Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ hóa học của nghiên cứu sinh Vũ Thị Thu Lê với đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Nàng nàng (Callicarpa candicans) và loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla) ở Việt Nam" được thực hiện tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Phạm Thị Hồng Minh và GS.TS. Phạm Quốc Long. Chuyên ngành đào tạo là Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Mã số: 9.17).

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, sở hữu hệ thực vật phong phú với nhiều loài cây thuốc được sử dụng trong y học cổ truyền. Xu hướng nghiên cứu, phát hiện các hoạt chất tự nhiên từ thảo dược nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho các bài thuốc dân gian và tìm kiếm các tiền chất sinh học có giá trị ngày càng được quan tâm. Chi Callicarpa (chi Tử châu) thuộc họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) gồm nhiều loài được sử dụng trong y học dân gian ở châu Á, châu Mỹ và châu Úc để điều trị các bệnh về gan, mật, dạ dày, phong thấp, vết thương, cầm máu và khối u. Trên thế giới, các nghiên cứu hóa thực vật về chi này đã phân lập hơn 200 hợp chất thuộc các nhóm terpenoid, flavonoid, phenylethanoid, trong đó các hợp chất diterpenoid và triterpenoid thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư, kháng viêm, chống lao. Tuy nhiên, tại Việt Nam, các nghiên cứu về chi Callicarpa còn rất hạn chế; trước thời điểm thực hiện luận án mới chỉ có nghiên cứu thăm dò về thành phần tinh dầu lá và hoạt tính diệt bọ gậy muỗi Aedes aegypti của loài Callicarpa candicans và Callicarpa sinuata ở miền Trung, trong khi các nghiên cứu có hệ thống về thành phần hóa học không bay hơi và hoạt tính sinh học của loài Callicarpa candicans và Callicarpa macrophylla hầu như chưa được thực hiện đầy đủ.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể được đánh số theo văn bản như sau:

  1. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ lá loài Nàng nàng (Callicarpa candicans) và Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla) thu hái ở Việt Nam.
  2. Nghiên cứu thành phần hóa học trong tinh dầu loài Nàng nàng (Callicarpa candicans) và loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla).
  3. Đánh giá hoạt tính gây độc trên một số dòng tế bào ung thư: gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) của các hợp chất sạch phân lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Các bộ phận lá, thân cành và quả của 2 loài thực vật thuộc chi Callicarpa, họ Verbenaceae gồm:
    • Loài Nàng nàng: Callicarpa candicans (Burm. f.) Hochr., số hiệu tiêu bản lưu giữ CA20171001.HN tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam.
    • Loài Tử châu lá to: Callicarpa macrophylla Vahl, số hiệu tiêu bản lưu giữ CA20171002.HN tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam.
    • Cả hai mẫu thực vật đều được TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học.
  • Phạm vi không gian: Mẫu thực vật được thu hái tại huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên, Việt Nam.
  • Phạm vi thời gian: Mẫu nguyên liệu thu hái vào tháng 10 năm 2017; các nội dung thực nghiệm, phân tích phổ nghiệm và thử nghiệm hoạt tính sinh học hoàn thành năm 2020.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu thực vật học và dược lý cổ truyền

Họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) tại Việt Nam được tác giả Vũ Xuân Phương (2007) xây dựng khóa định loại gồm 26 chi với khoảng 140 loài và 21 thứ. Về số lượng loài trong chi Callicarpa, tác giả Võ Văn Chi thống kê có 14 loài, tác giả Phạm Hoàng Hộ ghi nhận 26 loài, và các nhà thực vật học thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật ghi nhận 21 loài phân bố rải rác từ Bắc vào Nam (Tuyên Quang, Lạng Sơn, Sơn La, Bắc Kạn, Phú Thọ, Bắc Giang, Ba Vì, Thái Nguyên, Nghệ An, Huế, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Kon Tum, Đắc Lắc, Gia Lai, Bình Dương, Đồng Nai).

