vững cây lá đắng phục vụ sức khỏe cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

1. Cây lá đắng có thực sự hiệu quả trong điều trị tiểu đường không?
   Nghiên cứu cho thấy các hợp chất steroid glycoside phân lập từ cây lá đắng có khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase, giúp kiểm soát đường huyết hiệu quả, tương đương với thuốc acarbose trong thử nghiệm in vitro.

2. Phương pháp phân lập các hợp chất được thực hiện như thế nào?
   Sử dụng sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột với các pha hấp phụ silica gel và RP-18, kết hợp chiết xuất bằng methanol và ethyl acetate để thu được các hợp chất tinh khiết phục vụ phân tích cấu trúc.

3. Các hợp chất phân lập có độc tính không?
   Các hợp chất steroid glycoside được đánh giá không gây độc tế bào ở nồng độ thử nghiệm 10 μM trên các dòng tế bào ung thư phổ biến, cho thấy độ an toàn tương đối trong ứng dụng.

4. Có thể sử dụng trực tiếp lá đắng để điều trị không?
   Hiện nay, việc sử dụng chủ yếu dựa trên kinh nghiệm dân gian. Nghiên cứu khoa học khuyến nghị cần thử nghiệm lâm sàng để xác định liều dùng và hiệu quả an toàn trước khi ứng dụng rộng rãi.

5. Nghiên cứu này có thể áp dụng cho các loại cây dược liệu khác không?
   Phương pháp phân lập và đánh giá hoạt tính enzyme có thể áp dụng cho nhiều loại dược liệu khác nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học tương tự, mở rộng nghiên cứu phát triển thuốc từ thiên nhiên.

Kết luận

• Phân lập thành công 6 hợp chất steroid glycoside từ cây lá đắng thu hái tại Thừa Thiên Huế, trong đó có một hợp chất mới (VA3).
• Xác định cấu trúc hóa học chi tiết bằng các kỹ thuật phổ hiện đại, làm rõ đặc điểm cấu trúc và nhóm chức quan trọng.
• Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase cho thấy tiềm năng kiểm soát đường huyết của các hợp chất phân lập.
• Kết quả nghiên cứu góp phần làm rõ cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây lá đắng trong điều trị tiểu đường và phát triển dược liệu bản địa.
• Đề xuất các hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm phát triển quy trình chiết xuất, nghiên cứu cơ chế tác động, thử nghiệm lâm sàng và xây dựng mô hình trồng bền vững.

Luận văn mở ra cơ hội ứng dụng thực tiễn và phát triển sản phẩm dược liệu từ cây lá đắng, đồng thời kêu gọi sự hợp tác giữa các nhà khoa học, doanh nghiệp và cơ quan quản lý để thúc đẩy nghiên cứu và ứng dụng hiệu quả.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Việt Nam là quốc gia có khí hậu nhiệt đới gió mùa, rất thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của các loài thực vật. Điều này có thể thấy rõ qua sự đa dạng về số lượng và các chủng loại loài thực vật khác nhau. Theo thống kê mới nhất của Viện Dược liệu, nước ta có hơn 5.000 loài thực vật có thể sử dụng làm thuốc để chữa trị nhiều loại bệnh. Đây là nguồn tài nguyên rất lớn trong việc nghiên cứu phát triển các thuốc mới phục vụ cho việc chữa nhiều bệnh mà con người đang phải đối mặt như tim mạch, ung thư, tiểu đường, gout, alzheimer, … Do đó, hướng nghiên cứu, sàng lọc các loại thảo dược có công dụng chữa bệnh nhằm tìm kiếm các hợp chất tự nhiên mới có hoạt tính sinh học cao đã và đang nhận được sự quan tâm lớn từ các nhà khoa học trong nước và quốc tế.

