Tổng quan luận án
Nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên định hướng hoạt tính sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc lý giải cơ sở khoa học của các bài thuốc cổ truyền, tiêu chuẩn hóa dược liệu và tìm kiếm các hoạt chất có tiềm năng ứng dụng trong y dược học. Nguồn tài nguyên thực vật Việt Nam phong phú với khoảng 12.000 loài thực vật có mạch và 3.948 loài cây thuốc thuộc 307 họ, chiếm 37,6% tổng số loài trong tự nhiên. Trong đó, chi Cleome thuộc họ Màn màn (Cleomaceae) là nhóm thực vật phân bố rộng khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Hai loài Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.) và Màn màn hoa vàng (Cleome viscosa L.) mọc hoang phổ biến tại Việt Nam và được sử dụng trong y học dân gian để điều trị nhiều chứng bệnh như cảm cúm, nhức đầu, ho hen, viêm đau thận, tê thấp, sưng viêm và kích thích tiêu hóa.
Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định: Các nghiên cứu trên thế giới cũng như tại Việt Nam về hai loài thực vật này chủ yếu dừng lại ở việc khảo sát hoạt tính sinh học của các dịch chiết thô, trong khi các công trình phân lập, xác định cấu trúc chi tiết của các hợp chất tinh khiết và khảo sát tác dụng bảo vệ tế bào gan chuyên sâu còn rất hạn chế.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm ba nội dung chính:
- Phân lập các hợp chất tinh khiết từ lá và thân của hai loài Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.) và Màn màn hoa vàng (Cleome viscosa L.).
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ hiện đại.
- Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính bảo vệ gan của các cao chiết cũng như các hợp chất tinh khiết phân lập được trên mô hình tế bào HepG2 bị gây độc bởi carbon tetrachloride ($\text{CCl}_4$).
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng: Các bộ phận lá và thân của cây Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.) và Màn màn hoa vàng (Cleome viscosa L.).
- Phạm vi không gian: Mẫu thực vật thu hái tại huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương; được phân loại và giám định tên khoa học bởi TS. Võ Văn Chi.
- Phạm vi thời gian: Mẫu thực vật được thu hái vào tháng 10 năm 2012.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Họ Màn màn (Cleomaceae) trên thế giới phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và ấm áp. Tại Việt Nam, họ này có khoảng 55 loài và thứ thuộc các chi như Capparis, Cleome, Crateva, Niebuhria, và Stixis, có giá trị kinh tế và y học đa dạng.
| Nhóm thực vật |
Tác giả & Năm công bố |
Phát hiện hóa học chính |
Hoạt tính sinh học ghi nhận |
| Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.) |
Rahman và cs (2008) |
Phân lập acid 2-ethyl-cyclohex-2-ene-6-hydroxy-methylene-1-carboxylic và acid bentunic từ cao $n$-hexane |
— |
|
Mondal và cs (2010, 2009, 2012) |
Phân lập $\beta$-sitosterol, lupeol, acid bentunic từ cao $\text{CHCl}_3$ của rễ |
Giảm đau, kháng viêm, hạ sốt, làm lành vết thương |
|
Dey và cs (2009) |
Cao methanol |
Kháng u trên mô hình thực nghiệm gây ung thư da và ung thư dạ dày |
|
Chakraborty và cs (2010) |
Cao ethanol và cao nước |
Ức chế gốc tự do in vitro (DPPH, nitric oxid, gốc hydroxyl) |
|
Nguyễn Tuấn Quang và cs (2011) |
Phát hiện anthraquinone, flavonoid (hàm lượng $1,07 \pm 0,02%$), chất béo, sterol, saponin |
Kháng khuẩn, kháng viêm cấp carragenin, giảm MDA và tăng GSH ở gan chuột |
|
Bose và cs (2007, 2012, 2013) |
Cao chiết ethanol, diethyl ether, cao nước |
