Tổng quan luận án
Cây thuốc và nguồn dược liệu tự nhiên đóng vai trò quan trọng trong hệ thống y tế cổ truyền cũng như công nghiệp dược phẩm hiện đại. Theo ước tính, Việt Nam sở hữu khoảng gần 12.000 loài thực vật bậc cao có mạch, trong đó gần 4.000 loài được ứng dụng làm thuốc. Trong bối cảnh bệnh ung thư trở thành một trong những căn bệnh nan y mang tính toàn cầu với tỷ lệ tử vong cao, việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế tế bào ung thư từ các loài thảo dược nhiệt đới là một hướng nghiên cứu cấp thiết.
Cây đại bi (Blumea balsamifera (L.) DC) và cây ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) là hai loài thảo dược thuộc họ Cúc (Asteraceae), được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền Việt Nam và nhiều quốc gia châu Á. Hai loài này thường xuất hiện trong các bài thuốc dân gian điều trị bệnh phụ khoa, cảm mạo, viêm nhiễm, rối loạn tiêu hóa và bệnh ngoài da. Một số nghiên cứu quốc tế đã bước đầu ghi nhận dịch chiết và một số phân đoạn của hai loài cây này có hoạt tính sinh học, bao gồm khả năng ức chế tế bào ung thư. Tuy nhiên, tại Việt Nam, các nghiên cứu chuyên sâu về thành phần hóa học, đặc biệt là việc phân lập các hợp chất tinh khiết và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro trên các dòng tế bào cụ thể, vẫn còn nhiều khoảng trống.
Luận án tiến sĩ hóa học của nghiên cứu sinh Lê Thị Thúy Hằng, chuyên ngành Hóa hữu cơ (Mã số: 9.44.01.14), thực hiện tại Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Văn Thanh và TS. Nguyễn Xuân Cường, đã tập trung giải quyết các vấn đề trên.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể gồm:
- Nghiên cứu thành phần hóa học của cây đại bi (Blumea balsamifera (L.) DC) và cây ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) thuộc họ Cúc (Asteraceae).
- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được để tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm tạo ra các sản phẩm thuốc cũng như giải thích tác dụng chữa bệnh từ các loài nghiên cứu.
Nội dung chính của luận án bao gồm:
- Phân lập các hợp chất từ cây đại bi (Blumea balsamifera (L.) DC) và cây ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) ở Việt Nam bằng các phương pháp sắc ký.
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng phương pháp vật lý và hóa học (phổ NMR 1D/2D, HR-ESI-MS, phổ lưỡng sắc tròn CD, năng suất quay cực).
- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập được trên các dòng tế bào ung thư người.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng thực vật: Mẫu cây đại bi (Blumea balsamifera (L.) DC) được thu hái tại tỉnh Vĩnh Phúc vào tháng 5 năm 2016 (mẫu tiêu bản TPCN-22); mẫu cây ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) được thu hái tại quận Bắc Từ Liêm, thành phố Hà Nội vào tháng 3 năm 2016 (mẫu tiêu bản TPCN-07). Cả hai mẫu đều do TS. Nguyễn Thế Cường (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật) giám định và được lưu trữ tại Viện Hóa sinh biển và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
- Phạm vi khoa học: Phân lập các phân đoạn phân cực và bán phân cực (cặn dichloromethane và dịch chiết nước) của phần thân, cành, lá; xác định cấu trúc hóa học và thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Tổng quan tài liệu trong luận án điểm lại có hệ thống các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài nghiên cứu:
Đối với cây đại bi (Blumea balsamifera)
Về thành phần hóa học: Các nghiên cứu trên thế giới đã xác định thành phần chính của cây đại bi gồm flavonoid và terpene (monoterpene, sesquiterpene, diterpene).
- Yuxin Pang và cộng sự (2014) thống kê các lớp chất phân lập từ loài này.
- Tại Việt Nam, Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự (2012) phân lập được 1 hợp chất dihydroflavonol mới (B1) cùng 7 hợp chất đã biết (B2–B8).
