Tổng quan luận án

Luận án Tiến sĩ Hóa học với đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lá Schefflera sessiliflora De P. thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae) ở Việt Nam” được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Nguyễn Tấn Phát vào năm 2016 tại Thành phố Hồ Chí Minh.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Họ Ngũ gia bì (Araliaceae) bao gồm nhiều đại diện có giá trị dược liệu cao, tiêu biểu như sâm Triều Tiên (Panax ginseng C.A. Mey.), sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) và ngũ gia bì chân chim (Schefflera heptaphylla (L.) Frodin). Các loài thuộc họ này thường được ghi nhận có các tác dụng bồi bổ cơ thể, tăng lực, hạn chế lão hóa và hỗ trợ phòng chống ung thư.

Loài Schefflera sessiliflora De P. (tên thông thường là cây chân chim không cuống quả) được phát hiện mới tại Việt Nam vào năm 2004. Mặc dù các nghiên cứu sinh học ban đầu cho thấy loài này có một số tác dụng dược lý triển vọng như tăng lực, chống chịu stress nóng, chống oxy hóa và tác dụng kiểu androgen, dữ liệu khoa học về thành phần hóa học chi tiết của lá Schefflera sessiliflora De P. trên thế giới và tại Việt Nam chưa được nghiên cứu toàn diện. Do đó, việc nghiên cứu có hệ thống về thành phần hóa thực vật kết hợp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro (ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase và gây độc tế bào ung thư) là cần thiết để tạo cơ sở khoa học cho việc sử dụng nguồn dược liệu này.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định các mục tiêu nghiên cứu cụ thể sau:

  1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tinh khiết từ lá của loài Schefflera sessiliflora De P.
  2. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase in vitro của các hợp chất phân lập được nhằm tìm kiếm các chất có khả năng hỗ trợ kiểm soát đường huyết.
  3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất phân lập trên các dòng tế bào ung thư người (ung thư gan Hep-G2 và ung thư vú MCF-7).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Lá của loài chân chim không cuống quả Schefflera sessiliflora De P., thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae). Mẫu nguyên liệu được cung cấp bởi Trung tâm Trồng và Chế biến Cây thuốc Đà Lạt (số 18 Hoàng Văn Thụ, TP. Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng) và được định danh thực vật học; mẫu tiêu bản mang ký hiệu SS-126 được lưu giữ tại Phòng Các chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học.
  • Phạm vi không gian: Thu hái mẫu thực vật tại Lâm Đồng; các thực nghiệm hóa học và sinh học được thực hiện tại các phòng thí nghiệm chuyên ngành tại TP. Hồ Chí Minh (Viện Công nghệ Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG TP.HCM, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hóa học).
  • Phạm vi thời gian: Luận án hoàn thành và bảo vệ năm 2016.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước về loài Schefflera sessiliflora De P.

Loài Schefflera sessiliflora De P. ban đầu được ghi nhận dưới tên Schefflera sp3 và được công bố là loài mới vào năm 2004 bởi nhóm tác giả thuộc Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM. Cây có đặc điểm quả không cuống, mọc thành chùm 3–7 quả hoặc riêng lẻ, hình cầu kích thước $5 \times 4\text{ mm}$, khi chín có màu cam và có 5 cạnh.

Về mặt dược lý học:

  • Năm 2001, Trần C. và cộng sự đã công bố thử nghiệm tác dụng tăng lực in vivo của lá, thân và vỏ thân; trong đó dịch chiết lá và vỏ thân ở liều $1\text{ g/kg}$ cho tác dụng rõ rệt ($p < 0,01$). Mẫu cao thân ở liều $200\text{ mg/kg}$ thể hiện khả năng chịu đựng stress nóng trên mô hình động vật.
  • Phối hợp cao thân S. sessiliflora với cao hồng sâm theo tỷ lệ $1:1$ ở liều $400\text{ mg/kg}$ cho thấy thời gian sống trung bình của chuột dài hơn so với lô chỉ dùng hồng sâm đơn độc; độc tính cấp đường uống ($LD_{50}$) của cao thân dược liệu được xác định là $1255\text{ g/kg}$ và khi phối hợp với hồng sâm là $277,92\text{ g/kg}$.
  • Tác dụng chống oxy hóa in vitro được đánh giá qua khả năng quét gốc tự do DPPH và khả năng ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào bằng phương pháp định lượng malonyl dialdehyd (MDA).
  • Cao lá và cao thân cũng được ghi nhận có tác dụng kiểu androgen trên chuột đực bị suy giảm chức năng sinh dục.