Kháng khuẩn, kháng nấm, lợi tiểu, kháng sốt rét ($\text{IC}_{50} = 34,4\ \mu\text{g/mL}$), giảm đau, chống co giật |
|
Battu và cs (2012), Ethadi và cs (2013) |
Dịch chiết rễ |
Kháng oxy hóa, kháng viêm và bảo vệ gan in vitro |
|
Sridhar và cs (2014) |
Dịch chiết methanol |
Kháng nấm Candida albicans ($\text{MIC} = 0,039\ \text{mg/mL}$) |
|
Okoro và cs (2015) |
Cao methanol (liều $1.095\ \text{mg/kg}$) |
Hạ glucose huyết trên chuột đái tháo đường do streptozotocin |
| Màn màn hoa vàng (Cleome viscosa L.) |
Srivastava và cs (1979), Chauhan và cs (1979) |
Phân lập naringenin 4'-(xylosyl-$\beta$-(1$\rightarrow$4)-glucoside) và kaempferol-3-glucuronide-4'-methylether |
— |
|
Ray và cs (1985), Kumar và cs (1988) |
Phân lập các coumarinolignoid: cleomiscosin A, B, C, D từ hạt |
— |
|
Jente và cs (1990) |
Phân lập terpen: cleomeolide và acid cleomaldeic |
— |
|
Biswas và cs (2010), Jana và cs (2011) |
Acid 2-amino-9-(4-oxoazetidin-2-yl)nonanoic, acid lactam nonanic từ rễ |
Kháng khuẩn trên vi khuẩn gram |
|
Senthamilselvi và cs (2012), Chatterjee và cs (2013) |
Phân lập quercetin-3-$O$-(2''-acetyl)-glucoside từ hoa; nevirapine |
— |
|
Priyanka và cs (2014) |
Phát hiện myricetin, kaempferol-7-$O$-rutinoside, galacatechin, acid gallic, acid protocatechuic |
— |
|
Chattopadhyay và cs (2008), Yadav và cs (2010) |
Cleomiscosin A, B, C từ hạt |
Giảm tổn thương gan, bảo vệ gan chống độc tính do $\text{CCl}_4$ |
|
Kumar và cs (2009), Mobiya và cs (2010) |
Cao methanol, cao ethanol từ hạt |
Chống xơ hóa gan do $\text{CCl}_4$, tái sinh tế bào gan tổn thương bởi paracetamol |
|
Gupta và cs (2009), Devi và cs (2015) |
Cao ethanol, cao methanol |
Bảo vệ gan tương tự silymarin; giảm men gan AST, ALT, ALP, ure, creatinine |
Vị trí của luận án: Luận án tập trung giải quyết khoảng trống về hóa thực vật học bằng cách thực hiện phân lập hệ thống các hợp chất từ cả lá và thân của hai loài Cleome chelidonii và Cleome viscosa, giải cấu trúc các flavonoid glycoside phức tạp (bao gồm các chất mới chưa từng công bố), đồng thời đánh giá tác dụng bảo vệ trực tiếp trên tế bào ung thư biểu mô gan người HepG2 chịu stress oxy hóa do $\text{CCl}_4$.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết và khung phân tích
Luận án vận dụng lý thuyết hóa thực vật học về các chất chuyển hóa thứ cấp, tập trung vào nhóm flavonoid (flavone, flavonol glycoside) và cơ chế bảo vệ tế bào gan. Tổn thương tế bào gan do các tác nhân ngoại sinh ($\text{CCl}_4$, paracetamol, rượu) diễn ra chủ yếu thông qua quá trình peroxid hóa lipid màng và tích tụ các gốc tự do gây stress oxy hóa. Flavonoid đóng vai trò chất chống oxy hóa, loại bỏ gốc superoxide, hydroxyl và ổn định màng tế bào.
Mô hình tế bào HepG2 (Human hepatocellular carcinoma) được lựa chọn làm hệ thống thử nghiệm sinh học in vitro. Dòng tế bào này duy trì hình thái và các chức năng biệt hóa tương đương 80% bộ gen của tế bào gan người tươi (khả năng tổng hợp protein huyết tương như albumin, transferrin, biểu hiện thụ thể insulin, hệ enzyme chuyển hóa chu kỳ tế bào).
Thực vật (Lá/Thân Màn màn)
Dịch chiết phân đoạn (n-Hexane, EtOAc, MeOH)
Các hợp chất tinh khiết (Hợp chất 1 - 25)
Xác định cấu trúc hóa học Thử nghiệm hoạt tính sinh học
(HR-ESI-MS, 1D/2D-NMR, UV-Vis, IR, [α]D) (Tế bào HepG2: Độc tính tế bào & Bảo vệ gan kháng CCl4)
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
-
Kỹ thuật phân lập và tinh chế:
- Trích ly phân đoạn bằng phương pháp trích pha rắn với các dung môi có độ phân cực tăng dần: $n$-hexane, ethyl acetate ($\text{EtOAc}$), và methanol ($\text{MeOH}$).