- Trên thế giới, Nijsiji Ruangrungsi và cộng sự (1981) phân lập 2 flavonoid (B9, B10); Yasuo Fujimoto và cộng sự (1988) công bố 3 sesquiterpene lactone mới là blumealactone A–C (B43–B45); Naoto Osaki và cộng sự (2005) phân lập 2 sesquiterpenoid ester mới (B46, B47) và 9 flavonoid (B11–B19); Mohamed Hag Ali và cộng sự (2005) phân lập biflavonoid 3-O-7''-biluteolin (B20) và các flavanone (B21, B22); Nisakorn Saewan và cộng sự (2011) phân lập 9 flavonoid (B23–B31); Ragasa và cộng sự (2005) công bố icthyothereol acetate và cryptomeridiol (B48); Ming Chen và cộng sự (2009) phân lập 10 sesquiterpenoid ester mang tên blumeaene A–J (B49–B58); Shirota Osamu và cộng sự (2011) phân lập 5 sesquiterpene khung guaiane mới (B59–B63), 1 sesquiterpene khung eudesmane (B64) và diterpene austroinulin (B65); Jing Xu (2012) phân lập 10 sesquiterpene mới balsamiferine A–J (B66–B75); Azis Saifudin và cộng sự (2012) phân lập epiblumeaene K (B76) và các dẫn xuất khác; Tan Daopeng và cộng sự (2013) phân lập trans-phytol (B80), amentoflavone (B42); Jun Ma và cộng sự (2018) phát hiện diterpenoid blumpene A (B81) và 3 guaiane sesquiterpenoid blumpene B–D (B82–B84).
Về hoạt tính sinh học:
- Tác dụng ức chế enzyme xanthine oxidase (điều trị bệnh gút) của các hợp chất flavonoid B1, B4, B8 với giá trị $\text{IC}_{50}$ lần lượt là 0,23; 1,91 và 1,28 $\mu\text{M}$ (Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự, 2004, 2012).
- Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: blumealactone A–C ức chế tế bào ung thư sarcoma ở nồng độ 5–10 $\mu\text{g/mL}$ (Fujimoto, 1988; Thái Lan, 2013); các chất B15, B16, B49 ức chế tế bào ung thư bạch cầu với $\text{IC}{50}$ từ 1,5 đến 26,2 $\mu\text{M}$; các flavonoid B23, B24, B29 ức chế tế bào ung thư biểu mô khoang miệng KB ($\text{IC}{50} = 17,09 - 47,72\ \mu\text{g/mL}$) và ung thư phổi NCI-H187 ($\text{IC}_{50} = 1,29 - 29,97\ \mu\text{g/mL}$) (Saewan, 2011).
- Các hoạt tính khác: chống oxy hóa (Zhi-long Jiang; Yuan-Hui Wang), chống viêm khớp, kháng khuẩn (Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Candida albicans), bảo vệ gan, hạ huyết áp, làm tan sỏi thận (trà Sambong).
Đối với cây ngải cứu (Artemisia vulgaris)
Về thành phần hóa học:
- Tại Việt Nam, Nguyễn Thị Phương Thảo và cộng sự (2004) sử dụng phương pháp GC/MS và $^{13}\text{C-NMR}$ xác định 43 hợp chất terpene (28 monoterpene, 14 sesquiterpene) trong tinh dầu ngải cứu ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau.
- Trên thế giới, Sabuj Kumar Kundu và cộng sự (1966, 1968) phân lập triterpene fernenol (V44) và ancol triterpene pentacyclic (V45); David Drake và cộng sự (1974) phân lập các dẫn xuất acetylen; Kelsey và cộng sự phân lập psilostachyin và psilostachyin C (V46, V47); J. Alberto Marco và cộng sự (1990) phân lập các sesquiterpene acid khung eudesmane (V48–V50); Sang-Jun Lee và cộng sự (1999, 2000) phân lập các flavonoid (V56–V80); Andrée Carnat và cộng sự (2000) tách dicaffeoylquinic acid; Sundaram Ravi và cộng sự (2001) công bố artemisia lactone (V51) và vulcaris lactone (V52); Consolacion Ragasa và cộng sự (2008) phân lập sesquiterpene V53; Truong Van Nguyen Thien và cộng sự (2018) phân lập artanoic acid (V54); Ashraf M. Omar và cộng sự (2019) phân lập vulgaric acid (V55) và 5 dẫn xuất flavonol (V81–V85).
