Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ hóa học của tác giả Vũ Thị Thu Lê có tiêu đề "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Nàng nàng (Callicarpa candicans) và loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla) ở Việt Nam", thuộc chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên (mã số: 9.44.01.17 / ghi trong văn bản: 9.17). Công trình được hoàn thành năm 2020 tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, trực thuộc Học viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Phạm Thị Hồng Minh và GS.TS. Phạm Quốc Long, với sự tài trợ kinh phí từ Chương trình hỗ trợ sau tiến sĩ (mã số GUST).

Về tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu, chi Tử châu (Callicarpa L.) thuộc họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) chứa nguồn hoạt chất thứ cấp phong phú, đặc biệt là các hợp chất diterpenoid và triterpenoid có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm và ức chế tế bào ung thư. Trên thế giới, nhiều loài trong chi đã được nghiên cứu về hóa thực vật và dược lý, nhưng ở Việt Nam, các nghiên cứu về hai loài Nàng nàng (Callicarpa candicans) và Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla) hầu như chưa được thực hiện một cách toàn diện; trước đó chỉ mới có một số khảo sát ban đầu về thành phần tinh dầu lá và hoạt tính diệt bọ gậy muỗi. Việc khảo sát hệ thống thành phần hóa học của dịch chiết, tinh dầu và đánh giá hoạt tính sinh học của hai loài này là cần thiết nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc khai thác nguồn tài nguyên dược liệu tự nhiên.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được văn bản xác định cụ thể gồm 3 nội dung:

  1. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ lá loài Nàng nàng (C. candicans) và Tử châu lá to (C. macrophylla) thu hái ở Việt Nam.
  2. Nghiên cứu thành phần hóa học trong tinh dầu loài Nàng nàng (C. candicans) và loài Tử châu lá to (C. macrophylla).
  3. Đánh giá hoạt tính gây độc trên một số dòng tế bào ung thư: gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) của các hợp chất sạch phân lập được.

Về đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: Các bộ phận lá, thân cành và quả của hai loài thực vật Callicarpa candicans (Burm. f.) Hochr. và Callicarpa macrophylla Vahl.
  • Phạm vi không gian: Mẫu thực vật được thu hái tại huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên.
  • Phạm vi thời gian: Mẫu được thu hái vào tháng 10 năm 2017. Mẫu thực vật do TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học, với các số hiệu tiêu bản lưu giữ tại Bảo tàng là CA20171001.HN (C. candicans) và CA20171002.HN (C. macrophylla).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các tư liệu về thực vật học, công dụng y học cổ truyền, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Callicarpa trên phạm vi quốc tế và tại Việt Nam:

Về phân loại thực vật học: Họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) tại Việt Nam được tác giả Vũ Xuân Phương (2007) mô tả gồm 26 chi, khoảng 140 loài và 21 thứ. Đối với chi Callicarpa, tác giả Võ Văn Chi thống kê có 14 loài; tác giả Phạm Hoàng Hộ ghi nhận 26 loài; các nhà thực vật học thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật ghi nhận 21 loài phân bố rải rác từ Bắc vào Nam (Tuyên Quang, Lạng Sơn, Sơn La, Bắc Kạn, Phú Thọ, Bắc Giang, Ba Vì, Thái Nguyên, Nghệ An, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Kon Tum, Đắk Lắk, Gia Lai, Bình Dương, Đồng Nai).

Về kinh nghiệm y học cổ truyền và tác dụng dược lý trên thế giới: Văn bản tổng hợp tư liệu về khoảng 20 loài thuộc chi Callicarpa:

  • C. americana: Ở Bắc Mỹ, Rafinesque ghi nhận việc dùng lá trị chứng phù thũng; rễ và cành dùng sắc nước trị thấp khớp, sốt rét, giảm đau bụng, hạ sốt; rễ dùng trị kiết lỵ và ung thư da.
  • C. rubella: Vỏ cây được sử dụng trong điều trị khối u ruột già ở Ấn Độ và chữa vết thương, bỏng ở Trung Quốc.
  • C. arborea: Vỏ cây dùng chữa bệnh ngoài da tại Ấn Độ, hạ sốt và chữa khó tiêu tại Nepal.
  • C. formosana: Y học dân gian Đài Loan dùng chữa bệnh thấp khớp, nhiễm trùng răng miệng, rối loạn tiêu hóa.
  • C. macrophylla: Được sử dụng tại Ấn Độ và Trung Quốc để trị loét miệng, ho, sốt, nhiễm trùng đường ruột, bệnh thấp khớp, tiêu chảy, kiết lỵ; phối hợp với C. cathayana để cầm máu trong và điều trị bỏng.
  • C. candicans: Dùng làm chất độc cá tại Philippines và Palau; tại Malaysia dùng điều hòa kinh nguyệt.
  • Các loài khác như C. bodinieri, C. cana, C. flavida, C. giraldii, C. integerrima, C. japonica, C. kochiana, C. lingii, C. longifolia, C. longissima, C. pedunculata, C. purpurea, C. reevesii, C. thozetii được sử dụng trị vết thương, đau răng, giun sán hoặc chống đông.

Về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới: Đã có hơn 200 hợp chất được phân lập từ chi Callicarpa, thuộc các nhóm:

  • Monoterpenoid: Hợp chất iridoid như nudifloside, linearoside (từ C. nudiflora ức chế tế bào ung thư máu K562), 4-terpineol, 6-O-trans-cinnamoylphlorigidoside B (từ C. formosana).
  • Sesquiterpenoid: β-caryophyllene, aromadendrene II, 7-epi-α-selinene, dendrolasin, 1-octen-3-ol, epiglobulol.
  • Diterpenoid: Các khung cấu trúc abietane, clerodane, labdane, phyllocladane, totarane, pimarane, isopimarane (như kochianic acid A-B, callicarpic acid A-B, macrophypene A, hardwickiic acid, calliterpenone monoacetate, 12-deoxy-11,12-dihydro-seco-hinokiol methyl ester từ C. pilosissima có hoạt tính kháng vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis H37Rv với MIC ≤ 63,6 µM).
  • Triterpenoid: Các khung ursane, oleane và lupane (ursolic acid, oleanolic acid, pomolic acid, myrianthic acid, sericoside, betulinic acid).
  • Flavonoid: Các dẫn xuất của flavone, flavonol và dạng glycoside (apigenin, luteolin, ayanin, penduletin, cynaroside, genkwanin).
  • Phenylethanoid và phenylpropanoid: Acteoside, forsythoside B, Z-tubuloside E, caffeic acid, syringic acid, ferulic acid; trong đó acteoside từ C. dichotoma thể hiện tác dụng bảo vệ thần kinh trước độc tính glutamate và cải thiện suy giảm nhận thức do scopolamine gây ra trên chuột.

Tình hình nghiên cứu trong nước và khoảng trống giải quyết: Trước luận án, các nghiên cứu trong nước mới dừng lại ở việc khảo sát thành phần tinh dầu lá của C. candicans và C. sinuata thu hái tại miền Trung bằng GC-MS và thử nghiệm hoạt tính diệt bọ gậy muỗi Aedes aegypti (ghi nhận LC50 sau 48 giờ của C. candicans là 2,1 và 3,8 µg/ml). Chưa có công trình nào nghiên cứu sâu về thành phần hóa học các phân đoạn chiết không bay hơi, chưa phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất sạch cũng như chưa đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hai loài C. candicans và C. macrophylla tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án tiếp cận theo phương pháp thực nghiệm của Hóa học các hợp chất thiên nhiên, kết hợp các kỹ thuật chiết xuất phân đoạn, sắc ký tách tinh chế, các phương pháp phổ nghiệm hiện đại để xác định cấu trúc phân tử và các thử nghiệm sinh học in vitro định lượng.

Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất

  • Xử lý nguyên liệu: Các bộ phận lá, thân cành và quả sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi bóng râm, sấy ở 60°C đến khối lượng không đổi và nghiền nhỏ.
  • Chiết phân đoạn: Mẫu bột được ngâm chiết 3 lần với methanol (hoặc ethanol) trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết gộp được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ dưới 50°C để thu cặn chiết tổng. Cặn tổng được hòa phân tán trong nước và chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexane và ethyl acetate, thu được các cặn chiết: cặn n-hexane, cặn ethyl acetate và cặn nước.
  • Tách chiết tinh dầu:
    1. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước bằng bộ cất vi lượng: Sử dụng 200 g lá mẫu, bình cầu dung tích 2 lít, thời gian chưng cất 3–4 giờ, nhiệt độ dòng nước ngưng tụ khống chế không quá 40°C.
    2. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có hỗ trợ vi sóng: Sử dụng 200 g mẫu, bình cầu 2 lít, công suất vi sóng 450 W, thời gian chưng cất 60 phút. Tinh dầu thu được được làm khan bằng Na2SO4 và bảo quản ở 4°C.

Phương pháp phân tích và phân lập hóa học

  • Sắc ký phân tích và điều chế:
    • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Bản mỏng tráng sẵn silica gel DC-Alufolien 60 F254 và pha đảo RP-18 F254S (độ dày 0,25 mm, Merck). Phát hiện vết chất dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 365 nm hoặc phun thuốc thử dung dịch vanilin – H2SO4 5% trong methanol rồi hơ nóng.
    • Sắc ký bản mỏng điều chế (PTLC).
    • Sắc ký cột (CC): Sử dụng pha tĩnh silica gel 60 (cỡ hạt 0,040–0,063 mm, 230–400 mesh, Merck), sắc ký rây phân tử Sephadex LH-20 (Merck) và sắc ký pha đảo YMC RP-18 (cỡ hạt 30–50 µm, Fujisilica Chemical Ltd.).
    • Hệ thống sắc ký lỏng kết nối khối phổ HPLC-MSD: Agilent 1200 Ion Trap.
  • Phân tích thành phần tinh dầu: Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) trên hệ thống Agilent Technologies HP7890A kết nối đầu dò phổ khối HP5975C, sử dụng cột mao quản HP5-MS (chiều dài 60 m × đường kính trong 0,25 mm × độ dày màng pha tĩnh 0,25 µm).

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

  • Phổ khối lượng (MS): Phổ ESI-MS đo trên thiết bị Agilent 1200 TRAP; phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy FT-ICR-Mass Spectrophotometer.
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker Avance 500 MHz (500 MHz cho phổ proton 1H và 125 MHz cho phổ carbon 13C), sử dụng chất chuẩn nội Tetramethylsilane (TMS). Các dung môi đo gồm DMSO-d6, CD3OD và CDCl3. Các kỹ thuật phổ gồm: phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và phổ hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY).
  • Điểm nóng chảy: Xác định trên máy Kofler micro-hotstage.
  • Năng suất quay cực ([α]D): Đo trên phân cực kế tự động JASCO DIP-1000 KUY.

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro

  • Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Sử dụng phương pháp Sulforhodamine B (SRB) và phương pháp MTT trên các dòng tế bào ung thư người gồm ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (Lu-1, A549), ung thư vú (MCF-7), và ung thư tiền liệt tuyến (PC3). Độc tính được biểu thị thông qua giá trị nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào (IC50).
  • Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và chỉ số chọn lọc (Selectivity Index, SI = IC50/MIC).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Đặc điểm chung về thực vật học chi Callicarpa

Chương này tổng kết cơ sở lý luận và tài liệu nghiên cứu về chi Callicarpa trên thế giới và tại Việt Nam:

  • Trình bày đặc điểm hình thái thực vật học họ Verbenaceae và các khóa định loại chi Callicarpa.
  • Thống kê chi tiết công dụng trong y học dân gian của các loài thuộc chi trên thế giới (Bảng 1.1 trong luận án).
  • Phân loại và tổng hợp cấu trúc hóa học của hơn 200 hợp chất đã biết thuộc các nhóm monoterpenoid, sesquiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid, flavonoid, phenylethanoid và phenylpropanoid.
  • Tổng quan các kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học: kháng viêm, điều hòa miễn dịch, cầm máu, bảo vệ tế bào thần kinh, chống suy giảm trí nhớ, ức chế vi khuẩn lao, giảm đau, chống oxy hóa, kháng khuẩn và diệt côn trùng.