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản tráng sẵn silica gel $60\ \text{F}{254}$ và $\text{RP-18}\ \text{F}{254\text{s}}$ (Merck); soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng $254\ \text{nm}$, $365\ \text{nm}$ hoặc hiện màu bằng thuốc thử dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4\ 10%$ trong ethanol rồi hơ nhiệt.
- Sắc ký cột cổ điển (CC) sử dụng chất hấp phụ pha thường (silica gel kích thước hạt $0,040 - 0,063\ \text{mm}$), pha đảo ($\text{RP-18}$), hạt nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 và gel lọc rây phân tử Sephadex LH-20.
-
Phương pháp phổ nghiệm xác định cấu trúc:
- Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) đo trên thiết bị Bruker MicroTOF-QII (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG TP.HCM).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR ($^1\text{H}$-NMR ở tần số $500\ \text{MHz}$, $^{13}\text{C}$-NMR ở tần số $125\ \text{MHz}$) tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, dùng chất chuẩn nội tetramethylsilane (TMS). Phân tích đầy đủ phổ 1D ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT-90, DEPT-135) và phổ 2D (COSY, HSQC, HMBC).
- Phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) đo trên máy Jasco V-630; phổ hồng ngoại (FT-IR) đo trên thiết bị Bruker Tensor 27; độ quay cực ($[\alpha]_\text{D}$) đo trên phân cực kế ADP220 (Bellingham + Stanley Ltd., UK) tại Viện Công nghệ Hóa học.
-
Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro:
- Khảo sát độc tính tế bào (MTT assay): Dựa trên hoạt tính enzyme succinate dehydrogenase (SDH) của ty thể tế bào sống khử muối MTT thành tinh thể formazan màu tím, hòa tan trong DMSO và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng $535\ \text{nm}$ hoặc $570\ \text{nm}$.
- Khảo sát tác dụng bảo vệ tế bào gan: Tế bào HepG2 nuôi cấy trong môi trường EMEM (bổ sung $10%\ \text{FCS}$, $2\ \text{mM}\ \text{L-glutamin}$, $100\ \text{IU/mL}\ \text{penicillin}$, $100\ \mu\text{g/mL}\ \text{streptomycin}$) ở $37^\circ\text{C}$, $5%\ \text{CO}_2$. Gây độc tế bào bằng $\text{CCl}_4\ 2\ \text{mM}$ trong 24 giờ cùng với hợp chất khảo sát ($100\ \mu\text{M}$) hoặc đối chứng quercetin ($10\ \mu\text{M}$).
- Hiệu quả bảo vệ ($\text{HQ}%$) tính theo công thức:
$$\text{HQ}\ (%) = \frac{\text{OD}{\text{CCl}4 + \text{mẫu thử}} - \text{OD}{\text{CCl}4}}{\text{OD}{\text{mẫu chứng}} - \text{OD}{\text{CCl}_4}} \times 100$$
Nội dung chính theo từng chương
MỞ ĐẦU
Trình bày bối cảnh nghiên cứu về tiềm năng dược liệu Việt Nam, giá trị thực tiễn của họ Màn màn (Cleomaceae), tổng quan về hai đối tượng Cleome chelidonii L. và Cleome viscosa L., xác lập ba mục tiêu nghiên cứu và các nội dung thực nghiệm cụ thể của đề tài.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Chương này tổng hợp các tài liệu khoa học về đặc điểm thực vật học, sinh thái, phân bố và giá trị sử dụng của chi Cleome. Tác giả phân tích dữ liệu hóa thực vật và dược lý của Màn màn hoa tím và Màn màn hoa vàng; tổng quan cơ chế bệnh sinh của tổn thương gan do thuốc và độc chất; làm rõ cơ sở lựa chọn dòng tế bào ung thư biểu mô gan người HepG2 cho mô hình sàng lọc in vitro.
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
Trình bày chi tiết nguồn gốc nguyên liệu, hóa chất, thiết bị và các quy trình chiết tách từ 4 bộ mẫu thực vật:
- Lá Màn màn hoa tím: $40\ \text{kg}$ tươi $\rightarrow 5\ \text{kg}$ bột khô. Chiết phân đoạn thu được cao $n$-hexane ($120\ \text{g}$), cao $\text{EtOAc}$ ($228\ \text{g}$) và cao $\text{MeOH}$ ($170\ \text{g}$). Từ cao $\text{EtOAc}$ phân lập được hợp chất 21 ($20\ \text{mg}$), 22 ($15\ \text{mg}$), 23 ($5\ \text{mg}$). Từ cao $\text{MeOH}$ phân lập được hợp chất 2 ($13\ \text{mg}$), 5 ($15\ \text{mg}$), 6 ($50\ \text{mg}$), 8 ($30\ \text{mg}$).