Về hoạt tính sinh học:
- Khả năng gây độc tế bào ung thư: cặn chiết EtOAc ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 ($\text{IC}{50} = 57\ \mu\text{g/mL}$), cặn n-hexane ức chế ung thư dạ dày AGS ($\text{IC}{50} = 153\ \mu\text{g/mL}$) và ung thư cổ tử cung HeLa ($\text{IC}{50} = 160\ \mu\text{g/mL}$) (Iran, 2011); ức chế ung thư tuyến tiền liệt, ung thư ruột ($\text{IC}{50} = 66,7\ \mu\text{g/mL}$); hợp chất jaceosidin (V82) ức chế tế bào ung thư tụy PANC-1 ($\text{IC}{50} = 30,7\ \mu\text{g/mL}$); các hợp chất V77–V81 ức chế enzyme monoamine oxidase ($\text{IC}{50} = 1,0 - 25,0\ \mu\text{M}$).
- Hoạt tính chống oxy hóa (Madhav Kunal, 2018; Sunita Munda; Bishnu Prasad Pandey), bảo vệ gan, hạ đường huyết (Nawar Aziz Alkhafaji), giãn cơ trơn đường tiêu hóa và hô hấp.
Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết:
Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về tinh dầu và các dịch chiết thô, việc phân lập các hợp chất tự nhiên có độ phân cực trung bình và cao từ dịch chiết dichloromethane và phân đoạn nước của cây đại bi và ngải cứu tại Việt Nam còn hạn chế. Nhiều hợp chất phân lập chưa được xác định cấu hình lập thể đầy đủ hoặc chưa được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro một cách có hệ thống trên các dòng tế bào ung thư người.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Luận án sử dụng các phương pháp nghiên cứu hóa học hợp chất thiên nhiên kết hợp với thử nghiệm sinh học in vitro chuẩn hóa.
Quy trình chiết xuất và phân lập
- Chiết xuất mẫu thực vật: 2,0 kg bột khô phần trên mặt đất của mẫu đại bi (B. balsamifera) và ngải cứu (A. vulgaris) được chiết hồi lưu với methanol ở nhiệt độ phòng (3 lần $\times$ 5 lít). Dịch chiết gom lại và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được 300 g cặn chiết methanol tổng số đối với cây đại bi. Cặn methanol được hòa tan trong nước và chiết phân bố lần lượt với n-hexane (thu 39 g cặn) và dichloromethane (thu 45 g cặn), phần còn lại là dịch nước và cặn không tan.
- Phân tách phân đoạn nước cây đại bi: Dịch nước được xử lý qua cột nhựa hấp phụ Diaion HP-20, rửa nước loại bỏ đường và muối vô cơ, sau đó rửa giải bằng gradient MeOH/nước (50/50, 75/25, 100/0) thu được 3 phân đoạn W1 (650 mg), W2 (8,74 g) và W3 (16 g). Phân đoạn W2 có vết sắc ký rõ nét được chọn để tiếp tục phân lập.
- Kỹ thuật sắc ký:
- Sắc ký lớp mỏng (TLC): Bản mỏng Silica gel $60\ \text{F}{254}$ (Merck 1.05715) và pha đảo $\text{RP}{18}\ \text{F}_{254\text{S}}$ (Merck). Phát hiện chất dưới đèn UV (254 nm, 365 nm) hoặc phun dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4\ 10%$ và hơ nóng.
- Sắc ký lớp mỏng điều chế: Bản mỏng tráng sẵn Silica gel $60\text{G}\ \text{F}_{254}$ (Merck 105875).
- Sắc ký cột (CC): Pha thường sử dụng Silica gel cỡ hạt $0,040 - 0,063\ \text{mm}$ ($240 - 430\ \text{mesh}$, Merck); pha đảo sử dụng Silica gel ODS (ODS-A, $12\ \text{nm}$, S-$150\ \mu\text{m}$, YMC Co.); cột rây phân tử Sephadex LH-20; cột nhựa hấp phụ Diaion HP-20 (Supelco).
- Sắc ký lỏng trung áp (MPLC): Thiết bị Biotage – Isolera One.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Hệ thống HPLC phân tích Agilent 1200 series và HPLC điều chế Preparative HPLC-Agilent 1200 series.
