Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 2 loài markhamia stipulata var canaense v s dang và stereospermum binhchauensis v s dang thuộc họ quao bignoniaceae

Luận án tiến sĩ hóa học nghiên cứu nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 2 loài markhamia stipulata var canaense v s, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý

• Tác giả: Ngô Trọng Nghĩa
• Người hướng dẫn: PGS. Mai Đình Trị
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hóa Học Và Hoạt Tính Sinh Học Của Markhamia Stipulata Và Stereospermum Binhchauensis
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về loài Markhamia stipulata var.
• 1.2. Mô tả thực vật
• 1.3. Các nghiên cứu về dược lý
• 1.4. Các nghiên cứu về thành phần hóa học
• 1.5. Giới thiệu chung về loài Stereospermum binhchauensis V.
• 1.6. Mô tả thực vật
• 1.7. Các nghiên cứu về dược lý
• 1.8. Các nghiên cứu về thành phần hóa học
• 1.9. Hoạt tính gây độc tế bào
• 1.10. Các dòng tế bào được thử nghiệm
• 1.11. Phương pháp thử hoạt tính độc tế bào
• 1.12. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase
• 1.13. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp phân lập
• 2.3. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
• 2.4. Phương pháp xác định cấu trúc
• 2.4.1. Phương pháp phổ tử ngoại (UV)
• 2.4.2. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
• 2.4.3. Phương pháp khối phổ (MS)
• 2.4.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
• 2.5. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
• 3. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM
• 3.1. Điều chế các cao chiết
• 3.1.1. Điều chế cao chiết từ lá cây thiết đinh Cà Ná
• 3.1.2. Điều chế cao chiết từ lá cây quao Bình Châu
• 3.2. Phân lập các hợp chất
• 3.2.1. Phân lập các hợp chất từ lá cây thiết đinh Cà Ná
• 3.2.2. Phân lập các hợp chất từ lá cây quao Bình Châu
• 3.3. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được từ cây thiết đinh Cà Ná
• 3.4. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được từ quao Bình Châu
• 3.5. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được
• 3.5.1. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase
• 3.5.2. Hoạt tính gây độc tế bào
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Phân lập các hợp chất
• 4.1.1. Phân lập các hợp chất từ lá cây thiết đinh Cà Ná
• 4.1.2. Phân lập các hợp chất từ lá cây quao Bình Châu
• 4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất
• 4.2.1. 1-hexadecanoyl-sn-glycerol (MS16)
• 4.2.2. Chrysin 5,7-dimethyl ether (SB01)
• 4.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được
• 4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào
• 4.3.2. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase
• 4.4. Nhận xét chung
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Nghiên cứu hóa học

Nghiên cứu hóa học của Markhamia stipulata và Stereospermum binhchauensis tập trung vào việc phân lập và xác định các hợp chất hóa học có trong hai loài thực vật này. Các phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đã được áp dụng để phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất. Kết quả cho thấy hai loài này chứa nhiều hợp chất có giá trị, bao gồm các dẫn xuất phenol, flavonoid, và triterpenoid. Việc phân tích thành phần hóa học không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc của các hợp chất mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới cho việc ứng dụng trong y học và dược phẩm. Theo nghiên cứu, các hợp chất như lapachol và β-sitosterol đã được xác định có hoạt tính sinh học đáng kể, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh. Những phát hiện này khẳng định giá trị của Markhamia stipulata và Stereospermum binhchauensis trong việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên.

1.1. Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của Markhamia stipulata và Stereospermum binhchauensis đã được nghiên cứu kỹ lưỡng. Các hợp chất được phân lập từ lá và thân của hai loài này cho thấy sự đa dạng về cấu trúc và hoạt tính. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các hợp chất phenolic có trong Markhamia stipulata có khả năng kháng viêm và chống oxy hóa. Hơn nữa, các flavonoid được phân lập từ Stereospermum binhchauensis cũng cho thấy hoạt tính kháng khuẩn và kháng virus. Việc xác định các hợp chất này không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên thực vật mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất này để xác định tiềm năng ứng dụng trong y học.

II. Hoạt tính sinh học

Hoạt tính sinh học của Markhamia stipulata và Stereospermum binhchauensis đã được đánh giá thông qua các thử nghiệm gây độc tế bào và ức chế enzyme. Các hợp chất phân lập từ hai loài này cho thấy khả năng ức chế enzyme α-glucosidase, một enzyme quan trọng trong quá trình chuyển hóa carbohydrate. Kết quả thử nghiệm cho thấy một số hợp chất có giá trị IC50 thấp, cho thấy tiềm năng trong việc điều trị bệnh tiểu đường. Ngoài ra, hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất cũng được nghiên cứu trên các dòng tế bào ung thư, cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Những phát hiện này không chỉ khẳng định giá trị của hai loài thực vật này trong y học mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới cho việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn.

2.1. Hoạt tính gây độc tế bào

Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ Markhamia stipulata và Stereospermum binhchauensis đã được thử nghiệm trên nhiều dòng tế bào khác nhau. Kết quả cho thấy một số hợp chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư với nồng độ ức chế đáng kể. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các hợp chất phenolic có trong hai loài này có khả năng gây độc tế bào, mở ra cơ hội cho việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư. Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các hợp chất này sẽ giúp xác định rõ hơn tiềm năng ứng dụng trong điều trị ung thư và các bệnh lý khác.

2.2. Hoạt tính ức chế enzyme

Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất từ Markhamia stipulata và Stereospermum binhchauensis đã được đánh giá thông qua các thử nghiệm in vitro. Kết quả cho thấy một số hợp chất có khả năng ức chế enzyme này với giá trị IC50 thấp, cho thấy tiềm năng trong việc điều trị bệnh tiểu đường. Việc phát hiện ra các hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme không chỉ có ý nghĩa trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới mà còn góp phần vào việc cải thiện sức khỏe cộng đồng. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa các hợp chất này để phát triển các sản phẩm an toàn và hiệu quả hơn.

III. Giá trị và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu về Markhamia stipulata và Stereospermum binhchauensis không chỉ có giá trị khoa học mà còn có ứng dụng thực tiễn cao. Các hợp chất phân lập từ hai loài này có thể được ứng dụng trong sản xuất dược phẩm, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên ngày càng trở nên quan trọng trong bối cảnh người tiêu dùng ngày càng quan tâm đến sức khỏe và an toàn thực phẩm. Hơn nữa, việc bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên thực vật cũng là một vấn đề cấp bách trong bối cảnh biến đổi khí hậu và sự suy giảm đa dạng sinh học. Nghiên cứu này góp phần làm rõ hơn về giá trị của các loài thực vật bản địa và mở ra hướng đi mới cho việc phát triển bền vững nguồn tài nguyên thiên nhiên.

3.1. Ứng dụng trong y học

Các hợp chất từ Markhamia stipulata và Stereospermum binhchauensis có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm y học mới. Việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất này có thể dẫn đến việc sản xuất các loại thuốc mới có hiệu quả cao và ít tác dụng phụ. Hơn nữa, các hợp chất này có thể được sử dụng để điều trị nhiều loại bệnh khác nhau, từ bệnh tiểu đường đến ung thư. Việc ứng dụng các hợp chất thiên nhiên trong y học không chỉ giúp cải thiện sức khỏe cộng đồng mà còn góp phần vào việc bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên thực vật.