Trong y học cổ truyền thế giới, khoảng 20 loài thuộc chi Callicarpa đã được ghi nhận công dụng điều trị:

  • Callicarpa americana L.: Vỏ dùng trị sốt; lá chữa chứng phù thũng; rễ dùng trị kiết lỵ, ung thư da; rễ và quả trị đau bụng; rễ và cành trị sốt rét, thấp khớp (Bắc Mỹ). Tác giả Rafinesque ghi nhận lá dùng trị phù, quả làm thuốc nhuộm màu tím cho len.
  • Callicarpa macrophylla Vahl: Dùng phổ biến trong y học cổ truyền Ấn Độ và Trung Quốc. Tại Ấn Độ, vỏ dùng trị bệnh ngoài da, rễ tươi trị sốt, loét miệng, ho, hạt trị thấp khớp; tại Nepal, rễ dùng trị nhiễm trùng, bệnh đường tiêu hóa, quả tươi trị sốt; tại Trung Quốc, lá dùng trị vết thương, sốt, phối hợp với C. cathayana Chang để ngăn ngừa xuất huyết trong và điều trị bỏng, kết hợp thảo dược khác trị tiêu chảy, kiết lỵ, đào thải chất độc.
  • Callicarpa candicans (Burm. f.) Hochr.: Lá dùng làm chất độc bắt cá tại Philippines và quần đảo Palau, dùng điều hòa kinh nguyệt tại Malaysia.
  • Callicarpa arborea: Vỏ dùng trị bệnh ngoài da (Ấn Độ), vỏ cây dùng giảm sốt và vỏ quả chữa khó tiêu (Nepal). Bộ lạc Marma ở Bangladesh dùng rễ C. arborea phối hợp với rễ loài Streblus asper Laur. để chữa bệnh.
  • Callicarpa formosana Rolfe: Y học dân gian Đài Loan dùng trị thấp khớp, rối loạn tiêu hóa, nhiễm trùng răng miệng.
  • Callicarpa rubella: Vỏ dùng trị khối u ruột già ở Ấn Độ; lá và phần trên mặt đất dùng trị vết thương, bỏng ở Trung Quốc.
  • Callicarpa thozetii A.A. Munir: Bộ lạc tại thung lũng Torres (nằm giữa Papua New Guinea và Australia) sử dụng nước ép lá trộn với các loài cây khác nhằm gây vô sinh.

Tình hình nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới

Các công trình quốc tế đã phân lập được hơn 200 hợp chất từ chi Callicarpa thuộc các nhóm chính:

  • Monoterpenoid: Phân lập từ C. formosana, C. nudiflora, C. japonica gồm 4-terpineol, nudifloside, linearoside, 6-O-trans-cinnamoylphlorigidoside B, 6-O-trans-p-coumaroylshanzhiside methyl ester, 4-O-trans-p-coumaroylmussaenoside, 2-methoxy-9-methyl-3-oxabicyclo nonane-7,9-diol.
  • Sesquiterpenoid: β-caryophyllene, aromadendrene II, 7-epi-α-selinene, (1β,6α)-eudesm-4(15)-ene-1,6-diol, (-)-clovane-2β,9α-diol, (9β)-caryolane-1,9-diol, dendrolasin, 1-octen-3-ol, 2-hexenal, 2,4-hexadienal, 2,4-heptadienal, epiglobulol từ C. japonica, C. macrophylla, C. pedunculata, C. integerrima.
  • Diterpenoid: Các khung abietane, totarane, clerodane, labdane, phyllocladane, pimarane, isopimarane như kochianic acid A-B, pedunculatic acid A-B, dehydroabietic acid, 7α,15-dihydroxydehydroabietic acid, macrophypene A, 12-deoxy-seco-hinokiol methyl ester, callicarpic acid A-B, hardwickiic acid, monomethyl kolavate, clerodermic acid methyl ester, pentandralactone, pentandranoic acid A-C, 16,17-dihydroxy-3-oxophyllocladane, calliterpenone-17-acetate, callilongisin D, 7α-hydroxy sandaracopimaric acid, isopimaric acid.
  • Triterpenoid: Các khung ursane, oleane, lupane như 2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid, pomolic acid, myrianthic acid, ursolic acid, oleanolic acid, 2α,3β,23-trihydroxyoleana-12-en-28-oic-O-β-D-glucopyranoside, sericoside, betulinic acid, squalene.
  • Flavonoid: Khung flavon, flavonol và các dẫn xuất C-/O-glycoside như apigenin-6,8-di-C-β-D-glucopyranoside, ayanin, penduletin, luteolin-7-O-glucoside, 5-hydroxy-3,7,3',4'-tetramethoxyflavone, quercetin-7-O-β-D-glucoside.
  • Phenylethanoid và phenylpropanoid: Acteoside, forsythoside B, isoacteoside, 6-O-acetylacteoside, sesamin, caffeic acid, syringic acid, ferulic acid, protocatechuic acid, Z-tubuloside E.