- Thân Màn màn hoa tím: $75\ \text{kg}$ tươi $\rightarrow 8,5\ \text{kg}$ bột khô. Cao $\text{MeOH}$ ($302\ \text{g}$) được chia thành 7 phân đoạn ($\text{M}_1 - \text{M}_7$), phân lập được hợp chất 25 ($12\ \text{mg}$ từ $\text{M}_2$), 3 ($15\ \text{mg}$ từ $\text{M}_3$), 16 ($11\ \text{mg}$) và 19 ($6\ \text{mg}$ từ $\text{M}_4$), 7 ($33\ \text{mg}$ từ $\text{M}_5$), 20 ($17\ \text{mg}$ từ $\text{M}_6$).
- Lá Màn màn hoa vàng: $68\ \text{kg}$ tươi $\rightarrow 7,5\ \text{kg}$ bột khô. Cao $\text{MeOH}$ ($400\ \text{g}$) chia 7 phân đoạn, phân lập được hợp chất 11 ($8\ \text{mg}$ từ $\text{M}_2$), 15 ($16\ \text{mg}$ từ $\text{M}_3$), 17 ($68\ \text{mg}$) và 18 ($2\ \text{g}$ từ $\text{M}_4$), 1 ($75\ \text{mg}$) và 4 ($6,5\ \text{g}$ từ $\text{M}_5$), 9 ($250\ \text{mg}$ từ $\text{M}_6$).
- Thân Màn màn hoa vàng: $65\ \text{kg}$ tươi $\rightarrow 7\ \text{kg}$ bột khô, ngâm chiết ethanol $96%$ thu $850\ \text{g}$ cao tổng. Phân bố pha rắn thu cao $\text{EtOAc}$ ($50\ \text{g}$, tách được hợp chất 24 - $8\ \text{mg}$) và cao $\text{MeOH}$ ($100\ \text{g}$, tách được hợp chất 12 - $6\ \text{mg}$, 13 - $7\ \text{mg}$, 14 - $22\ \text{mg}$, 10 - $40\ \text{mg}$).
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Xác định cấu trúc hóa học 25 hợp chất dựa trên phân tích phổ MS và NMR (gồm 5 hợp chất mới):
| Ký hiệu |
Tên hợp chất |
Công thức phân tử / Khối lượng phân lập |
Nguồn phân lập |
Đặc điểm cấu trúc chính |
| 1 |
Quercetin-7-$O$-$\alpha$-L-rhamnopyranoside |
$\text{C}{21}\text{H}{20}\text{O}_{11}$ ($75\ \text{mg}$) |
Lá Màn màn hoa vàng |
Khung quercetin, đường rhamnose tại C-7 ($\delta_\text{C}\ 161,4$; $\delta_\text{H}\ 5,54\ \text{ppm}$) |
| 2 |
Quercitrin |
$\text{C}{21}\text{H}{20}\text{O}_{11}$ ($13\ \text{mg}$) |
Lá Màn màn hoa tím |
Khung quercetin, đường rhamnose tại C-3 ($\delta_\text{C}\ 134,2$; $\delta_\text{H}\ 5,25\ \text{ppm}$) |
| 3 |
Isoquercitrin |
$\text{C}{21}\text{H}{20}\text{O}_{12}$ ($15\ \text{mg}$) |
Thân Màn màn hoa tím |
Khung quercetin, đường glucose tại C-3 ($\delta_\text{C}\ 133,3$; $\delta_\text{H}\ 5,46\ \text{ppm}$) |
| 4 |
Quercetin-3-$O$-$\beta$-D-glucopyranosyl-7-$O$-$\alpha$-L-rhamnopyranoside |
$\text{C}{27}\text{H}{30}\text{O}_{16}$ ($6,5\ \text{g}$) |
Lá Màn màn hoa vàng |
Gắn đồng thời $\beta$-Glc tại C-3 và $\alpha$-Rha tại C-7 |
| 5 |
Quercetin-3-$O$-[$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$2)]-$\alpha$-L-rhamnopyranoside-7-$O$-$\alpha$-L-rhamnopyranoside |
$\text{C}{33}\text{H}{40}\text{O}_{20}$ ($15\ \text{mg}$) |
Lá Màn màn hoa tím |
Khung quercetin mang 3 đơn vị đường (2 Rha, 1 Glc) |
| 6 |
Cleomeside A (Mới) |
$\text{C}{35}\text{H}{42}\text{O}_{21}$ ($50\ \text{mg}$) |
Lá Màn màn hoa tím |
Cấu trúc tương tự chất 5 nhưng bị acetyl hóa tại vị trí $\text{C-4}''''$ của đường $\text{Rha II}$ ($\delta_\text{C}\ 170,0$ và $20,9$) |