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết toàn bộ quy trình thực nghiệm, địa điểm lấy mẫu và các thông số thiết bị:

  • Ghi nhận thông tin mẫu thực vật lá, thân cành, quả của C. candicans (số hiệu CA20171001.HN) và C. macrophylla (số hiệu CA20171002.HN) thu hái tại huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên vào tháng 10/2017.
  • Trình bày quy trình chiết xuất mẫu bằng siêu âm với methanol/ethanol và chiết phân bố lỏng - lỏng phân đoạn với n-hexane và ethyl acetate.
  • Thiết lập quy trình chưng cất tinh dầu bằng bộ cất vi lượng và chưng cất có hỗ trợ vi sóng.
  • Trình bày 6 sơ đồ quy trình phân lập các cặn chiết (Sơ đồ 3.1 đến 3.6): Sơ đồ ngâm chiết và phân lập cặn n-hexane, cặn ethyl acetate của lá cây Tử châu lá to (C. macrophylla) và cây Nàng nàng (C. candicans).
  • Mô tả các phương pháp phổ nghiệm (ESI-MS, HR-ESI-MS, 1D/2D-NMR, điểm nóng chảy, độ quay cực) và quy trình thử nghiệm hoạt tính sinh học (SRB, MTT, thử vi sinh vật kiểm định).

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm và biện giải cấu trúc hóa học cũng như kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học:

  1. Thành phần hóa học của tinh dầu:

    • Phân tích GC-MS thành phần hóa học tinh dầu lá tươi, lá khô, hoa loài Nàng nàng (C. candicans) và tinh dầu lá tươi loài Tử châu lá to (C. macrophylla), so sánh kết quả thu được giữa phương pháp chưng cất thông thường và phương pháp có hỗ trợ vi sóng.
  2. Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất: Từ lá của hai loài nghiên cứu, tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của 18 hợp chất sạch, bao gồm 2 hợp chất mới (M1 và M8).

Ký hiệu Tên hợp chất Nhóm hợp chất Loài phân lập Tình trạng cấu trúc
M1 Callimacrophylla A Diterpenoid C. macrophylla Hợp chất mới
M7 ent-1β-acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on Diterpenoid C. macrophylla Đã biết
C5 Seco-hinokiol Diterpenoid C. candicans Đã biết
C6 Methyl seco-hinokiol Diterpenoid C. candicans Đã biết
M8 Callimacrophylla B Triterpenoid C. macrophylla Hợp chất mới
M2 3β-hydroxyolean-12-ene Triterpenoid C. macrophylla Đã biết
M3 β-amyrin Triterpenoid C. macrophylla Đã biết
M10 Oleanolic acid Triterpenoid C. macrophylla Đã biết
M6 Ursolic acid Triterpenoid C. macrophylla Đã biết
C7 2α-hydroxy-ursolic acid Triterpenoid C. candicans Đã biết
C8 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid Triterpenoid C. candicans Đã biết
M5 Spinasterol Steroid C. macrophylla Đã biết
M4 β-sitosterol Steroid C. macrophylla Đã biết
M9 Daucosterol Steroid glycoside C. macrophylla Đã biết
C1 5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon Flavonoid C. candicans Đã biết
C3 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon Flavonoid C. candicans Đã biết
C9 Genkwanin Flavonoid C. candicans Đã biết
C10 Cynaroside Flavonoid glycoside C. candicans Đã biết
  • Biện giải cấu trúc các hợp chất tiêu biểu:
    • Hợp chất mới Callimacrophylla A (M1): Xác định cấu trúc khung diterpenoid dựa trên dữ liệu phổ HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC và các tương tác tương quan dị hạt nhân HMBC giữa proton và carbon.
    • Hợp chất mới Callimacrophylla B (M8): Xác định cấu trúc khung triterpenoid dựa trên dữ liệu phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS, kết hợp phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, phổ tương tác proton-proton 1H-1H COSY và phổ tương tác không gian NOESY.
    • Các hợp chất diterpenoid đã biết (M7, C5, C6), triterpenoid (M2, M3, M10, M6, C7, C8), steroid (M5, M4, M9) và flavonoid (C1, C3, C9, C10) được xác định cấu trúc thông qua việc so sánh các giá trị độ dịch chuyển hóa học δH, δC, hằng số tương tác J với tài liệu tham khảo tương ứng.
  1. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học:
    • Hoạt tính sinh học của tinh dầu: Đánh giá độc tính tế bào in vitro của tinh dầu lá Nàng nàng và tinh dầu lá tươi Tử châu lá to trên 3 dòng tế bào ung thư người (Hep-G2, PC3, A549) và đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.
    • Hoạt tính gây độc tế bào của các cặn chiết: Thử nghiệm trên các cặn chiết tổng methanol từ lá, quả, thân cành và các cặn phân đoạn chiết n-hexane, ethyl acetate từ lá cây Tử châu lá to và cây Nàng nàng.
    • Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất sạch: Đánh giá in vitro trên 3 dòng tế bào ung thư gồm ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (Lu-1) và ung thư vú (MCF-7).