Về mặt hóa thực vật: Trước luận án này, các công bố trong nước chỉ dừng lại ở mức khảo sát định tính sơ bộ, định lượng hàm lượng saponin tổng số, phân lập hai sapogenin là acid oleanolic (1) và hederagenin (2) từ thân và lá sau thủy phân, cùng một saponin duy nhất phân lập từ thân cây là 3-O-[$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$2)]-$\beta$-D-glucopyranosyloleanolic 28-O-$\beta$-D-glucopyranosyl ester (3). Chưa có công trình quốc tế nào công bố cấu trúc các hợp chất từ loài này.

Tổng quan về chi Schefflera

Chi Schefflera (chi Chân chim) là chi lớn nhất trong họ Araliaceae với hơn 650 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, châu Đại Dương và các đảo Thái Bình Dương. Tại Việt Nam, chi này có khoảng 56 loài và 4 thứ, phân bố từ Bắc vào Nam (tập trung nhiều ở vùng núi cao Lâm Đồng, Kon Tum và vùng núi đá vôi phía Bắc), trong đó có 10 loài được sử dụng trong y học cổ truyền:

  1. Chân chim Sa Pa (Schefflera chapana Harms)
  2. Chân chim leo / Chân chim bầu dục (Schefflera elliptica (Blume) Harms)
  3. Chân chim hoa chụm / Chân chim hoa cầu (Schefflera glomerulata Li)
  4. Chân chim Kon Tum (Schefflera kontumensis N.T. Hiền)
  5. Chân chim leo hoa trắng (Schefflera leucantha R. Vig.)
  6. Ngũ gia bì chân chim (Schefflera heptaphylla (L.) Frodin, đồng danh Schefflera octophylla (Lour.) Harms)
  7. Chân chim sẻ (Schefflera pes-avis R. Vig.)
  8. Chân chim núi / Chân chim Petelot (Schefflera petelotii Merr.)
  9. Chân chim Bắc Bộ (Schefflera tonkinensis R. Vig.)
  10. Chân chim gân dày / Chân chim mây (Schefflera venulosa (Wight et Arn.) Harms)

Các công trình nghiên cứu trên các loài cùng chi Schefflera trên thế giới đã xác định thành phần hóa học chủ đạo gồm triterpenoid và saponin triterpenoid (thuộc 4 dạng khung chính: oleanan, ursan, lupan, dammaran và các dạng khung chuyển vị rearranged oleanan $\Delta^{13(14)}$, $\Delta^{14}$, $\Delta^{13(18)}$), bên cạnh các nhóm chất khác như flavonoid, phenolic, polyacetylen, sterol, trisaccharide, ionon-glycoside, anthraquinon và lignan. Các nghiên cứu tiêu biểu được điểm lại bao gồm:

  • S. abyssinica: Tapondjou L. và cộng sự (2006) phân lập 13 hợp chất triterpenoid và saponin (cauloside A, fatsiaside C1, collinsonidin, ciwujianoside C3, cauloside D, chikusetsusaponin V...).
  • S. actinophylla: Wanas A. và cộng sự (2010) phân lập 16 triterpenoid và triterpenoid saponin khung ursan và lupan (acid 3-epi-betulinic 3-O-sulfat, acid 3$\alpha$-hydroxylup-20(29)-en-23,28-dioic...).
  • S. arboricola: Hansen L. (1986) phân lập polyacetylen (falcarinol) và sterol; các tác giả khác phân lập các dẫn xuất oleanan saponin có nhánh đường glucuronic acid, apiose và lupan tetraol/pentaol.
  • S. bodinieri: Zhu M. và cộng sự (1996) phân lập các saponin mang khung chuyển vị rearranged oleanan $\Delta^{13(14)}$ và $\Delta^{14}$ (isopolygalic acid, demethylisoaleuritolic acid).
  • S. heptaphylla: Günter A. (1982), Kitajima J. và cộng sự phân lập nhiều hợp chất saponin khung lupan sulfat, ursan và oleanan, cùng các dẫn xuất acid caffeoylquinic.
  • S. kwangsiensis: Zhang Q. và cộng sự (2012) phân lập các saponin staunoside C, kalopanaxsaponin B và các dẫn xuất alkyl ester của acid glucuronic.
  • S. leucantha: Pancharoen O. và cộng sự (1994) phân lập các saponin chứa khung betulinic và oleanolic.
  • S. rotundifolia: Braca A. và cộng sự (2004) phân lập 8 triterpenoid saponin và 2 glycoside phenolic.
Loài Schefflera Bộ phận nghiên cứu Các nhóm hợp chất chính đã công bố
S. actinophylla Lá Triterpenoid khung ursan và lupan, dẫn xuất sulfat
S. arboricola Thân, lá Polyacetylen, sterol, oleanan saponin, lupan saponin, dammaran
S. bodinieri Rễ, lá Rearranged oleanan ($\Delta^{13(14)}, \Delta^{14}$), sterol, trisaccharide
S. farinosa Vỏ cây Flavonoid (rutin, naringenin derivative), phenolic (acid caffeoylquinic)
S. heptaphylla Lá, cuống lá, vỏ cây Lupan saponin, lupan sulfat, ursan saponin, acid caffeoylquinic
S. kwangsiensis Thân, phần trên mặt đất Triterpenoid saponin (dẫn xuất ester hóa của acid glucuronic), lignan
S. rotundifolia Phần trên mặt đất Saponin oleanan, lupan, benzyl glycoside phenolic
S. venulosa Lá Lupan saponin, sesquiterpenoid (guaian derivative), lacton

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết

Luận án tập trung giải quyết khoảng trống dữ liệu về thành phần hóa thực vật tinh khiết của lá loài Schefflera sessiliflora De P., xác định cấu trúc chi tiết bằng các phương pháp phổ học hiện đại (đặc biệt là phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2D và khối phổ phân giải cao), đồng thời cung cấp các dẫn liệu thực nghiệm về hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất tinh khiết thu nhận được.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Khung phân loại cấu trúc các triterpenoid và saponin triterpenoid (các dạng aglycone: oleanan, ursan, lupan, dammaran; liên kết glycoside qua $C\text{-}3$ hoặc este hóa tại $C\text{-}28$), các hợp chất lipid phân cực (glyceroglycolipid, sulfolipid) và các ester của acid quinic với acid hydroxycinnamic.
  • Lý thuyết enzyme $\alpha$-glucosidase: Enzyme $\alpha$-glucosidase (EC 3.2.1.20, thuộc nhóm hydrolase cắt liên kết $O$- hoặc $S$-glycosyl) xúc tác quá trình thủy phân liên kết $\alpha$-D-glucoside tại đầu không khử của cơ chất giải phóng $\alpha$-D-glucose. Enzyme được phân thành Family I (vi khuẩn, nấm men, côn trùng; ưu tiên thủy giải chất nền không đồng nhất như PNPG) và Family II (thực vật, động vật có vú; ưu tiên chất nền đồng nhất). Cơ chế phản ứng xảy ra thông qua thế nucleophil hoặc qua trạng thái trung gian ion carbenium. Việc ức chế enzyme này tại đường tiêu hóa làm chậm quá trình phân giải carbohydrate thành glucose, giúp kiểm soát mức đường huyết sau ăn ở bệnh nhân đái tháo đường type II.

Phương pháp phân lập hóa học

  • Chiết xuất: Bột lá khô ($5\text{ kg}$, độ ẩm $12%$) được ngâm chiết kiệt với ethanol $96%$ ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết được thu gom và cô quay đuổi dung môi dưới áp suất giảm thu được $890\text{ g}$ cao tổng EtOH.
  • Chiết phân bố lỏng - lỏng: Cao tổng EtOH được phân tán vào nước ($W$) và chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: $n$-hexane thu được cao $n$-hexane SSH ($300\text{ g}$), ethyl acetate thu được cao EtOAc SSE ($15\text{ g}$), và pha nước còn lại ký hiệu là SSW ($600\text{ g}$).
  • Sắc ký:
    • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sử dụng bản mỏng silica gel tráng sẵn $DC\text{-Alufolien } 60\text{ }F_{254}$ (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng $254\text{ nm}$ và $365\text{ nm}$, hoặc phun hiện màu bằng dung dịch $H_2SO_4\text{ }10%$ trong ethanol kết hợp sấy nhiệt.
    • Sắc ký cột (CC): Sử dụng các pha tĩnh gồm silica gel pha thường (cỡ hạt $230\text{--}240\text{ mesh}$, Merck), silica gel pha đảo C-18 ($RP_{18}$, Merck) và hạt nhựa hấp phụ Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical).