Về hoạt tính sinh học, các nghiên cứu quốc tế đã ghi nhận tác dụng kháng viêm và tăng cường miễn dịch của dịch chiết C. nudiflora và C. kwangtungensis; tác dụng cầm máu chống huyết khối của C. nudiflora do hàm lượng phenylpropanoid cao; tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh chống độc tính glutamate và chống mất trí nhớ của acteoside từ C. dichotoma; hoạt tính kháng trực khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis H37Rv của 12-deoxy-11,12-dihydro-seco-hinokiol methyl ester và callicarpic acid B từ C. pilosissima; hoạt tính giảm đau của các dẫn xuất flavonoid từ C. bodinieri; hoạt tính chống oxy hóa dọn gốc tự do DPPH và hoạt tính kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Diplococcus pneumoniae.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù tiềm năng hóa học và hoạt tính sinh học của chi Callicarpa trên thế giới phong phú, nguồn tài nguyên của hai loài Callicarpa candicans và Callicarpa macrophylla tại Việt Nam chưa được nghiên cứu chi tiết về thành phần các nhóm chất tinh khiết cũng như phổ hoạt tính sinh học in vitro. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng việc khảo sát toàn diện thành phần tinh dầu, phân lập các chất thứ cấp phân cực và kém phân cực từ dịch chiết lá, xác định các cấu trúc mới và đánh giá độc tính tế bào in vitro trên các dòng ung thư thực nghiệm.


Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung phân tích và phương pháp xử lý mẫu thực vật

Quy trình nghiên cứu kết hợp chiết xuất phân đoạn, sắc ký tách tinh chế hợp chất, phân tích quang phổ xác định cấu trúc phân tử và thử nghiệm sinh học in vitro:

  1. Xử lý mẫu: Mẫu lá, thân cành và quả sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng râm, sấy khô ở 60°C đến khối lượng không đổi và nghiền thành bột nhỏ.
  2. Chiết phân đoạn: Bột lá được ngâm chiết 3 lần với methanol (ethanol) có hỗ trợ của thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết tổng được cô cất đuổi dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ dưới 50°C. Cặn dịch chiết tổng được phân tán vào nước rồi chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexane và ethyl acetate, thu được cặn n-hexane, cặn ethyl acetate và cặn nước.
Mẫu thực vật khô (nghiền nhỏ)
Cao chiết tổng MeOH/EtOH
Cặn n-hexane            Dịch nước còn lại
                   Cặn EtOAc       Cặn nước

Phương pháp chiết xuất và phân tích tinh dầu

Luận án áp dụng 2 quy trình chiết tách tinh dầu từ lá và hoa:

  • Chưng cất lôi cuốn hơi nước bằng bộ cất tinh dầu vi lượng: Sử dụng 200 g nguyên liệu mẫu lá cắt nhỏ trong bình cầu 2 lít, thêm nước cất với tổng thể tích không vượt quá 85% dung tích bình. Chưng cất liên tục trong 3–4 giờ, kiểm soát nhiệt độ nước ngưng tụ không quá 40°C.
  • Chưng cất lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng: Sử dụng 200 g mẫu nguyên liệu trong bình cầu 2 lít, công suất lò vi sóng 450 W, thời gian thực hiện 60 phút. Tinh dầu thu nhận được làm khan bằng Na2SO4 trong 1 giờ và bảo quản ở 4°C trong lọ thủy tinh tối màu.
  • Phân tích thành phần tinh dầu (GC-MS): Thực hiện trên hệ máy sắc ký khí Agilent Technologies HP7890A ghép nối đầu dò khối phổ Agilent Technologies HP5975C, sử dụng cột mao quản HP5-MS (kích thước 60 m × 0,25 mm, độ dày màng pha tĩnh 0,25 μm).