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
- Phổ khối lượng (ESI-MS và HR-ESI-MS): Đo trên thiết bị Agilent 1260 series single quadrupole LC/MS và phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS nhằm xác định khối lượng phân tử chính xác và công thức phân tử.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR và AVANCE III HD 500 (tần số 500 MHz cho $^1\text{H}$ và 125 MHz cho $^{13}\text{C}$), nội chuẩn TMS, dung môi $\text{CD}_3\text{OD}$. Các kỹ thuật bao gồm phổ 1D ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT-90, DEPT-135) và phổ 2D (HSQC, HMBC, $^1\text{H-}^1\text{H}\ \text{COSY}$, NOESY, ROESY).
- Năng suất quay cực ($[\alpha]_D$): Đo trên phân cực kế Jasco P-2000 polarimeter.
- Phổ lưỡng sắc tròn (CD): Ghi trên máy quang phổ Chirascan (Applied Photophysics, Anh) để xác định cấu hình tuyệt đối.
Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro
- Quy chuẩn: Thử nghiệm độ độc tế bào in vitro theo phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB) của Monks (1991), được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) công nhận. Thí nghiệm tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Quy trình:
- Tế bào ung thư người được nuôi cấy đơn lớp trong môi trường DMEM bổ sung 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1,0 mM sodium pyruvate và 10% huyết thanh bò thai (FBS) ở $37^\circ\text{C}$, $5%\ \text{CO}_2$.
- Tế bào được cấy vào khay 96 giếng ($180\ \mu\text{L/giếng}$) và nuôi 3–5 ngày.
- Chất thử được hòa tan trong DMSO 1%, thử sàng lọc sơ bộ ở nồng độ $100\ \mu\text{g/mL}$ (hoặc $100\ \mu\text{M}$). Các chất có khả năng ức chế $> 50%$ sự phát triển tế bào được thử tiếp ở các nồng độ pha loãng bậc 5 ($100;\ 20;\ 4;\ 0,8;\ 0,16\ \mu\text{g/mL}$) để xác định giá trị $\text{IC}_{50}$.
- Cố định tế bào bằng trichloroacetic acid (TCA), nhuộm bằng dung dịch SRB trong 1 giờ ở $37^\circ\text{C}$, rửa bằng acid acetic 5%, hòa tan protein gắn phẩm nhuộm bằng 10 mM unbuffered Tris base. Đọc mật độ quang (OD) ở bước sóng 515 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad).
- Đối chứng: Đối chứng dương là Ellipticine (thử ở các nồng độ 10; 2; 0,4; $0,08\ \mu\text{g/mL}$, $\text{IC}_{50}$ ổn định ở mức $0,51\ \mu\text{g/mL}$); đối chứng âm là DMSO 1%.
- Tính toán: Giá trị $\text{IC}{50}$ được xử lý bằng phần mềm TableCurve. Hợp chất tinh khiết có $\text{IC}{50} \le 100\ \mu\text{M}$ được coi là có hoạt tính gây độc tế bào.
Nội dung chính theo từng chương
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Chương I trình bày chi tiết về đặc điểm thực vật học, vùng phân bố, kinh nghiệm sử dụng dân gian, các công trình nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của hai đối tượng nghiên cứu:
- Cây đại bi (Blumea balsamifera): Cây thân thảo dạng bụi thấp (cao 1–3 m), toàn cây phủ lông và có mùi thơm long não/băng phiến. Phân bố rộng rãi tại vùng trung du, đồi núi Việt Nam (Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Lai Châu, Lâm Đồng...). Tác giả tổng hợp 84 hợp chất gồm 42 flavonoid (B1–B42), 40 terpene (B43–B84: gồm monoterpene, sesquiterpene 2 vòng, sesquiterpene 3 vòng, diterpene) và các dẫn xuất khác đã công bố trên thế giới.
- Cây ngải cứu (Artemisia vulgaris): Cây thảo sống lâu năm (cao 0,5–1,5 m), lá xẻ lông chim, mặt dưới có lông trắng xám. Tác giả tổng hợp 85 hợp chất gồm 55 terpene (V1–V55: monoterpene 1 vòng, 2 vòng, mạch hở; sesquiterpene 1–3 vòng; triterpene) và 30 dẫn xuất flavonoid (V56–V85) từ các tài liệu tham khảo.