3.2. Ứng dụng trong công nghiệp

Ngoài ứng dụng trong y học, các hợp chất từ Markhamia stipulata và Stereospermum binhchauensis còn có thể được ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Các hợp chất có hoạt tính sinh học cao có thể được sử dụng làm nguyên liệu cho các sản phẩm thực phẩm chức năng, giúp nâng cao sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật. Trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, các hợp chất này có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm chăm sóc da an toàn và hiệu quả. Việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên không chỉ đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng mà còn góp phần vào việc bảo vệ môi trường.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa với hệ thực vật phong phú, cung cấp nhiều nguồn dược liệu phục vụ nhu cầu chăm sóc sức khỏe. Việc phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên đóng vai trò thiết thực trong nghiên cứu phát triển dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm. Chi Markhamia và chi Stereospermum thuộc họ Quao (Bignoniaceae) phân bố phổ biến ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới châu Phi và châu Á (bao gồm Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Trung Quốc). Nhiều loài trong hai chi này đã được ghi nhận có các hoạt tính sinh học như gây độc tế bào ung thư, hạ đường huyết, kháng khuẩn, kháng viêm, giảm đau và chống oxy hóa.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án chỉ rõ xuất phát từ thực tế phân loại học: Thiết đinh Cà Ná (Markhamia stipulata var. dang) và quao Bình Châu (Stereospermum binhchauensis V. Dang) là hai loài/thứ thực vật mới thuộc họ Quao, được TS. Đặng Văn Sơn phát hiện và công bố vào năm 2015. Cho đến thời điểm tác giả triển khai nghiên cứu, chưa có bất kỳ công bố khoa học nào trong và ngoài nước về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của hai loài thực vật này. Do đó, luận án được thực hiện nhằm cung cấp các cứ liệu khoa học đầu tiên về hóa thực vật và tác dụng sinh học của hai loài.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 2 mục tiêu:

1. Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu của hai loài Markhamia stipulata var. dang và Stereospermum binhchauensis V. Dang ở Việt Nam.
2. Đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được để tìm kiếm các hoạt chất tiềm năng.

Nội dung nghiên cứu chính được triển khai gồm 3 nội dung:

1. Phân lập các hợp chất từ lá cây thiết đinh Cà Ná (Markhamia stipulata var. dang) và lá cây quao Bình Châu (Stereospermum binhchauensis V. Dang).
2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập.
3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của một số hợp chất phân lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Lá cây thiết đinh Cà Ná (Markhamia stipulata var. dang) và lá cây quao Bình Châu (Stereospermum binhchauensis V. Dang) thuộc họ Quao (Bignoniaceae). Mẫu thực vật do TS. Đặng Văn Sơn (Viện Sinh học nhiệt đới) giám định tên khoa học; mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Phòng các chất có hoạt tính sinh học thuộc Viện Công nghệ Hóa học (mã số No.VH/PHAT-0616 đối với thiết đinh Cà Ná và No.VH/PHAT-0616B đối với quao Bình Châu).
• Phạm vi không gian: Mẫu lá thiết đinh Cà Ná được thu hái tại khu vực Cà Ná, huyện Thuận Nam, tỉnh Ninh Thuận. Mẫu lá quao Bình Châu được thu hái tại Khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phước Bửu, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu.
• Phạm vi thời gian: Mẫu nguyên liệu của hai loài được thu thập vào tháng 6 năm 2016; toàn bộ các nội dung thực nghiệm, phân tích dữ liệu phổ học và thử nghiệm sinh học in vitro được hoàn thành và bảo vệ trong năm 2020.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng thuật có hệ thống các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các loài thuộc hai chi Markhamia và Stereospermum:

1. Chi Markhamia: Chi Markhamia có khoảng 6 loài, tại Việt Nam có loài Markhamia stipulata gồm 2 thứ. Thứ mới Markhamia stipulata var. dang được công bố trên tạp chí Taiwania năm 2015. Luận án điểm lại các công trình tiêu biểu:

• Về thành phần hóa học: Ghi nhận sớm nhất năm 1978 của Joshi K. và cộng sự phân lập 8 hợp chất từ gỗ thân Markhamia stipulata gồm dehydro-α-lapachone (1), lapachol (2), dehydro-iso-α-lapachone (3), β-sitosterol (4), β-lapachone (5), tectol (6), paulownin (7), palmitone (8). Vỏ thân loài này tiếp tục được ghi nhận có dehydrotectol (9) và tectoquinone (10); lá và cành chứa 19 hợp chất gồm phenethyl glycoside (verbascoside 13, isoverbascoside 14, 2''-O-apiosylverbascoside 23, decaffeoylverbascoside 22, luteoside A 15, luteoside B 16, markhamioside A–F 30–35...). Ở các loài khác, Gormann R. và cộng sự (2006) phân lập 8 flavonoid từ lá M. acuminata; Kernan M. và cộng sự (1998) phân lập 5 dẫn xuất phenol từ rễ M. lutea; Lacroix D. và cộng sự (2009) phân lập các cycloartane (musambin A–C 44–46, musambioside A–C 47–49) và triterpene từ lá M. lutea; Nchu F. và cộng sự (2010) phân lập 3 triterpenoid từ lá M. obtusifolia; Joshi K. và cộng sự (1985) phân lập các naphthoquinone và lignan từ gỗ M. platycalyx; Tantangmo F. và cộng sự (2010) phân lập anthraquinone từ vỏ thân M. tomentosa; Khana M. (1999) phân lập sterol từ M. zanzibarica.
• Về hoạt tính dược lý: Dẫn xuất phenol từ rễ M. lutea kháng virus hợp bào hô hấp RSV với EC50 từ 0,8 đến 15,5 µg/mL (Kernan M. và cộng sự, 1998); các cycloartane từ lá M. lutea kháng ký sinh trùng Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei brucei, Leishmania donovani và gây độc tế bào ung thư KB, MRC5 (Lacroix D. và cộng sự, 2009); triterpene từ M. obtusifolia ức chế nấm Candida albicans (MIC 12,5–100 µg/mL) và dịch chiết nước chống sán Trichostrongylus colubriformis với EC50 0,46 mg/mL (Nchu F. và cộng sự, 2010, 2011); dịch chiết lá M. platycalyx có hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, bảo vệ gan (El Dib R.A. và cộng sự, 2014); tinh dầu lá M. platycalyx ức chế vi khuẩn Escherichia coli với MIC 7,48 µg/mL (Basma K. và cộng sự, 2015); anthraquinone từ M. tomentosa kháng sốt rét và gây độc tế bào L-6 (Tantangmo F. và cộng sự, 2010); dịch chiết cồn lá M. zanzibarica ức chế dòng tế bào HeLa với IC50 9,68 µg/mL (Dina M. và cộng sự, 2016).

