Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây me rừng (Phyllanthus emblica L., tên gọi khác: chùm ruột núi, dư cam tử, ngưu cam tử, du cam tử) là loài thực vật thuộc chi Phyllanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Trong y học cổ truyền Việt Nam và các nước châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc, hầu hết các bộ phận của cây me rừng bao gồm quả, lá, thân và rễ đều được sử dụng làm dược liệu điều trị nhiều bệnh lý như cảm sốt, viêm ruột, tiêu chảy, đau họng, bệnh gan, thận, cao huyết áp và đái tháo đường.

Mặc dù chi Phyllanthus nói chung và loài Phyllanthus emblica nói riêng đã được nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới khảo sát về hoạt tính sinh học và thành phần hóa thực vật, tuy nhiên các công bố khoa học về thành phần hóa học của cây me rừng phân bố tại Việt Nam vào thời điểm thực hiện đề tài còn rất hạn chế. Xuất phát từ thực tiễn trên, khóa luận tập trung nghiên cứu thành phần hóa học của mẫu cây me rừng thu hái trong nước nhằm bổ sung dữ liệu khoa học về các hợp chất tự nhiên và hỗ trợ sáng tỏ cơ sở dược lý của nguồn thảo dược này.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể gồm:

  1. Thu thập, xử lý nguyên liệu và điều chế các loại cao chiết phân đoạn từ lá và rễ cây me rừng (Phyllanthus emblica L.).
  2. Ứng dụng các kỹ thuật sắc ký để phân lập và tinh chế các hợp chất hữu cơ sạch từ cao ethyl acetate của lá và cao hexane của rễ.
  3. Sử dụng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại (NMR, MS) để giải đoán và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lá và rễ cây me rừng (Phyllanthus emblica L.), được TS. Phạm Văn Ngọt giám định danh pháp khoa học.
  • Phạm vi không gian: Mẫu thực vật được thu hái tại tỉnh Bình Thuận, Việt Nam.
  • Phạm vi thời gian: Thu hái mẫu vào tháng 5/2014; các nội dung chiết tách, phổ nghiệm và hoàn thành khóa luận thực hiện đến tháng 5/2016.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và đối tượng hóa học

Nghiên cứu dựa trên cơ sở lý thuyết hóa học các hợp chất tự nhiên, tập trung vào việc chiết xuất, phân lập và nhận danh các chất chuyển hóa thứ cấp thuộc các nhóm hợp chất tự nhiên đã biết trong chi Phyllanthus (như tannin, flavonoid, sterol, triterpenoid, norbisabolane). Việc xác định cấu trúc phân tử được xây dựng dựa trên nguyên lý giải đoán phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D, 2D và khối phổ phân giải cao, kết hợp so sánh với các dữ liệu phổ công bố trong các tài liệu tham khảo chuyên ngành.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quy trình thực nghiệm được triển khai đồng bộ qua các giai đoạn kỹ thuật:

  • Phương pháp chiết xuất: Mẫu bột khô của lá và rễ được ngâm dầm kiệt trong dung môi ethanol 96°, thu dịch chiết và cô quay đuổi dung môi dưới áp suất giảm để thu hồi cao ethanol tổng. Sau đó tiến hành chiết lỏng - lỏng phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần (hexane, ethyl acetate) để thu được các cao phân đoạn tương ứng.
  • Phương pháp phân lập và tinh chế: Sử dụng kỹ thuật sắc ký cột cổ điển (SKC) với chất hấp phụ là silica gel 60 (kích thước hạt 0,04–0,06 mm, Merck và Ấn Độ) cho pha thường, silica gel RP-18 (Merck) cho sắc ký cột pha đảo. Quá trình rửa giải được theo dõi liên tục bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) trên bản mỏng nhôm tráng sẵn Kieselgel 60F₂₅₄ và bản mỏng pha đảo RP-18 (Merck). Vết sắc ký được phát hiện dưới đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm, 365 nm và phun hiện hình bằng thuốc thử dung dịch H₂SO₄ 20% trong nhiệt độ gia nhiệt.
  • Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (¹H-NMR ở tần số 500 MHz, ¹³C-NMR ở tần số 125 MHz, DEPT) và phổ hai chiều (COSY, HSQC, HMBC) được đo trên thiết bị Bruker tại Phòng thí nghiệm Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
    • Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) được phân tích tại Phòng thí nghiệm Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. Hồ Chí Minh.
    • Tra cứu và kiểm tra tính mới của cấu trúc hóa học trên hệ thống cơ sở dữ liệu hóa học SciFinder (thực hiện tại Đại học Quốc lập Trung ương / Jhong-Li, Đài Loan).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương này hệ thống hóa các tư liệu khoa học về loài Phyllanthus emblica L.:

  • Đặc điểm thực vật học: Cây thân gỗ nhỏ, cao khoảng 3 m, phân nhiều cành nhỏ mềm, có lông. Lá nhỏ mọc so le xếp xít nhau thành hai dãy dọc cành nhỏ tạo hình dạng giống lá kép lông chim. Cụm hoa xim co đơn tính cùng gốc mọc ở nách lá dưới cành; hoa nở từ tháng 3 đến tháng 11 hàng năm. Quả hình cầu, hạt ba cạnh màu hồng nhạt. Cây phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á (Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Malaysia) và mọc hoang tại các vùng đồi trọc, rừng núi Tây Bắc, Việt Bắc, miền Trung Việt Nam.
  • Dược tính và công dụng y học: Tổng thuật các nghiên cứu dược lý thực nghiệm chứng minh chiết xuất me rừng có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn (chống Bacillus subtilis, Salmonella typhi, Candida albicans), kháng virus (ức chế HSV-1 và HSV-2 bởi hợp chất 1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose với giá trị $\text{IC}_{50} = 31{,}7\ \mu\text{M}$), độc tế bào trên dòng ung thư vú và ung thư phổi (do geraniin và isocorilagin thể hiện), bảo vệ gan trước tổn thương do ethanol trên mô hình chuột thí nghiệm (liều 75 mg/kg/ngày) và cải thiện nồng độ tinh dịch bị tổn thương bởi valproic acid.
  • Thành phần hóa học đã công bố: Tổng kết 70 hợp chất đã được phân lập từ các bộ phận khác nhau của cây me rừng trên thế giới trước năm 2014, gồm các nhóm chính: ellagitannin (corilagin, geraniin, isocorilagin, chebulagic acid, phyllanthunin, phyllanemblinin A–F), flavonoid (quercetin, kaempferol, rutin), hợp chất phenol đơn giản (gallic acid, ethyl gallate, ellagic acid), dẫn xuất norbisabolane (phyllaemblic acid và các ester) và các hợp chất sterol/triterpenoid.

Chương 2: Thực nghiệm

Trình bày chi tiết số liệu xử lý mẫu, điều chế cao chiết và các bước tách sắc ký:

  • Nguyên liệu ban đầu: 7,2 kg bột lá khô và 9,4 kg bột rễ khô của cây me rừng thu hái tại Bình Thuận.
  • Điều chế cao chiết:
    • Từ 7,2 kg bột lá khô, chiết ngâm dầm với ethanol 96° thu được 285,5 g cao ethanol tổng; sau khi chiết lỏng - lỏng phân bố thu được cao ethyl acetate của lá có khối lượng 143,1 g.
    • Từ 9,4 kg bột rễ khô, chiết bằng ethanol 96° thu được 252,4 g cao ethanol tổng; chiết lỏng - lỏng thu được cao hexane rễ và cao ethyl acetate rễ.
Nguyên liệu Khối lượng bột khô (kg) Cao ethanol tổng (g) Phân đoạn chiết tiếp theo được khảo sát
Lá 7,2 285,5 Cao ethyl acetate lá (143,1 g)
Rễ 9,4 252,4 Cao hexane rễ (trích 1,1 g để sắc ký)
  • Quy trình sắc ký cô lập:
    • Phân lập từ cao ethyl acetate lá: 143,1 g cao được sắc ký cột silica gel thường với hệ dung môi Hexane:Ethyl acetate (tỉ lệ tăng dần đến 100% EA) và Ethyl acetate:Methanol (5% đến 30% MeOH), thu được 5 phân đoạn lớn (EA1 đến EA5). Phân đoạn EA3 (22,25 g) tiếp tục qua cột silica gel với hệ Chloroform:Methanol (0–30% MeOH) tách thành 7 phân đoạn nhỏ (EA3.1 đến EA3.7). Phân đoạn EA3.3 (0,85 g) được sắc ký cột silica gel giải ly bằng Chloroform:Methanol (9:1) thu 5 phân đoạn nhỏ (EA3.3.1 đến EA3.3.5). Phân đoạn EA3.3.3 (22,3 mg) qua cột silica gel lặp lại nhiều lần với hệ Chloroform:Methanol (87:13) thu được 15,0 mg hợp chất tinh khiết dạng dầu màu vàng, ký hiệu PEH1.
    • Phân lập từ cao hexane rễ: Trích 1,1 g cao hexane rễ sắc ký cột silica gel pha thường với hệ Hexane:Dichloromethane (tăng dần 0–100% DCM) và Dichloromethane:Methanol (0–30% MeOH), thu được 9 phân đoạn (RH1 đến RH9). Phân đoạn RH6 (158,7 mg) được sắc ký cột với hệ Hexane:Dichloromethane thu 5 phân đoạn nhỏ (RH6.1 đến RH6.5). Phân đoạn RH6.4 tiếp tục qua sắc ký cột silica gel thường (DCM:MeOH 95:5) kết hợp sắc ký cột pha đảo RP-18 (Acetone:Methanol 2:1) thu được 8,0 mg chất rắn màu trắng, ký hiệu PEAC1.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương này tập trung biện luận phổ cấu trúc của 2 mẫu hợp chất cô lập được:

Biện luận cấu trúc hợp chất PEH1

  • Mẫu PEH1 (15,0 mg) là chất lỏng dạng dầu màu vàng, cho 1 vết duy nhất trên SKLM (hệ dung môi $\text{CHCl}_3:\text{MeOH} = 87:13$), hiện màu đen với thuốc thử $\text{H}_2\text{SO}_4$ 20%.
  • Phổ ¹H-NMR xuất hiện hai cặp tín hiệu đặc trưng của proton anomer ở $\delta_{\text{H}}\ 4{,}71\ \text{ppm}$ ($d,\ J = 3{,}5\ \text{Hz}$, H-1a) và $\delta_{\text{H}}\ 4{,}20\ \text{ppm}$ ($d,\ J = 8{,}0\ \text{Hz}$, H-1b). Tương quan HSQC chỉ ra hai proton này liên kết trực tiếp với hai carbon anomer tương ứng tại $\delta_{\text{C}}\ 101{,}4\ \text{ppm}$ (C-1a) và $\delta_{\text{C}}\ 105{,}7\ \text{ppm}$ (C-1b).
  • Tương quan HMBC cho thấy proton nhóm methoxy $\delta_{\text{H}}\ 3{,}44\ \text{ppm}$ tương quan với C-1a ($\delta_{\text{C}}\ 101{,}4\ \text{ppm}$); ngược lại proton H-1b ($\delta_{\text{H}}\ 4{,}20\ \text{ppm}$) tương quan với carbon methoxy tại $\delta_{\text{C}}\ 57{,}3\ \text{ppm}$, chứng minh sự hiện diện của nhóm thế $-\text{OCH}_3$ tại vị trí C-1 của cả hai phân tử đường.
  • Hằng số ghép spin $J_{\text{H1-H2}} = 3{,}5\ \text{Hz}$ xác định đơn vị đường thứ nhất có cấu hình $\alpha$, trong khi $J_{\text{H1-H2}} = 8{,}0\ \text{Hz}$ ở đơn vị đường thứ hai xác định cấu hình $\beta$. Giá trị ghép lớn của các proton trung gian ($J \approx 9{,}0 - 10{,}0\ \text{Hz}$) chứng minh các nhóm thế đều ở vị trí xích đạo (equatorial), phù hợp với khung cấu trúc D-glucopyranoside.
  • Kết luận: PEH1 là hỗn hợp của hai hợp chất đồng phân gồm 1-O-methyl-$\alpha$-D-glucopyranoside (PEH1-a) và 1-O-methyl-$\beta$-D-glucopyranoside (PEH1-b).