| 7 |
Quercetin-3-$O$-[2''-$O$-(6'''-$p$-coumaroyl)-$\beta$-D-glucopyranosyl]-$\alpha$-L-rhamnopyranoside-7-$O$-$\alpha$-L-rhamnopyranoside |
$\text{C}{42}\text{H}{46}\text{O}_{22}$ ($33\ \text{mg}$) |
Thân Màn màn hoa tím |
Flavonoid mang nhóm thế ester $p$-coumaroyl tại $\text{C-6}'''$ của đường glucose |
| 8 |
Cleomeside B (Mới) |
$\text{C}{44}\text{H}{48}\text{O}_{23}$ ($30\ \text{mg}$) |
Lá Màn màn hoa tím |
Cấu trúc như chất 7 có thêm nhóm acetyl tại vị trí $\text{C-4}''''$ của đường $\text{Rha II}$ ($\delta_\text{C}\ 172,5$) |
| 9 |
Visconoside A (Mới) |
$\text{C}{35}\text{H}{42}\text{O}_{21}$ ($250\ \text{mg}$) |
Lá Màn màn hoa vàng |
Khung quercetin, đường $\beta$-Glc nối vào vị trí C-3'' của $\alpha$-Rha tại C-3, nhóm acetyl gắn tại C-4'' của Rha I |
| 10 |
Visconoside B (Mới) |
$40\ \text{mg}$ |
Thân Màn màn hoa vàng |
Hợp chất flavonoid glycoside mới |
| 11 |
Kaempferol-3-$O$-methylether |
$8\ \text{mg}$ |
Lá Màn màn hoa vàng |
Dẫn xuất kaempferol methoxy hóa |
| 12 |
Kaempferol-3,4'-$O$-dimethylether |
$6\ \text{mg}$ |
Thân Màn màn hoa vàng |
Dẫn xuất kaempferol dimethoxy hóa |
| 13 |
Kaempferol-3-$O$-$\beta$-D-glucopyranoside |
$7\ \text{mg}$ |
Thân Màn màn hoa vàng |
Monoglycoside kaempferol |
| 14 |
Kaempferol-7-$O$-$\alpha$-L-rhamnopyranoside |
$22\ \text{mg}$ |
Thân Màn màn hoa vàng |
Monoglycoside kaempferol |
| 15 |
Kaempferol-3-$O$-(4-$O$-acetyl-$\alpha$-L-rhamnopyranoside) |
$16\ \text{mg}$ |
Lá Màn màn hoa vàng |
Kaempferol glycoside có nhóm acetyl |
| 16 |
Kaempferol-3-$O$-(2,4-$O$-diacetyl-$\alpha$-L-rhamnopyranoside) |
$11\ \text{mg}$ |
Thân Màn màn hoa tím |
Kaempferol glycoside có 2 nhóm acetyl |
| 17 |
Kaempferol-3,7-$O$-$\alpha$-L-dirhamnopyranoside |
$68\ \text{mg}$ |
Lá Màn màn hoa vàng |
Diglycoside kaempferol |
| 18 |
Kaempferol-3-$O$-$\beta$-D-glucopyranosyl-7-$O$-$\alpha$-L-rhamnopyranoside |
$2\ \text{g}$ |
Lá Màn màn hoa vàng |
Diglycoside kaempferol |
| 19 |
Kaempferol-3-$O$-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$6)-$O$-$\beta$-D-glucopyranoside |
$6\ \text{mg}$ |
Thân Màn màn hoa tím |
Diglycoside kaempferol (nhánh rutinoside) |
| 20 |
Cleomeside C (Mới) |
$17\ \text{mg}$ |
Thân Màn màn hoa tím |
Hợp chất mới |
| 21 |
Glycerol monostearate |
$20\ \text{mg}$ |
Lá Màn màn hoa tím |
Hợp chất lipid |
| 22 |
Ethyl $\alpha$-galactopyranoside |
$15\ \text{mg}$ |
Lá Màn màn hoa tím |
Hợp chất dẫn xuất carbohydrate |
| 23 |
Adenine |
$5\ \text{mg}$ |
Lá Màn màn hoa tím |
Base purine |
| 24 |
5-(Hydroxymethyl)-2-furaldehyde |
$8\ \text{mg}$ |
Thân Màn màn hoa vàng |
Hợp chất dị vòng aldehyde |
| 25 |
Emodin-8-$O$-$\beta$-D-glucopyranoside |
$12\ \text{mg}$ |
Thân Màn màn hoa tím |
Dẫn xuất anthraquinone glycoside |