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chương II mô tả chi tiết địa điểm thu hái mẫu thực vật, quy trình làm tiêu bản đối chứng, các loại dung môi, hóa chất và trang thiết bị thực nghiệm.
- Trình bày sơ đồ phân đoạn tổng thể từ dịch chiết thô methanol, chiết phân bố lỏng - lỏng bằng n-hexane, dichloromethane và nước.
- Mô tả quy trình phân lập chi tiết phân đoạn dịch nước W2 của cây đại bi bằng hệ thống cột Diaion HP-20, RP-18, Silica gel pha thường và Sephadex LH-20 để thu nhận các hợp chất BB1 đến BB9.
- Mô tả quy trình phân lập các hợp chất AV1 đến AV10 từ mẫu ngải cứu.
- Trình bày chi tiết thông số vật lý ($[\alpha]_D$), dữ kiện phổ ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC, HMBC, COSY, NOESY, HR-ESI-MS, CD) và giao thức thử nghiệm in vitro độc tế bào ung thư (dòng tế bào HepG2, SK-Mel-2, LNCaP, MCF-7, AGS, HeLa, KB, NCI-H187).
CHƯƠNG III: THẢO LUẬN KẾT QUẢ
Chương III tập trung phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được và thảo luận về kết quả đánh giá hoạt tính sinh học.
1. Các hợp chất phân lập từ cây đại bi (Blumea balsamifera)
Từ phân đoạn dịch chiết của cây đại bi, tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của 9 hợp chất (ký hiệu từ BB1 đến BB9), trong đó có 3 hợp chất mới:
| Ký hiệu |
Tên hợp chất |
Loại hợp chất / Tính mới |
Cấu trúc / Đặc điểm nhận dạng |
| BB1 |
Balsamiferoside A |
Hợp chất mới |
Glucoside chứa khung sesquiterpene, xác định bởi HR-ESI-MS, 1D/2D NMR |
| BB2 |
Balsamiferoside B |
Hợp chất mới |
Glucoside mới, xác định tương tác HMBC, COSY, NOESY |
| BB3 |
Balsamiferine K |
Hợp chất mới |
Sesquiterpene mới, xác định bằng HR-ESI-MS và tương tác 2D NMR |
| BB4 |
Isohemiphloin |
Hợp chất đã biết |
Dẫn xuất flavonoid C-glycoside |
| BB5 |
(-)-Angelicoidenol 2-O-$\beta$-D-glucopyranoside |
Hợp chất đã biết |
Monoterpene glucoside |
| BB6 |
(1S,2R,4S)-borneol $\beta$-D-glucopyranoside |
Hợp chất đã biết |
Dẫn xuất borneol glycoside |
| BB7 |
1,4,7-trihydroxyeudesmane |
Hợp chất đã biết |
Sesquiterpene khung eudesmane triol |
| BB8 |
6,15-epoxy-1,4-dihydroxyeudesmane |
Hợp chất đã biết |
Sesquiterpene khung epoxy eudesmane |
| BB9 |
Blumeanen J |
Hợp chất đã biết |
Dẫn xuất sesquiterpenoid |
Quá trình giải cấu trúc các hợp chất mới BB1, BB2 và BB3 được tác giả lập luận chi tiết dựa trên việc phân tích tín hiệu phổ proton ($^1\text{H}$), phổ carbon ($^{13}\text{C}$), phổ tương tác dị hạt nhân một liên kết (HSQC), tương tác qua nhiều liên kết (HMBC), phổ tương tác spin proton ($^1\text{H-}^1\text{H}\ \text{COSY}$) và tương tác không gian (NOESY), so sánh với các hợp chất tương đồng trong tài liệu tham khảo.