Phương pháp phân lập và tinh chế hợp chất

  • Sắc ký lớp mỏng (TLC & PTLC): Sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel DC-Alufolien 60 F254 và RP-18 F254S (độ dày 0,25 mm, Merck). Phát hiện vết chất dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 365 nm hoặc phun thuốc thử hiện màu dung dịch vanilin - H2SO4 5% trong methanol và hơ nóng.
  • Sắc ký cột (CC):
    • Sắc ký cột thường pha thuận: Pha tĩnh silica gel 60 (cỡ hạt 0,040–0,063 mm, 230–400 mesh, Merck).
    • Sắc ký cột pha đảo: Pha tĩnh YMC RP-18 (cỡ hạt 30–50 μm, Fujisilica Chemical Ltd.).
    • Sắc ký rây phân tử qua gel: Pha tĩnh Sephadex LH-20 (Merck).
  • Hệ thống HPLC-MSD: Máy Agilent 1200 Ion Trap kiểm tra độ sạch và khối phổ của phân đoạn.

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Cấu trúc hóa học của các chất phân lập được xác định thông qua kết hợp các thông số vật lý và kỹ thuật phổ:

  • Độ nóng chảy (mp): Đo trên thiết bị Kofler micro-hotstage.
  • Năng suất quay cực ([α]D): Đo trên phân cực kế tự động JASCO DIP-1000 KUY.
  • Phổ khối lượng (MS): Phổ khối ion hóa phun mù điện tử ESI-MS đo trên máy Agilent 1200 Trap; phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy phổ kế khối lượng FT-ICR-MS tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker Avance 500 MHz (chất chuẩn nội TMS; các dung môi CDCl3, CD3OD, DMSO-d6):
    • Phổ 1D-NMR: 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT-90, DEPT-135.
    • Phổ 2D-NMR: HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY.

Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

  • Hoạt tính gây độc tế bào in vitro: Đánh giá bằng phương pháp Sulforhodamine B (SRB) và phương pháp MTT trên các dòng tế bào ung thư người: ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (Lu-1, A549), ung thư tiền liệt tuyến (PC3), ung thư vú (MCF-7). Đánh giá hiệu lực qua giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào).
  • Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Đánh giá khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Đặc điểm chung về thực vật học chi Callicarpa

Chương 1 tổng hợp tổng quan tài liệu về đặc điểm thực vật học, phân loại họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) và chi Callicarpa trên thế giới và tại Việt Nam. Chương này phân tích chi tiết các kết quả nghiên cứu dược lý học dân gian, hóa thực vật và hoạt tính sinh học đã công bố của hơn 20 loài trong chi. Các nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp chính được phân loại cấu trúc gồm monoterpenoid, sesquiterpenoid, diterpenoid (khung abietane, clerodane, labdane, phyllocladane), triterpenoid (khung ursane, oleane, lupane), flavonoid và phenylethanoid glycoside. Chương 1 làm nổi bật hoạt tính chống ung thư, kháng viêm, chống lao, bảo vệ thần kinh của các hợp chất tự nhiên từ chi Callicarpa, xác lập cơ sở lý thuyết định hướng việc chiết tách và đánh giá hoạt tính của 2 loài Callicarpa candicans và Callicarpa macrophylla tại Việt Nam.

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu thực vật thu hái tại huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên vào tháng 10 năm 2017 (số hiệu CA20171001.HN và CA20171002.HN). Trình bày hệ thống hóa quy trình thực nghiệm:

  • Sơ đồ chiết xuất mẫu lá cây Tử châu lá to (C. macrophylla) và Nàng nàng (C. candicans) bằng dung môi methanol qua hỗ trợ siêu âm, sau đó phân tách lỏng - lỏng thu cặn n-hexane, cặn ethyl acetate và cặn nước.
  • Quy trình phân lập các hợp chất sạch từ cặn n-hexane và cặn ethyl acetate của lá 2 loài bằng sắc ký cột silica gel thường, pha đảo RP-18 và rây phân tử Sephadex LH-20.
  • Phương pháp chưng cất tinh dầu lôi cuốn hơi nước cổ điển và chưng cất lôi cuốn hơi nước có hỗ trợ vi sóng; phương pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu bằng GC-MS.
  • Nguyên lý đo đạc các dữ liệu quang phổ (ESI-MS, HR-ESI-MS, 1D-NMR, 2D-NMR) để giải mã cấu trúc phân tử.
  • Quy trình thử nghiệm độc tính tế bào in vitro bằng phương pháp nhuộm SRB/MTT trên các dòng tế bào ung thư Hep-G2, Lu-1, MCF-7, PC3, A549 và phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các phát hiện thực nghiệm của luận án về thành phần tinh dầu, cấu trúc hóa học của 18 hợp chất phân lập được và hoạt tính sinh học của các phân đoạn cũng như các hợp chất sạch.