Bên cạnh việc xác định cấu trúc, chương này trình bày các dữ liệu khảo sát khả năng gây độc tế bào và tác dụng phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế bào gan HepG2 do $\text{CCl}_4\ 2\ \text{mM}$ gây ra sau 24 giờ nuôi cấy của các cao chiết và 25 hợp chất tinh khiết.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Tổng hợp các phát hiện chính về thành phần hóa học và tác dụng sinh học; đưa ra các kiến nghị khoa học nhằm định hướng nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử và thử nghiệm in vivo.
Kết quả và những đóng góp mới
Những đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận
- Phát hiện 5 hợp chất mới lần đầu tiên từ thiên nhiên: Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc hoàn chỉnh của 5 hợp chất tự nhiên mới chưa từng được công bố trong cơ sở dữ liệu quốc tế (tra cứu trên SciFinder), bao gồm:
- Cleomeside A (Hợp chất 6): quercetin-3-$O$-[$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$2)]-$\alpha$-L-rhamnopyranoside-7-$O$-(4''''-acetyl)-$\alpha$-L-rhamnopyranoside ($\text{C}{35}\text{H}{42}\text{O}_{21}$).
- Cleomeside B (Hợp chất 8): quercetin-3-$O$-[2''-$O$-(6'''-$p$-coumaroyl)-$\beta$-D-glucopyranosyl]-$\alpha$-L-rhamnopyranoside-7-$O$-(4''''-acetyl)-$\alpha$-L-rhamnopyranoside ($\text{C}{44}\text{H}{48}\text{O}_{23}$).
- Visconoside A (Hợp chất 9): $\text{C}{35}\text{H}{42}\text{O}_{21}$.
- Visconoside B (Hợp chất 10).
- Cleomeside C (Hợp chất 20).
- Bổ sung hệ thống dữ liệu hóa học về chi Cleome: Phân lập tổng cộng 25 hợp chất tinh khiết từ lá và thân của hai loài Cleome chelidonii và Cleome viscosa, xây dựng bộ dữ liệu phổ đầy đủ ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY, HR-ESI-MS, UV-Vis, IR).
- Cung cấp bằng chứng dược lý thực nghiệm: Cung cấp cơ sở khoa học in vitro về độc tính tế bào và hiệu quả bảo vệ tế bào gan HepG2 chống lại tổn thương gây ra bởi chất độc chuyển hóa $\text{CCl}_4$.
Kiến nghị và định hướng ứng dụng
- Tiếp tục khảo sát hoạt tính bảo vệ gan của các hợp chất tiềm năng trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo).
- Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động ở mức độ biểu hiện gen và protein liên quan đến các con đường chống oxy hóa nội bào và chống apoptosis.
- Khai thác nguồn nguyên liệu Màn màn hoa tím và Màn màn hoa vàng có sẵn với trữ lượng lớn tại khu vực Nam Bộ và Tây Nguyên để định hướng phát triển các chế phẩm hỗ trợ bảo vệ gan.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế:
- Nghiên cứu giới hạn ở mô hình thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào ung thư biểu mô gan người HepG2, chưa tiến hành thử nghiệm đối chứng trên tế bào gan sơ cấp người hoặc trên mô hình động vật sống (in vivo).
- Nguồn mẫu thực vật khảo sát thu hái tại một địa điểm duy nhất (huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương) vào thời điểm tháng 10 năm 2012, chưa đánh giá sự biến thiên thành phần hóa học theo mùa, giai đoạn sinh trưởng hoặc điều kiện thổ nhưỡng khác nhau.