2. Chi Stereospermum: Chi Stereospermum gồm khoảng 20 loài, Việt Nam có 4 loài (S. colais, S. annamense, S. cylindricum, S. neuranthum). Loài Stereospermum binhchauensis V. Dang được công bố trên tạp chí Acta Phytotaxonomica et Geobotanica năm 2015. Các nghiên cứu trước đây được điểm lại gồm:

• Về thành phần hóa học: Ghi nhận sớm nhất năm 1968 với lapachol và dẫn xuất naphthoquinone từ rễ S. suaveolens. Ramsay K. và cộng sự (2012) phân lập 21 hợp chất từ vỏ thân S. acuminatissimum (sterequinone A, F, H; zenkequinone A, B; atranorin 125...). Ghogomu-Tih R. và cộng sự (1985), Lenta B.N. và cộng sự (2007) phân lập các anthraquinone từ S. zenkeri. Kingsley R. và cộng sự (2013) phân lập iridoid và dẫn xuất phenol từ rễ S. tetragonum.
• Về hoạt tính dược lý: Atranorin từ S. acuminatissimum ức chế enzyme urease với IC50 18,2 µM (Ramsay K. và cộng sự, 2012); cao lá S. colais có hoạt tính chống oxy hóa (IC50 36 µg/mL) và làm lành vết thương (Balasubramanian và cộng sự, 2010); naphthoquinone và anthraquinone từ S. kunthianum kháng P. falciparum (IC50 1,3–23,3 µg/mL) và độc tế bào ECV-304 (Onegi và cộng sự, 2002); hợp chất verminoside từ S. personatum kháng oxy hóa (SC50 7,88 µM) và specioside ức chế xanthine oxidase với IC50 79,88 µM (Kumar U. và cộng sự, 2005); dịch chiết ethanol vỏ S. suaveolens hạ đường huyết trên chuột ở liều 200 và 400 mg/kg (Aruna G. và cộng sự, 2014); hợp chất từ rễ S. tetragonum hạ đường huyết ở liều 2 mg/kg (Kingsley R.B. và cộng sự, 2013); zenkequinone B từ S. zenkeri kháng khuẩn Pseudomonas aeruginosa với MIC 9,50 µg/mL (Lenta B.N. và cộng sự, 2007).

Chi thực vật	Loài nghiên cứu tiêu biểu	Tác giả và năm	Hợp chất / Phân đoạn chính	Hoạt tính sinh học ghi nhận
Markhamia	M. lutea	Kernan M. và cs. (1998)	Dẫn xuất phenol (13–17)	Kháng virus RSV (EC50 0,8–15,5 µg/mL)
Markhamia	M. lutea	Lacroix D. và cs. (2009)	Cycloartane (44–48)	Kháng P. falciparum, độc tế bào KB, MRC5
Markhamia	M. obtusifolia	Nchu F. và cs. (2010, 2011)	Triterpenoid (52–54)	Ức chế Candida albicans, chống sán
Markhamia	M. tomentosa	Tantangmo F. và cs. (2010)	Anthraquinone (55–56)	Kháng ký sinh trùng sốt rét, độc tế bào L-6
Markhamia	M. zanzibarica	Dina M. và cs. (2016)	Dịch chiết cồn từ lá	Ức chế tế bào HeLa (IC50 9,68 µg/mL)
Stereospermum	S. acuminatissimum	Ramsay K. và cs. (2012)	Atranorin (125)	Ức chế enzyme urease (IC50 18,2 µM)
Stereospermum	S. kunthianum	Onegi và cs. (2002)	Naphthoquinone, anthraquinone	Kháng P. falciparum, độc tế bào ECV-304
Stereospermum	S. personatum	Kumar U. và cs. (2005)	Verminoside (92), specioside	Chống oxy hóa, ức chế xanthine oxidase
Stereospermum	S. suaveolens	Aruna G. và cs. (2014)	Dịch chiết ethanol vỏ cây	Hạ đường huyết trên chuột (200–400 mg/kg)
Stereospermum	S. tetragonum	Kingsley R.B. và cs. (2013)	Hợp chất (126–127)	Hạ đường huyết ở liều 2 mg/kg

Vị trí của luận án: Luận án giải quyết khoảng trống dữ liệu khoa học về hai loài mới Markhamia stipulata var. dang và Stereospermum binhchauensis V. Dang. Nghiên cứu xác lập dữ liệu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ban đầu, đặt nền móng cho việc phân loại hóa thực vật và định hướng ứng dụng tài nguyên cây thuốc thuộc họ Bignoniaceae tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án tiếp cận theo hướng hóa học các hợp chất thiên nhiên thực nghiệm kết hợp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro. Các cơ sở lý thuyết và phương pháp phân tích gồm:

1. Cơ sở lý thuyết chiết tách và sắc ký: Áp dụng nguyên lý hòa tan và phân bố chất tan giữa hai pha không trộn lẫn để chiết xuất các nhóm chất từ thực vật. Kỹ thuật chiết ngâm dầm với dung môi ethanol 96% có hỗ trợ siêu âm giúp tăng hiệu suất thu hồi chất. Quá trình phân tách sơ bộ dịch chiết sử dụng phương pháp phân bố lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexane, ethyl acetate, nước). Quá trình phân lập và tinh chế hợp chất thực hiện bằng:

• Sắc ký lớp mỏng (TLC): Bản mỏng pha thường tráng sẵn silica gel DC-Alufolien 60 F254 (Merck). Phát hiện chất dưới đèn tử ngoại ở bước sóng λ = 254 nm và 365 nm, hoặc phun thuốc thử dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và hơ nóng trên bếp điện.
• Sắc ký cột (CC): Sử dụng chất hấp phụ là silica gel pha thường cỡ hạt 230–240 mesh (Merck), silica gel pha đảo C18 (Merck), và hạt nhựa macroporous Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical).

2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Cấu trúc phân tử của các hợp chất tinh khiết được xác định bằng các phương pháp phổ học hiện đại:

• Độ quay cực ([α]D): Đo trên máy phân cực kế Krüss-optronic GmbH, sử dụng đèn natri bước sóng 589 nm với ống đo chiều dài l = 0,5 dm tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
• Phổ tử ngoại (UV): Quét trên hệ thống sắc ký lỏng cao áp đầu dò dãy diod HPLC-DAD Agilent 1260, mẫu pha trong dung môi methanol.
• Phổ hồng ngoại (IR): Đo trên máy quang phổ Bruker Tensor 27 FT-IR dưới dạng viên nén KBr hoặc pha mẫu trong dung môi methanol tại Viện Công nghệ Hóa học.
• Phổ khối lượng (MS): Đo khối lượng phân giải cao một lần (HR-ESI-MS) và hai lần (HR-ESI-MS/MS) trên máy Bruker MicrOTOF-QII và LC-X500R QTOF; đo phổ khối thông thường trên máy UPLC-MSQ Plus (Thermo, Hoa Kỳ).
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR (tần số 500 MHz cho 1H và 125 MHz cho 13C) tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu hòa tan trong dung môi deuterated (như methanol-d4, CDCl3), sử dụng tetramethylsilane (TMS) làm chất nội chuẩn. Các kỹ thuật phổ gồm phổ 1D (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT-90, DEPT-135) và phổ 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY, ROESY).