Biện luận cấu trúc hợp chất PEAC1

  • Mẫu PEAC1 (8,0 mg) tồn tại dưới dạng tinh thể rắn màu trắng, SKLM cho 1 vết duy nhất ($\text{DCM}:\text{MeOH} = 95:5$), hiện màu nâu với thuốc thử $\text{H}_2\text{SO}_4$ 20%.
  • Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS cho pic ion phân tử giả dạng âm $[\text{M}-\text{H}]^-$ tại $m/z = 471{,}3472$, hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử $\text{C}{30}\text{H}{48}\text{O}4$ (khối lượng phân tử tính toán lý thuyết cho $[\text{C}{30}\text{H}_{47}\text{O}_4]^-$ là $471{,}3474$).
  • Phổ ¹³C-NMR và DEPT thể hiện đủ tín hiệu của 30 nguyên tử carbon, bao gồm: 6 nhóm methyl ($-\text{CH}3$), 11 nhóm methylen ($-\text{CH}2-$), 3 nhóm methin ($-\text{CH}-$), 6 carbon bậc bốn, 2 carbon olefin thuộc nhóm vinyl/olefin tận cùng ($=\text{CH}2$ ở $\delta{\text{C}}\ 115{,}0\ \text{ppm}$ và $=\text{C}<$ ở $\delta{\text{C}}\ 151{,}0\ \text{ppm}$), cùng 2 nhóm carbonyl acid ($-\text{COOH}$) tại $\delta{\text{C}}\ 182{,}5\ \text{ppm}$ và $\delta_{\text{C}}\ 182{,}6\ \text{ppm}$.
  • Phổ không xuất hiện tín hiệu hydroxyl ($-\text{OH}$) hoặc carbonyl ketone ($>\text{C}=\text{O}$) thường gặp tại vị trí C-3 của khung triterpenoid năm vòng thông thường; thay vào đó, các tương quan HMBC và COSY chứng minh vòng A của khung sườn friedelan đã bị mở liên kết (seco-friedelane) giữa C-3 và C-4 tạo thành một liên kết đôi ngoại vòng tại C-4(23) và một nhóm carboxylic acid tại C-3 ($-\text{COOH}$). Đồng thời, nhóm methyl C-29 được oxy hóa thành nhóm carboxylic acid thứ hai.
  • So sánh tương quan dữ liệu phổ với các hợp chất tương đồng đã công bố (3,4-secofriedelan-3,28-dioic acid và 3-oxofriedelan-29-oic acid), cấu trúc hóa học của PEAC1 được xác định là 3,4-secofriedel-4(23)-en-3,29-dioic acid. Tra cứu SciFinder ngày 16/5/2016 xác nhận đây là một hợp chất tự nhiên mới chưa từng được công bố trước đó.

Chương 4: Kết luận và đề xuất

  • Kết luận: Đã xử lý nguyên liệu thực vật, điều chế các cao chiết và cô lập thành công 2 hợp chất hóa học từ lá và rễ cây me rừng Việt Nam: hỗn hợp 1-O-methyl-$\alpha$-D-glucopyranoside và 1-O-methyl-$\beta$-D-glucopyranoside (từ cao ethyl acetate lá) và 1 hợp chất triterpenoid seco mới là 3,4-secofriedel-4(23)-en-3,29-dioic acid (từ cao hexane rễ).
  • Đề xuất: Mở rộng nghiên cứu chiết tách đối với cao butanol, khảo sát sâu hơn các bộ phận khác (thân, vỏ) và thực hiện các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất cô lập được.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

Công trình đã chiết tách và xác định cấu trúc cụ thể cho các hợp chất từ cây me rừng (Phyllanthus emblica L.) với các số liệu thực nghiệm được tổng hợp trong bảng sau:

Tên ký hiệu Khối lượng thu nhận Trạng thái cảm quan Phân đoạn nguồn Cấu trúc hóa học xác định Công thức phân tử / Khối phổ
PEH1 15,0 mg Dạng dầu, màu vàng Phân đoạn EA3.3.3 (Cao ethyl acetate lá) Hỗn hợp 1-O-methyl-$\alpha$-D-glucopyranoside và 1-O-methyl-$\beta$-D-glucopyranoside Xác định qua hệ phổ 1D và 2D NMR
PEAC1 8,0 mg Chất rắn tinh thể, màu trắng Phân đoạn RH6.4 (Cao hexane rễ) 3,4-secofriedel-4(23)-en-3,29-dioic acid $\text{C}{30}\text{H}{48}\text{O}_4$ (HR-ESI-MS: $[\text{M}-\text{H}]^-\ m/z\ 471{,}3472$)

Đóng góp khoa học của đề tài

  1. Phát hiện hợp chất mới: Lần đầu tiên cô lập và xác định cấu trúc của hợp chất triterpene khung seco-friedelan mới trong tự nhiên là 3,4-secofriedel-4(23)-en-3,29-dioic acid từ rễ cây me rừng, được xác nhận tính mới thông qua cơ sở dữ liệu quốc tế SciFinder.
  2. Đóng góp dữ liệu phổ nghiệm: Cung cấp đầy đủ tập dữ liệu phổ nghiệm cộng hưởng từ hạt nhân 1D (¹H, ¹³C, DEPT), 2D (COSY, HSQC, HMBC) và khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS của các chất phân lập từ loài Phyllanthus emblica L. tại vùng sinh thái Bình Thuận, làm phong phú thêm cơ sở dữ liệu hóa thực vật của hệ thực vật Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Nghiên cứu chỉ mới tập trung khảo sát thành phần hóa học trên 2 phân đoạn cụ thể là phân đoạn cao ethyl acetate của lá và phân đoạn cao hexane của rễ; các phân đoạn khác (như cao butanol, phần cặn còn lại) và bộ phận thân cây chưa được triển khai cô lập chi tiết.
  • Do giới hạn về thời gian và lượng chất phân lập, nghiên cứu chưa tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học (chống oxy hóa, gây độc tế bào, kháng khuẩn) trên các hợp chất tinh chế được.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Tiếp tục mở rộng khảo sát thành phần hóa học trên các cao phân đoạn có độ phân cực cao hơn (như cao butanol) và các bộ phận khác của cây me rừng.
  • Triển khai thử nghiệm sàng lọc và đánh giá hoạt tính sinh học chuyên sâu đối với hợp chất mới 3,4-secofriedel-4(23)-en-3,29-dioic acid để định hướng ứng dụng dược liệu.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các ngành Hóa học (chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa hợp chất thiên nhiên), Dược học và Công nghệ sinh học:

  • Tham khảo phương pháp luận thực nghiệm: Cung cấp quy trình chi tiết về việc kết hợp linh hoạt các hệ dung môi giải ly trong sắc ký cột pha thường và sắc ký cột pha đảo RP-18 để tách các phân đoạn phân cực phức tạp từ thực vật.
  • Tham khảo giải đoán phổ cấu trúc: Là tư liệu chuẩn xác cho việc phân tích, biện luận phổ 2D-NMR (đặc biệt là tương quan liên kết HMBC, COSY) trong việc xác định hiện tượng mở vòng (seco) trên khung sườn triterpenoid và xác định cấu hình anomer của các dẫn xuất glycoside.

Câu hỏi thường gặp

1. Nguồn mẫu thực vật sử dụng trong khóa luận được thu hái ở đâu và định danh bởi ai?

Mẫu thực vật gồm lá, thân và rễ của cây me rừng (Phyllanthus emblica L., họ Euphorbiaceae) được thu hái tại tỉnh Bình Thuận vào tháng 5/2014 và được TS. Phạm Văn Ngọt giám định danh pháp thực vật.

2. Hai hợp chất sạch cô lập được từ các phân đoạn nào và có cấu trúc là gì?

  • Hợp chất PEH1 (15,0 mg, dạng dầu màu vàng) được cô lập từ cao ethyl acetate của lá, xác định là hỗn hợp của 1-O-methyl-$\alpha$-D-glucopyranoside và 1-O-methyl-$\beta$-D-glucopyranoside.
  • Hợp chất PEAC1 (8,0 mg, tinh thể màu trắng) được cô lập từ cao hexane của rễ, xác định là 3,4-secofriedel-4(23)-en-3,29-dioic acid.

3. Căn cứ khoa học nào khẳng định PEAC1 là một hợp chất mới trong tự nhiên?

Cấu trúc của PEAC1 được xác lập chắc chắn thông qua công thức phân tử $\text{C}{30}\text{H}{48}\text{O}_4$ xác định bằng phổ HR-ESI-MS ($m/z = 471{,}3472\ [\text{M}-\text{H}]^-$), hệ phổ NMR chứng minh khung 3,4-seco-friedelane có 2 nhóm $-\text{COOH}$ (tại C-3 và C-29) cùng nối đôi tận cùng C-4(23), và đã được tra cứu đối chiếu trên cơ sở dữ liệu cấu trúc hóa học SciFinder vào ngày 16/5/2016 xác nhận chưa từng có công bố trước đó.

4. Thiết bị và địa điểm đo đạc các dữ liệu phổ nghiệm trong khóa luận được thực hiện ở đâu?

  • Phổ NMR (¹H-NMR 500 MHz, ¹³C-NMR 125 MHz, DEPT, COSY, HSQC, HMBC) được đo tại Phòng thí nghiệm Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQG TP. Hồ Chí Minh).
  • Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS được đo tại Phòng thí nghiệm Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. Hồ Chí Minh.
  • Tra cứu SciFinder được thực hiện tại Đại học Quốc lập Trung ương (Jhong-Li, Đài Loan).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Long Hải đã hoàn thành toàn diện việc khảo sát thành phần hóa thực vật trên mẫu lá và rễ cây me rừng (Phyllanthus emblica L.) thu hái tại Bình Thuận bằng các phương pháp chiết xuất, sắc ký phân lập và phổ nghiệm hiện đại. Đề tài đã phân lập thành công hỗn hợp đồng phân methyl glucopyranoside (PEH1) từ lá và phát hiện một triterpenoid khung sườn seco-friedelane hoàn toàn mới trong tự nhiên là 3,4-secofriedel-4(23)-en-3,29-dioic acid (PEAC1) từ rễ. Công trình đóng góp những dẫn liệu thực nghiệm chính xác và có giá trị khoa học vào kho tàng nghiên cứu hóa học các hợp chất tự nhiên từ nguồn dược liệu Việt Nam.