2. Các hợp chất phân lập từ cây ngải cứu (Artemisia vulgaris)
Từ mẫu ngải cứu, 10 hợp chất (ký hiệu từ AV1 đến AV10) đã được phân lập và xác định cấu trúc, bao gồm 2 hợp chất mới:
| Ký hiệu |
Tên hợp chất |
Loại hợp chất / Tính mới |
Cấu trúc / Đặc điểm nhận dạng |
| AV1 |
Vulgarolide A |
Hợp chất mới |
Sesquiterpene lactone mới, xác định bởi HR-ESI-MS, 2D NMR và phổ CD |
| AV2 |
Vulgarolide B |
Hợp chất mới |
Hợp chất mới đồng phân/dẫn xuất của AV1, xác định cấu hình bằng CD |
| AV3 |
Dihydrosyringin |
Hợp chất đã biết |
Dẫn xuất phenylpropanoid glucoside |
| AV4 |
Coniferin |
Hợp chất đã biết |
Glucoside của coniferyl alcohol |
| AV5 |
Turpenionoside A |
Hợp chất đã biết |
Dẫn xuất glycoside |
| AV6 |
(6S,9R)-roseoside |
Hợp chất đã biết |
Hợp chất ionol glycoside |
| AV7 |
Corchoionoside C |
Hợp chất đã biết |
Dẫn xuất megastigmane glycoside |
| AV8 |
Pinoresinol glucoside |
Hợp chất đã biết |
Hợp chất lignan glycoside |
| AV9 |
Eucommin A |
Hợp chất đã biết |
Hợp chất lignan diglucoside |
| AV10 |
Syringaresinol glucoside |
Hợp chất đã biết |
Hợp chất furofuran lignan glucoside |
Cấu hình tuyệt đối của hai hợp chất mới AV1 (Vulgarolide A) và AV2 (Vulgarolide B) được xác định bằng cách kết hợp phổ tương tác không gian NOESY với phổ lưỡng sắc tròn (CD) và so sánh dữ liệu thực nghiệm với tính toán lý thuyết hoặc các chất mẫu chuẩn.
3. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Các hợp chất phân lập sạch từ hai loài cây được sàng lọc ở nồng độ $100\ \mu\text{M}$ trên các dòng tế bào ung thư người in vitro (như ung thư gan HepG2, ung thư da SK-Mel-2, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư vú MCF-7, ung thư khoang miệng KB, ung thư phổi NCI-H187...). Đối với các hợp chất thể hiện tỷ lệ ức chế $> 50%$, giá trị $\text{IC}_{50}$ được xác định cụ thể thông qua đường cong liều - đáp ứng. Kết quả chỉ ra một số hợp chất terpene và dẫn xuất glycoside có khả năng ức chế sinh trưởng của các dòng tế bào ung thư thử nghiệm.
Kết quả và những đóng góp mới
-
Phân lập và xác định cấu trúc 19 hợp chất tinh khiết:
- Từ cây đại bi (Blumea balsamifera): Phân lập và xác định cấu trúc của 9 hợp chất (BB1–BB9).
- Từ cây ngải cứu (Artemisia vulgaris): Phân lập và xác định cấu trúc của 10 hợp chất (AV1–AV10).
-
Phát hiện 5 hợp chất có cấu trúc mới:
- 3 hợp chất mới từ cây đại bi: Balsamiferoside A (BB1), Balsamiferoside B (BB2) và Balsamiferine K (BB3).
- 2 hợp chất mới từ cây ngải cứu: Vulgarolide A (AV1) và Vulgarolide B (AV2).
- Cấu trúc hóa học và cấu hình lập thể của các hợp chất mới này được chứng minh đầy đủ thông qua hệ thống dữ liệu phổ hiện đại ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, HSQC, HMBC, COSY, NOESY, HR-ESI-MS và CD).
-
Cung cấp dữ liệu hoạt tính sinh học:
- Luận án cung cấp dữ liệu định lượng về hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất phân lập trên các dòng tế bào ung thư người chuẩn hóa.
- Kết quả góp phần giải thích cơ sở khoa học cho việc ứng dụng cây đại bi và ngải cứu trong y học dân gian, đồng thời định hướng khai thác các hợp chất chìa khóa (key markers) phục vụ kiểm định chất lượng dược liệu và thực phẩm chức năng theo các đề tài VAST.05/16-18.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế:
- Mẫu thực vật mới chỉ được thu hái tại một địa điểm và một thời điểm cụ thể (Vĩnh Phúc vào tháng 5/2016 cho đại bi; Bắc Từ Liêm - Hà Nội vào tháng 3/2016 cho ngải cứu), chưa đánh giá sự biến động hàm lượng hoạt chất theo mùa và theo các vùng sinh thái khác nhau.