3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học:

• Thử nghiệm độc tế bào in vitro: Thử nghiệm trên 5 dòng tế bào ung thư gồm tế bào ung thư vú MCF-7, tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, tế bào ung thư gan HepG2, tế bào ung thư phổi NCI-H460, và tế bào ung thư máu Jurkat (nguồn ATCC). Tế bào được nuôi cấy ở 37 °C, 5% CO2 trong môi trường Eagle’s Minimal Essential Medium (MEM) bổ sung 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES, 0,025 µg/mL amphotericin B, 100 IU/mL penicillin G và 100 µg/mL streptomycin tại Phòng Thí nghiệm sinh học phân tử - Bộ môn Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TP.HCM. Đối chứng dương sử dụng camptothecin. Mật độ quang được đo trên máy Synergy HT Biotek.
• Thử nghiệm ức chế enzyme α-glucosidase in vitro: Dựa trên phản ứng thủy phân cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNPG) bởi enzyme α-glucosidase (nguồn từ nấm men Saccharomyces cerevisiae, nồng độ 0,2 U/mL) trong môi trường đệm phosphate 0,1 M (pH = 6,8). Sản phẩm tạo thành là p-nitrophenol (PNP) có độ hấp thụ ánh sáng nhìn thấy ở bước sóng cực đại λ = 405 nm. Mật độ quang được đo trên máy đọc vi đĩa Biotek tại Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. Hồ Chí Minh. Đối chứng dương sử dụng acarbose.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần mở đầu nêu rõ bối cảnh nghiên cứu về nhu cầu tìm kiếm hoạt chất sinh học tự nhiên từ nguồn tài nguyên dược liệu nhiệt đới tại Việt Nam. Tác giả trình bày lý do lựa chọn hai đối tượng nghiên cứu là thiết đinh Cà Ná (Markhamia stipulata var. dang) và quao Bình Châu (Stereospermum binhchauensis V. Dang) - hai loài mới được công bố năm 2015 chưa có bất kỳ dữ liệu hóa thực vật và hoạt tính nào. Phần này cũng xác định rõ 2 mục tiêu cụ thể và 3 nội dung nghiên cứu chính của luận án.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 trình bày tổng quan các đặc điểm thực vật, hóa học và hoạt tính sinh học của hai chi Markhamia và Stereospermum.

• Mô tả thực vật học của loài thiết đinh Cà Ná (M. stipulata var. dang): Cây gỗ nhỏ cao 3–6 m; lá mọc đối, kép lông chim 1 lần dài 14–20 cm; 7–9 lá chét kích thước 6–8 x 3–4,5 cm; cụm hoa dạng chùm ở ngọn mang 8–14 hoa; đài hình mo dài 3,5–4 cm màu vàng nâu có móc dài ở đầu; tràng hoa màu vàng đỏ hoặc nâu đỏ dài 11–14 cm; quả dẹp kích thước 16–20 x 1,7–2 cm có mụn cóc; hạt có cánh.
• Mô tả thực vật học của loài quao Bình Châu (S. binhchauensis V. Dang): Cây gỗ lớn cao 10–18 m, cành non có lông; lá kép lông chim 1 lần; lá chét hình bầu dục 8–18 x 5–7,5 cm, gốc lệch không cân, có lông cứng ở hai mặt; cụm hoa xim ở đầu cành; đài hình chuông dài 0,8–1,2 cm; tràng màu tím vàng dài 4–5 cm; 4 nhị so le; quả hình trụ rủ xuống dài 60–80 cm, rộng 0,5–1 cm, có 4 cạnh thấp và nhiều đám trắng; hạt màu trắng đục có cánh.
• Tổng kết thành phần hóa học của chi Markhamia (Bảng 1.1) gồm các dẫn xuất phenol, flavonoid, triterpenoid, cycloartane, anthraquinone, naphthoquinone, lignan và sterol; chi Stereospermum (Bảng 1.2) gồm anthraquinone, naphthoquinone, iridoid, lignan, alkaloid và triterpenoid.
• Trình bày cơ sở lý thuyết về hoạt tính gây độc tế bào (các dòng tế bào thử nghiệm, nguyên lý phương pháp MTT và SRB) và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase liên quan đến kiểm soát đường huyết sau bữa ăn trong bệnh đái tháo đường type 2.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn nguyên liệu, hóa chất, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm.

• Nguyên liệu: 8 kg bột lá thiết đinh Cà Ná (độ ẩm 11%) thu tại Ninh Thuận và 7 kg bột lá quao Bình Châu (độ ẩm 10%) thu tại Bà Rịa - Vũng Tàu vào tháng 6 năm 2016.
• Thiết bị và hóa chất: Hệ thống dung môi (n-hexane, ethyl acetate, ethanol 96%, methanol, chloroform); chất hấp phụ (silica gel pha thường, silica gel C18, Diaion HP-20); máy đo độ quay cực Krüss-optronic; hệ máy HPLC-DAD Agilent 1260; máy quang phổ FT-IR Bruker Tensor 27; máy đo khối phổ Bruker MicrOTOF-QII, LC-X500R QTOF, Thermo UPLC-MSQ Plus; máy đo cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM500 FT-NMR; máy đọc vi đĩa Biotek và Synergy HT Biotek.
• Quy trình thử hoạt tính in vitro: Quy trình chi tiết thử ức chế α-glucosidase với cơ chất PNPG và thử độc tế bào trên 5 dòng ung thư (MCF-7, HeLa, HepG2, NCI-H460, Jurkat) cùng chất đối chứng tương ứng.

Chương 3: Thực nghiệm

Chương 3 trình bày các bước thực nghiệm điều chế cao chiết, quy trình sắc ký cột phân lập hợp chất, và dữ kiện hằng số vật lý, dữ liệu phổ của từng chất phân lập.

• Điều chế cao chiết từ lá thiết đinh Cà Ná: 8 kg bột lá chiết với EtOH 96% bằng phương pháp ngâm dầm có hỗ trợ siêu âm, thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được 890 g cao thô EtOH. Chiết lỏng - lỏng phân đoạn cao thô với n-hexane và ethyl acetate thu được cao MSH (250 g), cao MSE (350 g) và dịch nước MSW (400 g) theo Sơ đồ 3.1.
• Điều chế cao chiết từ lá quao Bình Châu: 7 kg bột lá chiết EtOH 96% bằng phương pháp tương tự, thu được 1050 g cao thô EtOH. Chiết phân bố lỏng - lỏng thu được cao SBH (340 g), cao SBE (150 g) và dịch nước SBW (495 g) theo Sơ đồ 3.2.
• Quy trình phân lập:
  • Từ cao MSH (250 g), sắc ký cột silica gel giải ly gradient n-hexane:EtOAc thu 5 phân đoạn H.I–H.V; tiếp tục phân tách các phân đoạn H.III (45 g) và H.IV (75 g) bằng hệ dung môi n-hexane:EtOAc và CHCl3:MeOH thu các hợp chất ký hiệu MS.
  • Từ cao MSE (250 g), sắc ký cột silica gel giải ly hệ n-hexane:EtOAc:MeOH thu 5 phân đoạn E.I–E.V; tiếp tục sắc ký các phân đoạn E.II (40 g) và E.III (30 g) thu các hợp chất tiếp theo. Tổng cộng từ lá thiết đinh Cà Ná phân lập được 17 hợp chất (MS01–MS17).
  • Từ cao SBH (340 g) và cao SBE (150 g), thực hiện sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo giải ly hệ n-hexane:EtOAc phân tách các phân đoạn H.I–H.V, H.II (75 g), H.III (74 g)... thu được 11 hợp chất từ lá quao Bình Châu (SB01–SB11).
• Ghi nhận hằng số vật lý và dữ kiện phổ (1H-NMR, 13C-NMR, MS, IR, UV, [α]D) của các hợp chất: Hợp chất MS16 là 1-hexadecanoyl-sn-glycerol; hợp chất SB01 là chrysin 5,7-dimethyl ether; cùng các hợp chất MS01–MS15, MS17 và SB02–SB11.
• Mô tả điều kiện thực nghiệm khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase và độc tế bào của các phân đoạn cao chiết và các hợp chất tinh khiết.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 biện giải cấu trúc hóa học và trình bày kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học:

• Biện giải cấu trúc các hợp chất từ lá thiết đinh Cà Ná:
  • Nhóm cycloartane (MS01, MS02, MS03, MS04, MS05): Dựa trên phân tích tương tác COSY, HMBC, NOESY. Bảng 4.1 trình bày chi tiết dữ liệu phổ 13C-NMR (125 MHz, dung môi methanol-d4, δ ppm) của các hợp chất này.
  • Hợp chất MS16: Xác định là 1-hexadecanoyl-sn-glycerol qua phân tích các mảnh phân cắt khối phổ và tương tác HMBC (Hình 4.23, 4.24).
  • Hợp chất MS17: Xác định là dẫn xuất phytosphingosine/ceramide qua tương tác COSY, HMBC và phân tích các phân mảnh của phần phytosphingosine và acid béo bằng kỹ thuật HR-ESI-MS/MS (Hình 4.10, 4.11, 4.12).
  • Các hợp chất MS06–MS15: Cấu trúc được xác định dựa trên phân tích phổ 1D và 2D-NMR (Hình 4.13–4.22).
• Biện giải cấu trúc các hợp chất từ lá quao Bình Châu:
  • Cấu trúc hợp chất SB01 được xác định là chrysin 5,7-dimethyl ether dựa trên tương tác HMBC (Hình 4.25).
  • Các hợp chất SB02 đến SB11 được xác định cấu trúc hoàn chỉnh dựa trên tương tác HMBC và các dữ kiện phổ liên quan (Hình 4.26–4.35).
• Kết quả hoạt tính sinh học:
  • Hoạt tính gây độc tế bào: Bảng 4.2 trình bày phần trăm (%) gây độc tế bào ở nồng độ 100 µg/mL của các phân đoạn cao từ lá thiết đinh Cà Ná; Bảng 4.3 trình bày phần trăm gây độc tế bào của các phân đoạn cao từ lá quao Bình Châu; Bảng 4.4 trình bày phần trăm gây độc tế bào của một số hợp chất tinh khiết ở nồng độ 100 µg/mL; Bảng 4.5 xác định giá trị IC50 của một số hợp chất đối với các dòng tế bào ung thư MCF-7, HeLa, HepG2, NCI-H460 và Jurkat so với camptothecin.
  • Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase: Bảng 4.6 ghi nhận hoạt tính ức chế enzyme của các phân đoạn cao từ lá thiết đinh Cà Ná; Bảng 4.7 ghi nhận hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase và giá trị IC50 của các hợp chất phân lập được so với đối chứng dương acarbose.
  • Nhận xét chung: Đánh giá mối liên quan giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học, chỉ ra các phân đoạn cao và các hợp chất có hiệu lực ức chế nổi bật.

Kết luận và kiến nghị

Tác giả tóm tắt toàn bộ các kết quả đạt được về mặt phân lập (28 hợp chất từ hai loài), xác định cấu trúc phổ học và kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học. Đề xuất kiến nghị mở rộng nghiên cứu sang các bộ phận khác của cây và thử nghiệm in vivo để đánh giá độc tính và tác dụng dược lý toàn diện.

Kết quả và những đóng góp mới

1. Đóng góp về mặt lý luận và khoa học hóa thực vật:

• Luận án là công trình nghiên cứu đầy đủ đầu tiên về thành phần hóa thực vật của hai loài mới được phát hiện tại Việt Nam: thứ thiết đinh Cà Ná (Markhamia stipulata var. dang) và loài quao Bình Châu (Stereospermum binhchauensis V. Dang) thuộc họ Quao (Bignoniaceae).
• Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 28 hợp chất tinh khiết từ lá của hai loài cây nghiên cứu:
  • Từ lá thiết đinh Cà Ná: Phân lập và xác định 17 hợp chất (MS01–MS17), trong đó có nhóm triterpenoid khung cycloartane (MS01–MS05), hợp chất glycerol ester 1-hexadecanoyl-sn-glycerol (MS16), hợp chất phytosphingosine/ceramide (MS17) và các hợp chất từ MS06 đến MS15.
  • Từ lá quao Bình Châu: Phân lập và xác định 11 hợp chất (SB01–SB11), trong đó có dẫn xuất flavonoid chrysin 5,7-dimethyl ether (SB01) và các hợp chất từ SB02 đến SB11.
• Xây dựng bộ dữ liệu phổ chi tiết (UV, IR, [α]D, HR-ESI-MS, HR-ESI-MS/MS, 1D và 2D NMR) cho các hợp chất phân lập, bổ sung dữ liệu hóa học cho chi Markhamia và chi Stereospermum.

2. Đóng góp về mặt thực tiễn và dược lý học:

• Khảo sát thực nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các phân đoạn cao và các hợp chất tinh khiết trên 5 dòng tế bào ung thư người (MCF-7, HeLa, HepG2, NCI-H460, Jurkat), xác định các phân đoạn và hợp chất có giá trị IC50 tiềm năng so với camptothecin.
• Đánh giá thực nghiệm hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase in vitro của các phân đoạn cao và các hợp chất cô lập được, xác định các chất có khả năng ức chế mạnh so sánh với chất chuẩn acarbose.

Đối tượng thực vật	Khối lượng bột lá	Khối lượng cao thô EtOH	Phân đoạn cao lỏng - lỏng	Số hợp chất phân lập	Nhóm cấu trúc tiêu biểu
Thiết đinh Cà Ná (M. stipulata var. dang)	8 kg (độ ẩm 11%)	890 g	MSH (250 g) MSE (350 g) MSW (400 g)	17 hợp chất (MS01–MS17)	Cycloartane (MS01–MS05), glycerol ester (MS16), sphingolipid (MS17)
Quao Bình Châu (S. binhchauensis V. Dang)	7 kg (độ ẩm 10%)	1050 g	SBH (340 g) SBE (150 g) SBW (495 g)	11 hợp chất (SB01–SB11)	Flavonoid (SB01: Chrysin 5,7-dimethyl ether), các dẫn xuất SB02–SB11

Kiến nghị của tác giả: Tiếp tục mở rộng nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên các bộ phận khác (vỏ cây, gỗ thân, rễ) của thiết đinh Cà Ná và quao Bình Châu; tiến hành các thử nghiệm in vivo và nghiên cứu sâu cơ chế tác động dược lý phân tử của các hợp chất có hoạt tính cao.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án:

• Về đối tượng khảo sát: Nghiên cứu mới chỉ tập trung phân lập và khảo sát hoạt tính trên bộ phận lá của cây thiết đinh Cà Ná và quao Bình Châu; các bộ phận khác như thân, vỏ thân, rễ, hoa, quả chưa được khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học.
• Về mô hình thử nghiệm sinh học: Các đánh giá hoạt tính sinh học mới dừng lại ở quy mô thử nghiệm in vitro (độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư và ức chế enzyme α-glucosidase nấm men), chưa tiến hành thử nghiệm trên mô hình động vật sống (in vivo) để đánh giá dược động học, độc tính cấp và độc tính bán trường diễn.
• Về phổ hoạt tính: Chưa mở rộng khảo sát các hoạt tính dược lý khác mà các loài trong chi Markhamia và Stereospermum từng được ghi nhận như kháng sốt rét, kháng nấm, kháng viêm và bảo vệ gan.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Mở rộng chiết tách và phân lập các hợp chất từ các bộ phận khác (vỏ thân, gỗ, rễ, hoa) của hai loài thực vật này.
• Triển khai thử nghiệm in vivo đối với các phân đoạn cao và các hợp chất thể hiện hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase và gây độc tế bào ung thư tốt nhất.
• Khảo sát cơ chế phân tử tác động lên tế bào ung thư và cơ chế ức chế cạnh tranh/phi cạnh tranh đối với enzyme α-glucosidase.

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn đối với các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên thuộc các chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược, Dược học và Thực vật học.
• Các nhà nghiên cứu hoạt động trong lĩnh vực chiết tách, tinh chế chất tự nhiên, phân tích cấu trúc phân tử hữu cơ bằng các phương pháp phổ học hiện đại (đặc biệt là phổ 2D-NMR và HR-ESI-MS/MS).
• Các đơn vị nghiên cứu dược liệu và cơ quan quản lý nguồn gen thực vật tại Việt Nam trong việc đánh giá giá trị tài nguyên thực vật bản địa.

Nội dung đáng tham khảo trong luận án:

• Quy trình thực nghiệm chiết xuất phân bố lỏng - lỏng quy mô lớn (từ 7–8 kg dược liệu) và kỹ thuật sắc ký cột phân đoạn liên tục giải ly gradient (Sơ đồ 3.1, Sơ đồ 3.2, Sơ đồ 4.1–4.4).
• Phương pháp luận biện giải cấu trúc phổ học cho các khung cấu trúc phức tạp: chuỗi phân tích tương tác HMBC, COSY, NOESY cho nhóm cycloartane (Bảng 4.1) và quy trình phân tích các phân mảnh khối phổ HR-ESI-MS/MS để xác định vị trí nối đôi và chuỗi acid béo của dẫn xuất sphingolipid (MS17).
• Hệ thống dữ liệu sàng lọc hoạt tính sinh học in vitro đối với 5 dòng tế bào ung thư và enzyme α-glucosidase (Bảng 4.2–4.7).

Câu hỏi thường gặp

1. Hai loài thực vật nghiên cứu trong luận án có nguồn gốc phân loại và địa bàn phân bố ở đâu? Thiết đinh Cà Ná (Markhamia stipulata var. dang) và quao Bình Châu (Stereospermum binhchauensis V. Dang) đều thuộc họ Quao (Bignoniaceae), là hai loài/thứ thực vật mới được TS. Đặng Văn Sơn phát hiện và công bố năm 2015. Thiết đinh Cà Ná được phát hiện tại khu vực Cà Ná, huyện Thuận Nam, tỉnh Ninh Thuận; quao Bình Châu được phát hiện tại Khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phước Bửu, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu. Mẫu nghiên cứu trong luận án được thu hái tại hai địa phương này vào tháng 6 năm 2016.

2. Quy trình điều chế các phân đoạn cao chiết từ hai loài thực vật được thực hiện như thế nào? Bột lá khô của thiết đinh Cà Ná (8 kg, độ ẩm 11%) và quao Bình Châu (7 kg, độ ẩm 10%) được ngâm dầm với dung môi ethanol 96% có hỗ trợ siêu âm. Dịch chiết đem cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cao thô EtOH (890 g từ lá thiết đinh Cà Ná và 1050 g từ lá quao Bình Châu). Cao thô EtOH sau đó được hòa với nước và chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với n-hexane và ethyl acetate (EtOAc), thu được các cao tương ứng: cao n-hexane (MSH 250 g, SBH 340 g), cao ethyl acetate (MSE 350 g, SBE 150 g) và dịch nước còn lại (MSW 400 g, SBW 495 g).

3. Luận án đã phân lập và xác định được bao nhiêu hợp chất hóa học từ mỗi loài? Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của tổng cộng 28 hợp chất hóa học từ lá của hai loài thực vật. Trong đó, có 17 hợp chất được phân lập từ lá thiết đinh Cà Ná (ký hiệu MS01 đến MS17), bao gồm 5 hợp chất triterpenoid khung cycloartane (MS01–MS05), 1 dẫn xuất glycerol ester là 1-hexadecanoyl-sn-glycerol (MS16), 1 dẫn xuất phytosphingosine (MS17) và các hợp chất khác (MS06–MS15). Từ lá cây quao Bình Châu, luận án phân lập được 11 hợp chất (ký hiệu SB01 đến SB11), trong đó có dẫn xuất flavonoid chrysin 5,7-dimethyl ether (SB01).

4. Các phương pháp kỹ thuật nào được sử dụng để phân tích và xác định cấu trúc các hợp chất? Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định dựa trên sự kết hợp của nhiều phương pháp hóa lý và phổ học hiện đại: đo độ quay cực ([α]D) trên máy Krüss-optronic ở bước sóng 589 nm; đo phổ tử ngoại (UV) bằng hệ HPLC-DAD Agilent 1260; đo phổ hồng ngoại (IR) trên máy Bruker Tensor 27 FT-IR; đo phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS và HR-ESI-MS/MS trên hệ thống Bruker MicrOTOF-QII và LC-X500R QTOF; đo phổ khối thông thường UPLC-MSQ Plus; đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D-NMR (1H, 13C, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY, ROESY) trên máy Bruker AM500 FT-NMR ở tần số 500 MHz đối với 1H và 125 MHz đối với 13C sử dụng chuẩn nội TMS.