Kết quả và những đóng góp mới

Căn cứ theo văn bản luận án, các kết quả và đóng góp mới của công trình bao gồm:

  1. Đóng góp mới về khoa học và lý luận:

    • Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 02 hợp chất mới từ lá loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla Vahl), được đặt tên là Callimacrophylla A (M1, thuộc lớp diterpenoid) và Callimacrophylla B (M8, thuộc lớp triterpenoid).
    • Phân lập và xác định cấu trúc của 16 hợp chất đã biết khác thuộc các lớp chất diterpenoid, triterpenoid, steroid và flavonoid từ lá của hai loài Callicarpa macrophylla và Callicarpa candicans.
    • Cung cấp dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D-NMR, phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS và các hằng số vật lý của các hợp chất phân lập, bổ sung vào cơ sở dữ liệu hóa học các hợp chất tự nhiên chi Callicarpa.
  2. Đóng góp mới về mặt thực tiễn:

    • Cung cấp dữ liệu chi tiết về thành phần hóa học tinh dầu từ lá tươi, lá khô, hoa của loài Nàng nàng (C. candicans) và lá tươi loài Tử châu lá to (C. macrophylla) bằng kỹ thuật GC-MS, đồng thời đánh giá hiệu quả của phương pháp chưng cất có hỗ trợ vi sóng.
    • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung thư người (Hep-G2, Lu-1, MCF-7, PC3, A549) và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các mẫu tinh dầu, cặn chiết phân đoạn và các hợp chất tinh khiết phân lập được, làm cơ sở khoa học định hướng nghiên cứu ứng dụng nguồn dược liệu.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Về hạn chế của luận án (dựa trên phạm vi và nội dung thực nghiệm được trình bày trong văn bản):

  • Mẫu thực vật nghiên cứu chỉ được thu thập tại một địa bàn duy nhất (huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên) vào một thời điểm (tháng 10 năm 2017), chưa khảo sát biến động hàm lượng hoạt chất và thành phần tinh dầu theo các mùa khác nhau trong năm hoặc tại các vùng sinh thái địa lý khác nhau ở Việt Nam.
  • Các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học mới chỉ thực hiện ở quy mô in vitro trên một số dòng tế bào ung thư và chủng vi sinh vật kiểm định, chưa có điều kiện đánh giá cơ chế tác động phân tử chuyên sâu hoặc thử nghiệm in vivo trên động vật thực nghiệm.

Về hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Mở rộng phạm vi thu thập mẫu ở các vùng phân bố khác nhau nhằm đánh giá sự biến thiên về thành phần hóa học và hàm lượng các hoạt chất chính.
  • Tiến hành nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động dược lý, động học tế bào và thử nghiệm in vivo đối với các hợp chất mới và các hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc tế bào tốt.