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

  • Đo độ quay cực quang học ($[\alpha]_D$): Thực hiện trên phân cực kế Krüss-optronic GmbH polarimeter, sử dụng vạch phổ Natri ($\lambda = 589\text{ nm}$), ống đo mẫu chiều dài $l = 0,5\text{ dm}$.
  • Phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis): Quét phổ bằng đầu dò DAD trên hệ máy HPLC-DAD Agilent 1260, dung môi methanol (MeOH).
  • Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR): Đo trên máy Bruker Tensor 27 FT-IR Spectrometer, ép viên nén KBr hoặc tạo màng mỏng từ dung dịch MeOH.
  • Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS và HR-ESI-MS/MS): Đo trên máy Bruker MicrOTOF-QII spectrometer để xác định khối lượng phân tử chính xác và công thức phân tử.
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR ($500\text{ MHz}$ cho phổ $^1\text{H}$ và $125\text{ MHz}$ cho phổ $^{13}\text{C}$), sử dụng dung môi pha mẫu pyridine-$d_5$, $CD_3OD$ hoặc $CDCl_3$, chất nội chuẩn tetramethylsilane (TMS). Các kỹ thuật phổ một chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT-90, DEPT-135) và hai chiều ($^1\text{H--}^1\text{H COSY}$, HSQC, HMBC, NOESY, ROESY) được áp dụng đồng bộ.
  • Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS): Đo trên hệ thống Agilent 6890N GC ghép đầu dò khối phổ 5973 Inert MSD để nhận diện thành phần acid béo sau phản ứng methyl hóa.
  • Phương pháp hóa học: Thủy phân acid chọn lọc để xác định thành phần và cấu hình đơn vị đường (đối với các hợp chất saponin SS11, SS16, SS20, SS21) và xác định thành phần acid béo (đối với SS05, SS09).

Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

  • Thử hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase in vitro:
    • Nguồn enzyme: $\alpha$-glucosidase từ nấm men Saccharomyces cerevisiae ($750\text{ UN}$).
    • Chất nền: $p$-nitrophenyl-$\alpha$-D-glucopyranoside (PNPG, Sigma Chemical Co.).
    • Chất đối chứng dương: Acarbose (Merck).
    • Nguyên tắc: Enzyme xúc tác thủy phân PNPG giải phóng $p$-nitrophenol (PNP) có màu vàng. Mật độ quang được đo ở bước sóng $\lambda = 405\text{ nm}$ trên máy quang phổ Shimadzu UV 1800. Tỷ lệ phần trăm ức chế (%) và giá trị $IC_{50}$ được tính toán dựa trên mức độ giảm mật độ quang so với mẫu chứng không có chất ức chế.
  • Thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro:
    • Dòng tế bào ung thư: Tế bào ung thư biểu mô gan người (Hep-G2) và tế bào ung thư vú người (MCF-7).
    • Chất đối chứng dương: Camptothecin (Calbiochem).
    • Phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB), đo độ hấp thu quang học trên máy đọc Synergy HT Biotek.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết có hệ thống các dẫn liệu thực vật học, sinh thái, phân bố và tình hình nghiên cứu hóa học - dược lý của chi Schefflera và loài Schefflera sessiliflora De P.

  • Trình bày đặc điểm hình thái thực vật của cây chân chim không cuống quả (S. sessiliflora De P.), đối chiếu tiêu bản thực vật và tổng hợp các công bố về tác dụng tăng lực in vivo ($1\text{ g/kg}$), chống stress nhiệt ($200\text{ mg/kg}$), chống oxy hóa in vitro (DPPH, MDA) và độc tính cấp ($LD_{50} = 1255\text{ g/kg}$).
  • Khảo cứu 56 loài và 4 thứ thuộc chi Schefflera tại Việt Nam, phân tích 10 loài dùng làm thuốc.
  • Tổng kết thành phần hóa học của hơn 16 loài Schefflera trên thế giới (tổng hợp 228 hợp chất bao gồm các nhóm triterpenoid oleanan, ursan, lupan, dammaran, steroid, phenolic, flavonoid, polyacetylen, ionon-glycoside, sesquiterpenoid).
  • Phân tích cơ sở sinh hóa học của enzyme $\alpha$-glucosidase (EC 3.2.1.20), cơ chế xúc tác thủy giải liên kết $\alpha$-glycosyl tạo glucose thông qua trạng thái chuyển tiếp ion carbenium và cơ chế thế nucleophil, đồng thời phân loại các nhóm chất ức chế tự nhiên và tổng hợp (disaccharide, iminosugar, thiosugar, carbasugar, pseudoaminosugar, cùng 3 hoạt chất đang lưu hành: Acarbose, Miglitol, N-Butyl-1-Deoxynojirimycin).