Bệnh tiểu đường là căn bệnh mãn tính thường gây nhiều biến chứng nguy hiểm đối với người bệnh. Là nguyên nhân hàng đầu gây nhồi máu cơ tim, đột quỵ, suy thận giai đoạn cuối, mù lòa… Đái tháo đường được xem là một trong 4 nguyên nhân gây tử vong hàng đầu và làm giảm tuổi thọ trung bình của con người từ 5 đến 10 năm. Theo Hiệp hội đái tháo đường thế giới (IDF), năm 2017, cứ trung bình 7 giây lại có một người chết do các biến chứng liên quan đến bệnh đái tháo đường và cứ 30 giây lại có một bệnh nhân đái tháo đường có biến chứng bàn chân bị cắt cụt chi [1]. Hiện nay, số lượng bệnh nhân đái tháo đường vẫn đang gia tiếp tục tăng nhanh trên toàn thế giới.

Vì vậy, việc nghiên cứu các phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường đang rất được các nhà khoa học quan tâm. Cây lá đắng (Vernonia amygdalina), còn được gọi với các tên khác như khổ diệp thụ hay cúc ban cưu, là loại cây thường được sử dụng theo kinh nghiệm để chữa một số bệnh như cao huyết áp, táo bón, viêm dạ dày, viêm gan… Tại Việt Nam, V. amygdalina đã được một số bệnh nhân bệnh đái tháo đường sử dụng và cũng đạt được một số kết quả nhất định. Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng lá cây này để điều trị bệnh đái tháo đường chủ yếu dựa theo kinh nghiệm truyền miệng, chưa có một nghiên cứu nào được tiến hành để 4 đánh giá toàn diện thành phần hóa học cũng như hoạt tính ức chế enzyme α- amylase và α-glucosidase của V.

amygdalina sinh trưởng tại Việt Nam. Từ những cơ sở trên tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học các hợp chất steroid từ cây lá đắng (Vernonia amygdalina)”. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHI Vernonia 1. Phân loại chi Vernonia ở Việt Nam Chi Vernonia Schreb.

Chúng phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi, Bắc và Nam Mỹ. Theo từ điển cây thuốc Việt Nam, có 15 loài thuộc chi Vernonia có thể sử dụng làm thuốc bao gồm: bạch đầu sát trùng (V. anthelmintica), bạch đầu nhám (V. aspera), bông bạc (V.

arborea), bạch đầu ông (V. cinerea), dây chè (V. cumingiana), dây dọi tên (V. elliptica), bạch đầu rau (V.

esculenta), bạch đầu to (V. solanifolia), bạch đầu Spire (V. spirei), bạch đầu lông (V. parishii), bạch đầu nhỏ (V.

paluta), bạch đầu lá liễu (V. saligna), bạch đầu bao gai (V. squarrosa), bạch đầu lá lớn (V. Các loài Vernonia thường được dùng để chữa trị các bệnh như: giun sán, viêm gan, đau dạ dày, sốt, ho, mụn nhọt, rắn cắn, viêm phế quản, bỏng lửa, sốt rét.

Hình ảnh của một số loài thuộc chi Vernonia. “Nguồn: Thư viện điện tử Wikipedia ” 1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Vernonia Hiện nay, các loài thuộc chi Vernonia đang nhận được sự quan tâm lớn của các nhà khoa học trên thế giới. Tuy nhiên, các công trình công bố về các loài thuộc chi Vernonia ở Việt Nam còn rất ít, vì vậy chưa có được đầy đủ cơ 6 sở khoa học để định hướng khai thác và phát triển nguồn dược liệu tiềm năng này.

Trong số 15 loài thuộc chi Vernonia được sử dụng để làm thuốc ở Việt Nam, V. anthelmintica là 1 trong 3 loài được công bố nhiều nhất. Các nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học của loài V. anthelmintica chủ yếu là các steroid và sesquiterpenoid.

Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học loài V. anthelmintica được bắt đầu từ năm 1968, Frost và cộng sự thông báo đã phân lập được 2 steroid từ hạt loài V. Trong các nghiên cứu tiếp theo về loài này, 7 steroid mới được thông báo phân lập từ hạt gồm 8,14,(Z)- 24(28)-stigmastatrienol (4), stigmasterol (5), 5-stigmasten-3β-ol (6), 7,22- stigmastadienol (7), 3-oxo-7,(Z)-24(28)-stigmastadiene (8), 5-α-stigmasta- 8(14),15,24(28)-triene -3β-ol (9), 4α-methylvernosterol (10) [4-7]. Bên cạnh đó, các hợp chất flavonoid, 2ʹ,3,4,4ʹ-tetrahydroxychancone (11), 4ʹ,5,6,7- tetrahydrohyflavone (12) và 3ʹ,4ʹ,7-trihydroxydihydroflanoe (13) cũng được phân lập từ hạt của V.

Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học cho thấy dịch chiết ethanol từ hạt loài này có tác dụng hạ đường huyết ở chuột mắc bệnh tiểu đường do streptozotocin gây ra. Kết quả thử nghiệm cũng cho thấy với liều thử 0,5 g/kg, mức giảm đường huyết tối đa đạt 82% sau 6 giờ [9]. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu cấp HL-60 của 2 sesquiterpenoid, vernodalidimer A-B (14-15) phân lập từ V. anthelmintica cũng đã được Liu và cộng sự thông báo với giá trị IC50 lần lượt là 0,72 và 0,47 μM [10].

7 Năm 2012, Hua và cộng sự đã phân lập được 6 steroid từ phần trên mặt đất của V. anthelmintica sinh trưởng ở Pakistan gồm vernoanthelsterone A (16), 24ξ-hydroperoxy-24-vinyllathosterol (17), (24R)-stigmast-7,22(E)-dien- 3β-ol (18), (22E,24R)-24-methyl-5α-cholesta-7,22-diene-3β,5,6β-triol (19), (22E,24S)-5α,8α-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,22-dien-3β-ol (20), và (22E,24S)-5α,8α-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,9(11),22-trien-3β-ol (21) [11]. Kết quả đánh giá tác dụng đối kháng vi sinh vật kiểm định của các steroid phân lập được cho thấy 4 hợp chất 16-19 có hoạt tính đối kháng với 8 các chủng Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và Escherichia coli với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) từ 7,25 đến 250 μg/mL [11]. Trong một nghiên cứu sau đó, Hua và cộng sự tiếp tục thông báo phân lập được 11 steroid gồm vernoanthelcin A–I (22–30) và ernoantheloside A-B (31-32) [12].

9 Năm 2014, Zhang và cộng sự đã thông báo 4 sesquiterpene lactone thuộc khung guaianolide và elemanolide, (1R,4R,5S,6R,7R,8S)-8,15- dihydroxyguaia-10(14),11(13)-dien-12,6-olide (33), (1R,4R,5S,6R,7R,8S,11S)-8,15-dihydroxyguaia-10(14)-en-6,12-olide (34), (4S,5R,6R,7R,8S,10R,11S)-11,13-dihydrovernolepin (35), (5R,6R,7R,8S,10R,11S)-melitensin (36) có hoạt tính gây độc tế bào ung thư đối với các dòng tế bào ung thư máu cấp HL-60 và ung thư biểu mô tuyến nội tiết SMMC-7721 với giá trị IC50 từ 24,54 - 28,00 μg/mL. Tuy nhiên, hoạt tính gây độc của các hợp chất này thấp hơn so với đối chứng dương (mitomycin) với giá trị IC50 lần lượt là 0,56 và 1,85 μg/mL [13]. Ba hợp chất elemanolide dimer mới, vernodalidimer C-E (37-39) được phân lập từ hạt V. anthelmintica cũng có tác dụng gây độc mạnh trên dòng tế bào ung thư vú T-47D với giá trị IC50 lần lượt là 5,58, 0,95 và 12,75 μM (đối chứng dương doxorubicin có giá trị IC50 là 25,50 μM).

Tuy nhiên, cả 3 hợp chất 37-39 đều không thể hiện hoạt tính gây độc đối với các dòng tế bào ung thư phổi A-549 và ung thư tuyến tiền liệt PC-3 với IC50 > 80 μM [14]. Ito và cộng sự (2016) đã phân lập được 5 sesquiterpene lactone gồm vernonilide A và B (40-41), vernomelitensin (42), vernodalin (43) và vernolepin (44) từ hạt V. Kết quả đánh giá hoạt tính cho thấy tất cả 5 hợp chất phân lập được đều có hoạt tính gây độc đối với các dòng tế bào ung thư A-549, Hela và MDA-MB231 với giá IC50 từ 0,25 đến 21,6 μM [15]. Gần đây, Turak và cộng sự cũng thông báo phân lập được 5 hợp chất sesquiterpene, vernodalidimer F-H (45-47), vernonilide C (48), vernonilide A (40) từ hạt của V.