5. Những thử nghiệm hoạt tính sinh học nào đã được thực hiện và sử dụng các đối chứng dương nào? Luận án thực hiện hai thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro chính:

• Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên 5 dòng tế bào ung thư người: ung thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư gan HepG2, ung thư phổi NCI-H460, và ung thư máu Jurkat; chất đối chứng dương sử dụng là camptothecin.
• Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase từ nấm men Saccharomyces cerevisiae (0,2 U/mL) sử dụng cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNPG), đo mật độ quang ở bước sóng 405 nm; chất đối chứng dương sử dụng là acarbose.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Ngô Trọng Nghĩa là công trình thực nghiệm đầu tiên nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài thực vật mới thuộc họ Quao (Bignoniaceae) tại Việt Nam gồm Markhamia stipulata var. dang và Stereospermum binhchauensis V. Dang. Nghiên cứu đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 28 hợp chất tinh khiết từ lá của hai loài cây, trong đó nổi bật là các hợp chất triterpenoid khung cycloartane, glycerol ester, phytosphingosine và flavonoid. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học in vitro đã xác lập dữ liệu thực nghiệm về khả năng gây độc trên 5 dòng tế bào ung thư và tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase của các phân đoạn cao và các hợp chất tinh khiết. Công trình đóng góp bộ dữ liệu phổ học và hóa thực vật quan trọng cho hai chi Markhamia và Stereospermum, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho các định hướng nghiên cứu khai thác nguồn dược liệu tự nhiên trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Việt Nam là một nước nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa có nguồn thực vật vô cùng phong phú và đa dạng, trong đó có nhiều cây thuốc quý từ lâu đã được ông cha ta sử dụng để chữa nhiều loại bệnh cho thấy tầm quan trọng của tài nguyên cây thuốc. Những năm gầy đây, theo sự phát triển của kinh tế xã hội nhu cầu chăm sóc sức khỏe cũng không ngừng tăng lên, các nhà khoa học không ngừng tìm kiếm các hoạt chất có khả năng chữa bệnh có nguồn gốc từ tự nhiên. Nhiều hợp chất thiên nhiên đã được phân lập và ứng dụng rộng rãi, chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm bởi sự an toàn, ít tác dụng phụ, thân thiện môi trường. Vì vậy, việc tìm kiếm, nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các cây thuốc nhằm phát hiện những hợp chất có hoạt tính hấp dẫn từ các loại thảo dược là một vấn đề hết sức cần thiết.

Chi Markhamia và chi Stereospermum thuộc họ Quao(Bignoniaceae) phân bố vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Phi, Trung Quốc và các quốc gia Đông Nam Á như Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan. Những kết quả nghiên cứu của một số loài trong 2 chi này đã phát hiện nhiều dược tính sinh học lý thú như gây độc tế bào ung thư, hạ đường huyết, kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa và giảm đau… Thiết đinh Cà Ná (Markhamia stipulata var. Dang) và quao Bình Châu (Stereospermum binhchauensis V. Dang) là 2 loài mới được phát hiện vào năm 2015 thuộc chi Markhamia và Stereospermum.

Hiện chưa có bất kỳ nghiên cứu nào về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của 2 loài thiết đinh Cà Ná và quao Bình Châu thuộc họ Quao, vì vậy trên cơ sở khoa học đó, chúng tôi chọn đề tài ― Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 2 loài Markhamia stipulata var. Dang và Stereospermum binhchauensis V. Dang thuộc họ Quao (Bignoniaceae)‖ góp phần làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu và ứng dụng về 2 loài này trong tương lai. Mục tiêu nghiên cứu của luận án 1.

Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu của hai loài Markhamia stipulata var. Dang và Stereospermum binhchaunesis V. Dang ở Việt Nam. Đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được để tìm kiếm các hoạt chất tiềm năng.

luan an 2 Các nội dung nghiên cứu chính 1. Phân lập các hợp chất từ lá cây thiết đinh Cà Ná (Markhamia stipulata var. Dang) và lá cây quao Bình Châu) Stereospermum binhchaunesis V. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập.

Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase của một số hợp chất chất phân lập được. luan an 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về loài Markhamia stipulata var. Mô tả thực vật Chi Makhamia thuộc họ Quao (Bignoniaceae) là một chi khá nhỏ với khoảng 6 loài, hầu hết là cây gỗ hoặc cây bụi, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Phi, Trung Quốc và các quốc gia Đông Nam Á như Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan [1].

Theo thống kê ở Việt Nam, chi Markhamia chỉ có loài Makhamia stipulata gồm 2 thứ đó là M. Thiết đinh Cà Ná có tên khoa học là Markhamia stipulata var. Dang thuộc họ Quao (Bignoniaceae) là một thứ mới được TS. Đặng Văn Sơn phát hiện ở khu vực Cà Ná, huyện Thuận Nam, tỉnh Ninh Thuận, và được công bố trên tạp chí Taiwania năm 2015[5].

Cây gỗ nhỏ, cao 3–6 m. Lá mọc đối, kép lông chim 1 lần, dài 14–20 cm, lá kèm giả thường hiện diện; lá chét 7–9, hình thuôn, xoan thuôn hay bầu dục thuôn, kích thước 6–8 x 3–4,5 cm, gốc nhọn hay tròn, đầu gần tròn hay có mũi ngắn. Cụm hoa dạng chùm mọc ở ngọn, mang 8–14 hoa. Đài hình mo, dài 3,5–4 cm, màu vàng nâu, có lông rải rác tới không lông, có móc dài ở đầu.

Tràng có màu vàng đỏ hay nâu đỏ, dài 11–14 cm, không lông; đáy hẹp dạng ống trụ, dài 6–7,5 cm; đầu loe rộng dạng phễu, dài 3–4 cm. Quả dẹp, kích thước 16–20 x 1,7–2 cm, có mụn cóc lún phún rải rác trên vỏ quả. Hạt nhiều, có cánh [5].1: Hình mẫu cây tƣơi và mẫu khô của thiết đinh Cà Ná luan an 4 1. Các nghiên cứu về dƣợc lý Kết quả nghiên cứu năm 1998 của Kernan M.

và cộng sự cho thấy các dẫn xuất phenol (13 -17) cô lập từ rễ cây M. lutea có hoạt tính kháng virus gây nhiễm trùng đường hô hấp (RSV) với giá trị EC50 lần lượt là 0,8; 1,1; 0,87; 3,4; và 15,5 µg/ml [6]. Kết quả nghiên cứu năm 2009 của Lacroix D. và cộng sự cũng cho thấy các cycloartane (44 -48) cô lập từ lá cây M.

lutea có hoạt tính kháng các loài ký sinh trùng như Plasmodium falciparum với EC50 lần lượt là 50; >50; 10,2; 32,6; 42,7 µg/ml , Trypanosoma brucei brucei với EC50 lần lượt là 7,8; 1,9; 15,6; 15,6; 31,2 µg/ml, và Leishmania donovani với EC50 tương ứng là 29,0; 25,0; >125; 79,0 µg/ml. Ngoài ra, các cycloartane (44-48) này cũng có khả năng ức chế dòng tế bào ung thư biểu mô (KB), và dòng tế bào lưỡng bội (MRC5) với IC50 > 50 µg/ml [7]. Kết quả nghiên cứu năm 2010 của Nchu F. và cộng sự cho thấy các triterpen (52-54) cô lập từ lá cây M.

obtusifolia có tác dụng ức chế nấm Candida albicans với MIC sau 24 h thử lần lượt là 100; 12,5; 100 µg/ml [8]. Ngoài ra, kết quả nghiên cứu của Nchu F. và cộng sự công bố năm 2011 thì dịch chiết nước từ lá M. obtusifolia cũng có tác dụng chống lại sán Trichostrongylus colubriformis với EC50 là 0,46 mg/ml [9].