- Thử nghiệm hoạt tính sinh học mới dừng lại ở mức độ in vitro đánh giá độc tính tế bào tổng quát bằng phương pháp nhuộm SRB, chưa đi sâu khảo sát cơ chế phân tử (apoptosis, chu kỳ tế bào, ức chế enzyme đích) hoặc thử nghiệm in vivo.
- Hướng nghiên cứu tiếp:
- Tiếp tục nghiên cứu mở rộng các phân đoạn chiết khác của hai loài cây trên để tìm kiếm thêm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính cao.
- Tiến hành các thử nghiệm chuyên sâu về cơ chế tác động kháng ung thư ở mức độ sinh học phân tử đối với các hợp chất mới (BB1–BB3, AV1–AV2).
- Xây dựng quy trình định lượng và thiết lập chất chuẩn đối chiếu phục vụ kiểm tra chất lượng dược liệu và sản phẩm bào chế từ đại bi và ngải cứu.
Giá trị tham khảo
- Đối với nghiên cứu sinh và giảng viên chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa hợp chất thiên nhiên và Dược học: Luận án là tài liệu tham khảo trong việc áp dụng quy trình chiết xuất phân bố, sắc ký cột nhiều giai đoạn và phân tích các phổ cộng hưởng từ 2D (HMBC, HSQC, COSY, NOESY) và phổ CD để xác định cấu trúc, lập thể của các hợp chất sesquiterpene và glycoside phức tạp.
- Đối với các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất dược phẩm/thực phẩm chức năng: Cung cấp dữ liệu khoa học về các nhóm hoạt chất đặc trưng phục vụ công tác chuẩn hóa dược liệu, xây dựng phương pháp vân tay hóa học (fingerprint) và phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị từ thảo dược họ Cúc.
Câu hỏi thường gặp
1. Luận án đã phát hiện được bao nhiêu hợp chất mới và tên gọi của chúng là gì?
Luận án đã phát hiện được 5 hợp chất mới:
- 3 hợp chất mới từ cây đại bi (Blumea balsamifera): Balsamiferoside A (BB1), Balsamiferoside B (BB2) và Balsamiferine K (BB3).
- 2 hợp chất mới từ cây ngải cứu (Artemisia vulgaris): Vulgarolide A (AV1) và Vulgarolide B (AV2).
2. Hai mẫu thực vật trong luận án được thu thập ở đâu và ai là người giám định tên khoa học?
- Mẫu cây đại bi (B. balsamifera) được thu hái tại tỉnh Vĩnh Phúc vào tháng 5 năm 2016 (tiêu bản TPCN-22).
- Mẫu cây ngải cứu (A. vulgaris) được thu hái tại quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội vào tháng 3 năm 2016 (tiêu bản TPCN-07).
- Cả hai mẫu đều được TS. Nguyễn Thế Cường thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học.
3. Phương pháp nào được sử dụng để đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro trong luận án?
Luận án sử dụng phương pháp thử nghiệm độ độc tế bào chuẩn in vitro của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) do Monks (1991) xây dựng, sử dụng chất nhuộm protein Sulforhodamine B (SRB), đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 515 nm trên máy ELISA Plate Reader. Chất đối chứng dương là Ellipticine và đối chứng âm là DMSO 1%.
4. Phổ lưỡng sắc tròn (CD) được sử dụng để giải quyết vấn đề gì trong luận án?
Phổ lưỡng sắc tròn (CD - Circular Dichroism) được đo trên máy Chirascan (Applied Photophysics) nhằm xác định cấu hình tuyệt đối (stereochemistry) của các hợp chất sesquiterpene lactone mới phân lập từ cây ngải cứu (hợp chất AV1 và AV2).
Kết luận
Luận án tiến sĩ của Lê Thị Thúy Hằng đã nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây đại bi (Blumea balsamifera) và ngải cứu (Artemisia vulgaris) thuộc họ Cúc ở Việt Nam. Công trình đã phân lập và xác định cấu trúc 19 hợp chất tinh khiết, trong đó có 5 hợp chất mới (Balsamiferoside A, Balsamiferoside B, Balsamiferine K, Vulgarolide A và Vulgarolide B). Các kết quả thử nghiệm sinh học in vitro đã cung cấp dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập, tạo cơ sở khoa học cho việc sử dụng và kiểm định chất lượng hai loài dược liệu này.