Chương 2: Phương pháp nghiên cứu

Chương này trình bày chi tiết về nguồn gốc mẫu, trang thiết bị, hóa chất và quy trình thực hiện các phương pháp phân lập, phân tích cấu trúc và thử nghiệm sinh học.

  • Quy chuẩn hóa quy trình thu gom, làm sạch, phơi khô, xay bột mẫu lá S. sessiliflora từ Đà Lạt (tiêu bản SS-126).
  • Quy định các điều kiện sắc ký: hệ dung môi rửa giải cho sắc ký cột silica gel pha thường, pha đảo C-18 và hạt hấp phụ Diaion HP-20; điều kiện chạy sắc ký lớp mỏng TLC và phát hiện vệt chất.
  • Thiết lập thông số vận hành của hệ thống thiết bị đo phổ: UV-DAD (Agilent 1260), FT-IR (Bruker Tensor 27), HR-ESI-MS (Bruker MicrOTOF-QII), NMR 1D/2D $500\text{ MHz}$ (Bruker AM500), GC-MS (Agilent 6890N/5973 MSD) và phân cực kế đo $[\alpha]_D$ (Krüss-optronic GmbH).
  • Chuẩn hóa quy trình thử nghiệm in vitro ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase trên phiến đo quang $\lambda = 405\text{ nm}$ và thử nghiệm độc tính tế bào SRB trên hai dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7.

Chương 3: Thực nghiệm

Chương này mô tả chi tiết các bước tiến hành thực nghiệm chiết xuất, phân đoạn và tinh chế từng hợp chất từ lá S. sessiliflora.

  • Điều chế các cao chiết: Từ $5\text{ kg}$ bột lá khô điều chế được $890\text{ g}$ cao thô EtOH; sau khi chiết phân bố thu được cao SSH ($300\text{ g}$), cao SSE ($15\text{ g}$) và dịch nước SSW ($600\text{ g}$).
  • Quy trình phân lập từ cao SSE ($15\text{ g}$): Tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi $n$-hexane–EtOAc–MeOH tăng dần độ phân cực ($1/1 \rightarrow 25/75 \rightarrow 100% \text{ EtOAc} \rightarrow 90/10 \rightarrow 80/20$), thu được 5 phân đoạn ký hiệu E.I đến E.V. Phân đoạn E.III ($6\text{ g}$) tiếp tục sắc ký cột với hệ dung môi $CHCl_3\text{–}MeOH$ ($95/5 \rightarrow 75/25$) thu được các phân đoạn phụ và phân lập các hợp chất tinh khiết.
  • Quy trình phân lập từ dịch nước SSW ($600\text{ g}$): Dịch nước được cho qua cột nhựa hấp phụ Diaion HP-20, rửa giải phân đoạn bằng hệ dung môi $MeOH\text{–}W$ với nồng độ MeOH tăng dần ($0% \rightarrow 25% \text{ [}67\text{ g]} \rightarrow 50% \text{ [}72\text{ g]} \rightarrow 75% \text{ [}80\text{ g]} \rightarrow 100% \text{ [}85\text{ g]}$), thu được 5 phân đoạn lớn từ W.I đến W.V.
    • Phân đoạn W.V ($85\text{ g}$) sắc ký cột silica gel pha thường với hệ $n$-hexane–EtOAc–MeOH ($1/1 \rightarrow 100% \text{ EtOAc} \rightarrow 10/1 \rightarrow 1/1$) thu được 6 phân đoạn (W.V.1 đến W.V.6). Phân đoạn W.V.2 ($24\text{ g}$) sắc ký tiếp với hệ $CHCl_3\text{–}MeOH$ ($100% \rightarrow 5/1$) thu được 4 phân đoạn nhỏ.
    • Phân đoạn W.IV ($80\text{ g}$) sắc ký cột silica gel với hệ $EtOAc\text{–}MeOH$ ($10/1 \rightarrow 100% \text{ MeOH}$) thu được 7 phân đoạn (W.IV.1 đến W.IV.7). Phân đoạn W.IV.1 ($15\text{ g}$) được tinh chế tiếp với hệ $CHCl_3\text{–}MeOH\text{–}W$ ($90/10/1 \rightarrow 80/20/2$).
  • Ghi nhận đầy đủ hằng số vật lý, giá trị $[\alpha]_D$ và dữ kiện phổ (IR, HR-MS, $^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY/ROESY) cho các hợp chất phân lập: SS01, SS02, SS03, SS04, SS05, SS06, SS07, SS08, SS09, SS10, SS11, SS12, SS13, SS14, SS15, SS16, SS17, SS18, SS19, SS20, SS21.
  • Tiến hành phản ứng thủy phân acid cắt liên kết glycoside để xác định thành phần các đơn vị đường đối với các saponin SS11, SS16, SS20, SS21 và thủy phân kiềm/acid béo đối với dẫn xuất glycerolipid SS05, SS09.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương này tập trung biện giải cấu trúc hóa học của các hợp chất thu nhận được và thảo luận về kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học.