Kết quả nghiên cứu năm 2014 của El Dib R.A và cộng sự cho thấy dịch chiết từ lá Markhamia platycalyx có hoạt tính kháng oxy hóa, kháng viêm và bảo vệ gan rất tốt [10]. Ngoài ra theo kết quả nghiên cứu năm 2015 của Basma K. và cộng sự cho thấy tinh dầu từ lá của loài M. platycalyx có tác dụng chống lại vi khuẩn E.

coli với MIC là 7,48 µg/ml [11]. Kết quả nghiên cứu năm 2010 của Tantangmo F. và cộng sự cho thấy các anthraquinone (55-56) cô lập từ vỏ thân Markhamia tomentosa có tác dụng kháng ký sinh trùng gây bệnh sốt rét Plasmodium falciparum với nồng độ ức chế lần lượt là 0,11 và 0,44 µg/ml. Ngoài ra hai hợp chất này cũng có khả năng gây độc đối với dòng tế bào L-6 với nồng độ ức chế là 0,1 µg/ml [12].

Kết quả nghiên cứu năm 2014 của Sofidiya M. và cộng sự cho thấy dịch chiết từ lá Markhamia tomentosa cũng có tác dụng kháng viêm, chống loét dạ dày [13,14]. Ngoài ra kết quả nghiên cứu năm 2018 của Ibrahim M. và cộng sự cho thấy luan an 5 hợp chất (128) cô lậ từ lá Markhamia tomentosa có khả năng ức chế dòng ung thư cổ tử cung (HeLa) với IC50 là 34,74 µg/ml [15].

Kết quả nghiên cứu năm 2016 của Dina M. và cộng sự cho thấy các dịch chiết cồn từ lá của loài Markhamia zanzibarica có khả năng ức chế tế bào ung thư HeLa với IC50 là 9,68 µg/ml (đối chứng Doxorubicin (7. Các nghiên cứu về thành phần hóa học Việc nghiên cứu về thành phần hóa học chi Markhamia được nghiên cứu chủ yếu ở nước ngoài và ghi nhận sớm nhất vào những năm 1978, với việc tìm ra các hợp chất dehydro-α-lapachone (1), lapachol (2), dehydro-iso-α-lapachone (3), β-sitosterol (4), β-lapachone (5), tectol (6), paulownin (7), palmitone (8) từ gỗ thân cây Markhamia stipulata (Wall. Theo thống kê, đến nay có khoảng 7 loài thuộc chi Markhamia đã được nghiên cứu về thành phần hóa học.

Kết quả từ các nghiên cứu cho thấy phần hóa học chủ yếu của chi Markhamia là các dẫn xuất phenol, flavonoid, triterpenoid, anthraquinone, naphthoquinone, và một vài hợp chất khác. Dưới đây là thành phần hóa học của một số loài khác thuộc chi Markhamia đã được nghiên cứu trong và ngoài nước. Markhamia acuminata Năm 2006, Gormann R. và cộng sự đã phân lập 8 flavonoid từ lá Markhamia acuminata: apigenin (36), luteolin (37), luteolin 7-rutinoside (38), naringenin (39), naringenin 7-rutinoside (40), eriocitrin (41), 3',4',5,7-tetrahydroxy-5'-methoxy-flavone (42), apigenin 5-O-α-L-rhamnopyranoside 7-O-β-D-glucopyranoside (43) [18].

Markhamia lutea Năm 1998, Kernan M. và cộng sự đã phân lập 5 dẫn xuất phenol từ rễ Markhamia lutea: verbascoside (13), isoverbascoside (14), luteoside A (15), luteoside B (16), luteoside C (17) [6]. và cộng sự đã phân lập 10 hợp chất từ lá Markhamia lutea: musambin A (44), musambin B (45), musambin C (46), musambioside A (47) , musambioside B (48), musambioside C (49), phaeophorbide A (50), β-sitosterol (4), acid arjunic (51), acid 2-epi-tormentic (52) [7]. Markhamia obtusifolia luan an 6 Năm 2010, NChu F.

và cộng sự đã cô lập được 3 triterpenoid từ lá Markhamia obtusifolia (Baker) Sprague: acid pomolic (53), acid 2-epi-tormentic (52), acid ursolic (54) [8]. Markhamia platycalyx Năm 1985, Joshi K. và cộng sự đã cô lập được 6 hợp chất từ lõi gỗ Markhamia platycalyx: lapachol (2), β-lapachone (5), dehydro-iso-α-lapachone (3), d-sesamin (11), paulownin (7), stigmasterol (12) [19]. và cộng sự đã cô lập 6 dẫn xuất phenol từ lá Markhamia platycalyx: acid protocatechuic (60), acid E-caffeic (61), isoverbascoside (14), verbascoside (13), jacraninoside I (62) và 4 flavonoid: cosmosiin (63), cynaroside (64), luteolin (37), apigenin (36) [9].

Markhamia stipulata Năm 1978, Joshi K. và cộng sự đã cô lập được 8 hợp chất từ gỗ thân Markhamia stipulata (Wall.) Seem: dehydro-α-lapachone (1), lapachol (2), dehydro- iso-α-lapachone (3), β-sitosterol (4), β-lapachone (5), tectol (6), paulownin (7), palmitone (8) [17]. đã cô lập được 6 hợp chất từ vỏ thân Markhamia stipulata (Wall.) Seem: dehydro-α-lapachone (1), dehydrotectol (9), tectoquinone (10), lapachol (2), β-sitosterol (4), β-lapachone (5) [20]. đã cô lập được 19 hợp chất từ lá và cành Markhamia stipulata (Wall.) Seem: phenethyl-O-β-D-glucopyranosyl(1→2)-O-β-D-glucopyranoside (21), decaffeoylverbascoside (22), verbascoside (13), isoverbascoside (14), 2''-O- apiosylverbascoside (23), luteoside A (15), luteoside B (16), khaephuoside B (24), sequinoside K (25), (6S,9R)-roseoside (26), rengyoside B (27), ajugol (28), (+)- lyoniresinol 3α-O-β-glucopyranoside (29), markhamioside A (30), markhamioside B (31), markhamioside C (32), markhamioside D (33), markhamioside E (34), markhamioside F (35) [21].

Markhamia tomentosa Năm 2010, Tantangmo F. và cộng sự đã cô lập được 8 hợp chất từ vỏ thân Markhamia tomentosa (Benth. đã cô lập được 9 hợp chất từ lá Markhamia tomentosa (Benth. đã cô lập được 4 hợp chất từ lá Markhamia tomentosa (Benth.

Markhamia zanzibarica Năm 1999, Khana M. đã cô lập được 3 hợp chất từ gỗ của rễ Markhamia zanzibarica: γ-sitosterol (18), từ vỏ thân: campesterol (19), từ lá: tritriacontane (20) [22]. luan an 8 Bảng 1.1: Bảng tổng kết thành phần hóa học của chi Markhamia Loài Bộ phận Loại hợp chất Ký hiệu TL (36), (37), (38), (39), (40), (41), M. platycalyx Anthraquinone, naphthoquinone (2), (5), (3) Lõi gỗ Lignan (11), (7) [19] Sterol (12) Anthraquinone, naphthoquinone (1), (2), (5), (9), (10), Vỏ thân [20] Sterol (4) Anthraquinone, naphthoquinone (1), (2), (3), (5), (6), (7) Gỗ thân (8) [17] Sterol (4 M.