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

  • Đối tượng sử dụng: Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên, giảng viên và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược, Dược học, Thực vật học và Công nghệ sinh học.
  • Nội dung tham khảo:
    • Quy trình thực nghiệm chiết xuất phân đoạn và sơ đồ phân lập các hợp chất diterpenoid, triterpenoid, flavonoid bằng các kỹ thuật sắc ký cột silica gel, Sephadex LH-20, pha đảo RP-18 và HPLC.
    • Phương pháp phân tích, quy gán tín hiệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D-NMR (1H-1H COSY, NOESY, HSQC, HMBC) kết hợp HR-ESI-MS trong việc giải đoán cấu trúc các hợp chất tự nhiên mới.
    • Quy trình chiết xuất tinh dầu có hỗ trợ vi sóng và phương pháp phân tích thành phần cấu tử tinh dầu bằng GC-MS.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phát hiện những hợp chất mới nào và thuộc khung cấu trúc nào?
Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 02 hợp chất mới từ lá loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla Vahl), gồm: hợp chất Callimacrophylla A (ký hiệu M1, thuộc nhóm diterpenoid) và hợp chất Callimacrophylla B (ký hiệu M8, thuộc nhóm triterpenoid).

2. Mẫu thực vật nghiên cứu được thu hái ở đâu, vào thời gian nào và được lưu trữ tiêu bản tại cơ quan nào?
Mẫu lá, thân cành và quả của hai loài Nàng nàng (Callicarpa candicans) và Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla) được thu hái tại huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên vào tháng 10 năm 2017. Tên khoa học do TS. Nguyễn Quốc Bình giám định; các tiêu bản được lưu trữ tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam với số hiệu CA20171001.HN (C. candicans) và CA20171002.HN (C. macrophylla).

3. Tinh dầu của hai loài cây được chiết xuất và phân tích bằng những phương pháp nào?
Tinh dầu được chiết xuất bằng 2 phương pháp: chưng cất lôi cuốn hơi nước dùng bộ cất vi lượng (3–4 giờ, nhiệt độ nước ngưng không quá 40°C) và chưng cất lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng (công suất 450 W, thời gian 60 phút). Thành phần hóa học tinh dầu được phân tích trên hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS Agilent Technologies HP7890A kết nối đầu dò HP5975C với cột HP5-MS (60 m × 0,25 mm × 0,25 µm).

4. Cấu trúc hóa học của các hợp chất sạch được xác định bằng các kỹ thuật phổ nghiệm nào?
Cấu trúc được xác định thông qua phổ khối lượng ESI-MS (Agilent 1200 TRAP), phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (FT-ICR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân đo trên máy Bruker Avance 500 MHz gồm phổ 1D (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và phổ 2D (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY), kết hợp đo điểm nóng chảy trên máy Kofler micro-hotstage và độ quay cực trên máy JASCO DIP-1000 KUY.

5. Hoạt tính sinh học của các hợp chất sạch và cặn chiết được đánh giá trên các dòng tế bào ung thư nào?
Hoạt tính gây độc tế bào in vitro được đánh giá theo phương pháp SRB và MTT trên các dòng tế bào ung thư người gồm ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (Lu-1, A549), ung thư vú (MCF-7), ung thư tiền liệt tuyến (PC3), cùng với thử nghiệm kháng vi sinh vật kiểm định.

Kết luận

Luận án của tác giả Vũ Thị Thu Lê đã nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Callicarpa candicans và Callicarpa macrophylla thu hái tại Thái Nguyên, Việt Nam. Công trình đã phân lập và xác định cấu trúc của 18 hợp chất sạch, trong đó phát hiện 02 hợp chất mới là Callimacrophylla A (diterpenoid) và Callimacrophylla B (triterpenoid), đồng thời phân tích thành phần tinh dầu bằng GC-MS. Các kết quả thử nghiệm độc tính tế bào in vitro và kháng vi sinh vật kiểm định đã cung cấp hệ thống dữ liệu thực nghiệm phục vụ công tác nghiên cứu hóa thực vật và định hướng sử dụng nguồn dược liệu thuộc chi Callicarpa.