  • Biện giải cấu trúc các hợp chất điển hình:
    • Chikusetsusaponin IVa methyl ester (SS14): Xác định dựa trên các tín hiệu phổ NMR đặc trưng của aglycone khung olean-12-en, nhóm carboxyl tại $C\text{-}28$ bị este hóa tạo methyl ester, và chuỗi đường tại vị trí $C\text{-}3$.
    • Pseudoginsenoside RT1 methyl ester (SS15): Xác định cấu trúc triterpenoid saponin dạng methyl ester.
    • Acid 5-p-trans-coumaroylquinic (SS04): Hợp chất phenolic thuộc nhóm dẫn xuất acid quinic ester hóa với acid $p$-coumaric ở vị trí $C\text{-}5$, cấu hình liên kết đôi dạng trans ($J \approx 16\text{ Hz}$).
    • Muối natri của (2S)-1,2-di-O-palmitoyl-3-O-$\alpha$-D-(6-sulfo)quinovopyranosylglycerol (SS09): Xác định là một sulfolipid tự nhiên dạng sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG); phân mảnh phổ HR-MS và GC-MS sau thủy phân khẳng định sự có mặt của hai gốc acid palmitic gắn trên khung glycerol tại vị trí $sn\text{-}1$ và $sn\text{-}2$.
    • Hỗn hợp sn-1-monoacylglycerol và sn-1,2-diacylglycerol (SS05): Cấu trúc được xác định qua dữ liệu phổ NMR và GC-MS phân tích thành phần acid béo sau phản ứng dẫn xuất hóa.
    • Các hợp chất saponin và dẫn xuất triterpenoid khác (SS01, SS02, SS03, SS06, SS07, SS08, SS10, SS11, SS12, SS13, SS16, SS17, SS18, SS19, SS20, SS21) được xác định chi tiết dựa trên tương tác tầm xa HMBC và tương tác không gian qua phổ ROESY/NOESY.
  • Thảo luận hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase: Phân tích dữ liệu ức chế enzyme của các hợp chất phân lập được; thiết lập mối liên quan giữa đặc điểm cấu trúc hóa học của các triterpenoid/saponin (như kiểu khung aglycone, số lượng và vị trí các nhóm thế hydroxyl, acid carboxylic tự do hay este hóa, chiều dài và thành phần mạch đường) đối với mức độ ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase.
  • Thảo luận hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Đánh giá hiệu lực gây độc tế bào in vitro của các hợp chất trên hai dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7 so sánh với đối chứng dương camptothecin.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