- Hướng nghiên cứu tiếp:
- Mở rộng quy mô bán tổng hợp hoặc chiết xuất lớn các hợp chất có hoạt tính cao (như hợp chất 4 và 18 thu được với khối lượng gam).
- Khảo sát các hoạt tính sinh học mở rộng khác của các dẫn xuất glycoside acetyl hóa và acyl hóa mới phân lập.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao đối với:
- Nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược và Dược học: Cung cấp quy trình chiết tách chi tiết, sơ đồ phân lập phân đoạn và phương pháp biện giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2D (HMBC, HSQC, COSY) đối với các cấu trúc flavonoid triglycoside phức tạp.
- Các nhà nghiên cứu Dược lý và Công nghệ sinh học: Tham khảo quy trình sàng lọc độc tính tế bào và mô hình thử nghiệm bảo vệ gan in vitro sử dụng dòng tế bào HepG2 cảm ứng bởi $\text{CCl}_4$.
- Cơ quan quản lý và doanh nghiệp phát triển dược liệu: Bổ sung dữ liệu tiêu chuẩn hóa thành phần hoạt chất cho hai loài cây thuốc dân gian phổ biến tại Việt Nam.
Câu hỏi thường gặp
1. Luận án đã phát hiện ra bao nhiêu hợp chất mới và đó là những hợp chất nào?
Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 5 hợp chất tự nhiên mới lần đầu tiên được phát hiện, bao gồm: Cleomeside A (hợp chất 6), Cleomeside B (hợp chất 8), Visconoside A (hợp chất 9), Visconoside B (hợp chất 10), và Cleomeside C (hợp chất 20). Các cấu trúc này đã được đối chiếu và xác nhận chưa từng công bố trên cơ sở dữ liệu SciFinder.
2. Hai loài thực vật nghiên cứu trong luận án được thu hái ở đâu và định danh bởi ai?
Mẫu thực vật gồm lá và thân cây Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.) và Màn màn hoa vàng (Cleome viscosa L.) được thu hái tại huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương vào tháng 10 năm 2012. Mẫu nghiên cứu được TS. Võ Văn Chi giám định tên khoa học.
3. Mô hình sinh học nào được sử dụng để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan?
Tác giả sử dụng mô hình tế bào in vitro trên dòng tế bào ung thư biểu mô gan người HepG2 nuôi cấy trong môi trường EMEM (bổ sung $10%\ \text{FCS}$, $2\ \text{mM}\ \text{L-glutamin}$, penicillin và streptomycin). Độc tính được cảm ứng bằng $\text{CCl}_4$ ở nồng độ $2\ \text{mM}$ trong 24 giờ. Tỷ lệ tế bào sống và tỷ lệ bảo vệ được xác định thông qua phương pháp đo quang phổ tạo màu MTT ở bước sóng $535\ \text{nm}$ (hoặc $570\ \text{nm}$), với chất đối chứng dương là Quercetin ($10\ \mu\text{M}$).
4. Nhóm hợp chất hóa học chiếm ưu thế nhất trong hai loài Màn màn khảo sát là gì?
Nhóm hợp chất chiếm ưu thế vượt trội là flavonoid, đặc biệt là các dẫn xuất flavonol glycoside của quercetin và kaempferol mang từ 1 đến 3 đơn vị đường (glucose, rhamnose) cùng các biến thể có nhóm thế acetyl hóa (như hợp chất 6, 8, 9, 15, 16) hoặc acyl hóa bởi gốc $p$-coumaroyl (như hợp chất 7, 8).
Kết luận
Luận án đã hoàn thành nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.) và Màn màn hoa vàng (Cleome viscosa L.) thu hái tại tỉnh Bình Dương. Từ 4 bộ mẫu nguyên liệu (thân và lá của 2 loài), tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc 25 hợp chất tinh khiết, trong đó có 5 hợp chất mới được đặt tên là Cleomeside A, B, C và Visconoside A, B. Toàn bộ các cao chiết và hợp chất phân lập đã được sàng lọc độc tính tế bào và đánh giá hiệu quả bảo vệ tế bào gan HepG2 trước độc chất $\text{CCl}_4$, cung cấp luận cứ khoa học thực nghiệm có giá trị cho việc sử dụng và phát triển nguồn dược liệu họ Cleomaceae tại Việt Nam.