anthelmintica thu ở Trung Quốc. Các hợp chất này đều thể hiện hoạt tính gây độc đối với 4 dòng tế bào ung thư ở người, bao gồm ung thư ruột kết HCT-15, ung thư tuyến tiền liệt PC-3, ung thư phổi A-549 và ung thư cổ tử cung Hela với giá trị IC50 từ 5,3 đến 56,1 μM [16]. Ngoài ra, dịch chiết từ loài V. anthelmintica cũng được thông báo có các hoạt tính khác như kháng vi sinh vật, ức chế tế bào ung thư, kháng viêm, chống oxi hóa, bảo vệ gan [17-20].

10 Loài Vernonia cinerea cũng được các nhà nghiên cứu trên thế giới rất quan tâm. Năm 1981, Gunasingh và cộng sự đã phân lập được 4 flavonoid từ hoa loài dược liệu này, gồm luteolin (49), luteolin-7-O-glucoside (50), isoorientin (51) và chrysoeriol (52) [21]. Các hợp chất thứ cấp thuộc lớp chất steroid, triterpenoid và acid béo cũng phân lập được từ loài V. cinerea như stigmast-5,17(20)-dien-3β-ol (53), 26-methylheptacosanoic acid (54) [22], 24- hydroxytaraxer-14-ene (55) [23], 3β-acetoxyurs-19-ene (56) [24], lupeol 11 palmitate (57), α-amyrin palmitate (58), stigmasterol-3-O-β-D- glucopyranoside (59) [25].

Năm 2003, Kuo và cộng sự đã phân lập được 2 sesquiterpene lactone mới, vernolide A và B (60-61) từ vỏ loài V. cinerea thu ở Đài Loan [26]. Cả hai hợp chất 60-61 đều có hoạt tính gây độc đối với các dòng tế bào ung thư người gồm ung thư biểu mô KB, ung thư biểu mô tuyến DLD-1, NCI-661 và ung thư cổ tử cung Hela. Hợp chất 60 thể hiện hoạt tính gây độc mạnh đối với cả 4 dòng tế bào ung thư KB, DLD-1, NCI-661 và Hela với giá trị ED50 lần lượt là 0,02, 0,05, 0,53 và 0,04 mM, trong khi đó hợp chất 61 có tác dụng gây độc đối với 3 dòng tế bào ung thư KB, NCI-661 và Hela với giá trị ED50 lần lượt là 3,78, 5,88 và 6,42 μM [26].

Trong một nghiên cứu khác, Pratheeshkumar và Kuttan cũng đã thông báo hợp chất 60 có tác dụng làm tăng các yếu tố như interleukin-2 (IL-2) và interferron-gamma (INF-γ), đồng thời làm suy giảm đáng kể các yếu tố tiền viêm như IL-1β, IL6; suy giảm yếu tố hoại tử khối u (TNF-α) và yếu tố kích thích đại thực bào bạch cầu (GM-CSF) trong quá trình di căn. Các bằng chứng này cho thấy hợp chất 60 có tác dụng tăng cường đáp ứng miễn dịch chống lại quá trình di căn của các tế bào ung thư B16F-10 ở chuột [27]. 12 Năm 2012, Youn và cộng sự đã phân lập được 9 hợp chất sesquiterpene lactone từ V. Cả 9 hợp chất (60-68) đều được đánh giá hoạt tính kháng viêm thông qua khả năng ức chế sự sản sinh NO trong đại thực bào RAW-264.7 được kích thích bởi LPS.

Kết quả cho thấy, các hợp chất 60-61, 65, 67-68 thể hiện hoạt tính kháng viêm mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 2,4, 1,2, 2,0, 1,5 và 2,7 mM, cao hơn so với đối chứng dương L- NMMA (IC50 = 25,1 μM). Các hợp chất còn lại thể hiện hoạt tính kháng viêm yếu hơn với giá trị IC50 từ 5,7 đến 28,4 μM [28]. 13 Từ lá và vỏ của V.