  1. Phát hiện hóa thực vật toàn diện trên loài mới: Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu chi tiết và có hệ thống về thành phần hóa học của lá loài Schefflera sessiliflora De P. (cây chân chim không cuống quả) tại Việt Nam và trên thế giới.
  2. Phân lập và xác định cấu trúc nhiều nhóm chất đa dạng: Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc hoàn chỉnh của hơn 20 hợp chất tinh khiết thuộc nhiều nhóm hợp chất tự nhiên khác nhau, bao gồm:
    • Các triterpenoid và saponin triterpenoid (như Chikusetsusaponin IVa methyl ester - SS14, Pseudoginsenoside RT1 methyl ester - SS15, các saponin ký hiệu SS01, SS02, SS03, SS06, SS07, SS08, SS10, SS11, SS12, SS13, SS16, SS17, SS18, SS19, SS20, SS21).
    • Dẫn xuất acid quinic phenolic: Acid 5-$p$-$trans$-coumaroylquinic (SS04).
    • Hợp chất sulfoglycolipid hiếm: Muối natri của (2S)-1,2-di-$O$-palmitoyl-3-$O$-$\alpha$-D-(6-sulfo)quinovopyranosylglycerol (SS09).
    • Các acylglycerol: hỗn hợp $sn$-1-monoacylglycerol và $sn$-1,2-diacylglycerol (SS05).
  3. Làm sáng tỏ mối liên quan cấu trúc - hoạt tính (SAR): Luận án phân tích mối quan hệ giữa cấu trúc khung aglycone, các nhóm chức và mạch đường của các triterpenoid phân lập từ S. sessiliflora với khả năng ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase in vitro.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và ứng dụng

  1. Dữ liệu hoạt tính sinh học: Cung cấp bộ số liệu thực nghiệm về hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase và hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư vú (MCF-7) của các hợp chất tinh khiết phân lập từ lá cây chân chim không cuống quả.
  2. Cơ sở khoa học nâng cao giá trị dược liệu: Kết quả nghiên cứu xác nhận lá cây S. sessiliflora chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, tạo cơ sở khoa học định hướng khai thác và sử dụng nguồn tài nguyên thực vật đặc hữu này tại Việt Nam.

Kiến nghị của luận án

  • Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của các phân đoạn chiết khác từ lá cũng như các bộ phận khác (thân, vỏ thân, rễ) của loài Schefflera sessiliflora De P.
  • Mở rộng khảo sát các hoạt tính sinh học in vitro và in vivo khác đối với các hợp chất saponin và sulfolipid phân lập được nhằm phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị đái tháo đường và bệnh mạn tính.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Mẫu thực vật nghiên cứu chỉ mới thu thập tại một vùng địa lý cụ thể (Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng), chưa thực hiện khảo sát biến thiên hàm lượng hoạt chất theo mùa vụ hoặc theo các vùng sinh thái khác nhau.
  • Các đánh giá hoạt tính sinh học trong luận án chủ yếu thực hiện ở quy mô in vitro ($\alpha$-glucosidase nấm men và 2 dòng dòng tế bào ung thư nuôi cấy), chưa triển khai các thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật đối với từng hợp chất tinh khiết do giới hạn về khối lượng chất phân lập.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Khảo sát quy trình chiết xuất tối ưu hóa để thu nhận các phân đoạn giàu saponin và sulfolipid từ lá S. sessiliflora.
  • Đánh giá hoạt tính hạ đường huyết và ức chế enzyme tiêu hóa trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo).
  • Nghiên cứu cơ chế phân tử tác động lên tế bào ung thư của các hợp chất mới phân lập.

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa hợp chất thiên nhiên, Hóa Dược và Dược học: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình phân lập các hợp chất saponin phân cực cao bằng sắc ký cột kết hợp Diaion HP-20, pha đảo C-18 và kỹ thuật giải phổ NMR 2 chiều (HMBC, HSQC, COSY, ROESY/NOESY) để xác định cấu trúc triterpenoid và chuỗi oligosaccharide.
  • Giảng viên và nhà nghiên cứu Thực vật học, Dược liệu học: Cung cấp dữ liệu tra cứu về hóa thực vật của chi Schefflera nói chung và loài Schefflera sessiliflora nói riêng, bao gồm danh mục 228 hợp chất hóa học đã từng được công bố trong chi Araliaceae.
  • Nhà nghiên cứu phát triển thuốc và thực phẩm chức năng: Dữ liệu về hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase và độc tính tế bào của các hợp chất triterpenoid saponin và sulfolipid SS09 là tài liệu tham khảo hữu ích cho định hướng sàng lọc các hoạt chất tự nhiên hỗ trợ điều trị đái tháo đường và các bệnh liên quan.

Câu hỏi thường gặp

1. Loài Schefflera sessiliflora De P. được phát hiện khi nào và có đặc điểm hình thái gì đặc trưng?

Loài Schefflera sessiliflora De P. (cây chân chim không cuống quả) được phát hiện là loài mới vào năm 2004 bởi các tác giả thuộc Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM. Cây có đặc điểm quả không có cuống, thường mọc thành chùm 3–7 quả hoặc mọc riêng lẻ, quả hình cầu kích thước khoảng $5 \times 4\text{ mm}$, khi chín có màu cam và có 5 cạnh.

2. Nguyên liệu lá cây trong luận án được thu thập ở đâu và xử lý chiết xuất ban đầu như thế nào?

Mẫu lá tươi được thu thập tại Trung tâm Trồng và Chế biến Cây thuốc Đà Lạt (18 Hoàng Văn Thụ, TP. Đà Lạt, Lâm Đồng), được định danh và lưu tiêu bản ký hiệu SS-126 tại Viện Công nghệ Hóa học. Lá được rửa sạch, phơi khô (độ ẩm 12%), xay thành $5\text{ kg}$ bột thô, sau đó ngâm chiết kiệt với ethanol 96% ở nhiệt độ phòng để thu được $890\text{ g}$ cao tổng EtOH.

3. Quy trình phân đoạn lỏng - lỏng từ cao tổng EtOH thu được những phân đoạn nào với khối lượng bao nhiêu?

Từ $890\text{ g}$ cao thô EtOH, sau khi phân tán vào nước đã tiến hành chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với dung môi $n$-hexane và ethyl acetate (EtOAc), thu được 3 phân đoạn chính:

  • Cao $n$-hexane (SSH): $300\text{ g}$
  • Cao ethyl acetate (SSE): $15\text{ g}$
  • Dịch nước còn lại (SSW): $600\text{ g}$

4. Những kỹ thuật phổ học nào đã được sử dụng để xác định cấu trúc hóa học các hợp chất trong luận án?

Luận án sử dụng đồng bộ các phương pháp hóa lý hiện đại:

  • Phân cực kế (đo $[\alpha]_D$ tại bước sóng $589\text{ nm}$).
  • Phổ tử ngoại (HPLC-DAD Agilent 1260).
  • Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR Bruker Tensor 27).
  • Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS và HR-ESI-MS/MS Bruker MicrOTOF-QII).
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY, ROESY trên máy Bruker AM500).
  • Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS Agilent 6890N/5973 MSD).

5. Những hoạt tính sinh học in vitro nào đã được đánh giá trên các chất tinh khiết phân lập được?

Luận án đã thực hiện hai thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro:

  • Hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase (nguồn gốc từ nấm men Saccharomyces cerevisiae, chất nền PNPG, đo độ hấp thu ở bước sóng $\lambda = 405\text{ nm}$, đối chứng dương Acarbose).
  • Hoạt tính gây độc tế bào (phương pháp SRB trên hai dòng tế bào ung thư người: Hep-G2 ung thư gan và MCF-7 ung thư vú, đối chứng dương Camptothecin).

Kết luận

Luận án Tiến sĩ Hóa học của nghiên cứu sinh Nguyễn Tấn Phát đã thực hiện nghiên cứu chuyên sâu và toàn diện về thành phần hóa học cùng hoạt tính sinh học của lá loài chân chim không cuống quả (Schefflera sessiliflora De P., họ Araliaceae) thu hái tại Lâm Đồng, Việt Nam. Thông qua các quy trình chiết xuất, sắc ký phân lập và hệ thống phổ nghiệm hiện đại (HR-ESI-MS, NMR 1D/2D, GC-MS), luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của hơn 20 hợp chất tinh khiết gồm các triterpenoid saponin, dẫn xuất acid quinic, lipid phân cực và sulfoglycolipid. Đồng thời, công trình đã xác lập các dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase và hoạt tính gây độc tế bào ung thư (Hep-G2, MCF-7) của các hợp chất thu nhận, đóng góp cơ sở dữ liệu khoa học có giá trị cho lĩnh vực Hóa học các hợp chất thiên nhiên và định hướng nghiên cứu khai thác nguồn dược liệu thực vật tại Việt Nam.