1. Thành phần hóa học của tinh dầu

Phân tích GC-MS thành phần hóa học của tinh dầu thu được từ các bộ phận lá và hoa của loài Nàng nàng (C. candicans) và lá cây Tử châu lá to (C. macrophylla):

  • Tinh dầu lá Nàng nàng thu được qua các phương pháp: lá tươi cất thông thường, lá khô cất thông thường, hoa cất thông thường và lá tươi chưng cất có hỗ trợ vi sóng.
  • Tinh dầu lá tươi loài Tử châu lá to phân tích trên cột mao quản HP5-MS xác định các hợp chất terpenoid bay hơi đặc trưng.

2. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ lá cây Tử châu lá to và Nàng nàng

Từ cặn chiết n-hexane và ethyl acetate của lá hai loài nghiên cứu, luận án đã phân lập và xác định cấu trúc 18 hợp chất thuộc các nhóm diterpenoid, triterpenoid, steroid và flavonoid, trong đó có 02 hợp chất mới:

Ký hiệu Tên hợp chất Phân nhóm hóa học Nguồn gốc loài phân lập Ghi chú cấu trúc
M1 Callimacrophylla A Diterpenoid C. macrophylla Hợp chất mới
M7 ent-1β-acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on Diterpenoid (kaurane) C. macrophylla Đã biết
C5 Seco-hinokiol Diterpenoid (abietane) C. candicans Đã biết
C6 Methyl seco-hinokiol Diterpenoid (abietane) C. candicans Đã biết
M8 Callimacrophylla B Triterpenoid C. macrophylla Hợp chất mới
M2 3β-hydroxyolean-12-ene Triterpenoid (oleane) C. macrophylla Đã biết
M3 β-amyrin Triterpenoid (oleane) C. macrophylla Đã biết
M10 Oleanolic acid Triterpenoid (oleane) C. macrophylla Đã biết
M6 Ursolic acid Triterpenoid (ursane) C. macrophylla Đã biết
C7 2α-hydroxy-ursolic acid Triterpenoid (ursane) C. candicans Đã biết
C8 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid Triterpenoid (ursane) C. candicans Đã biết
M5 Spinasterol Steroid C. macrophylla Đã biết
M4 β-sitosterol Steroid C. macrophylla Đã biết
M9 Daucosterol Steroid glycoside C. macrophylla Đã biết
C1 5-hydroxy-7,4'-dimethoxyflavon Flavonoid (flavone) C. candicans Đã biết
C3 5-hydroxy-3',4',7-trimethoxyflavon Flavonoid (flavone) C. candicans Đã biết
C9 Genkwanin Flavonoid (flavone) C. candicans Đã biết
C10 Cynaroside Flavonoid glycoside C. candicans Đã biết
  • Xác định cấu trúc hợp chất mới Callimacrophylla A (M1): Phổ HR-ESI-MS xác định công thức phân tử; các phổ 1D-NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và phổ 2D-NMR (HSQC, HMBC) xác lập khung carbon diterpenoid và các vị trí nhóm thế hydroxy, carbonyl và liên kết đôi.
  • Xác định cấu trúc hợp chất mới Callimacrophylla B (M8): Cấu trúc phân tử được làm sáng tỏ dựa trên phân tích tương tác qua liên kết và không gian từ phổ HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, 1H-1H COSY và phổ NOESY xác định cấu hình lập thể của các tâm bất đối xứng.

3. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học

  • Hoạt tính sinh học của tinh dầu:
    • Tinh dầu lá Nàng nàng (C. candicans): Thử nghiệm gây độc tế bào in vitro trên 3 dòng tế bào ung thư gồm ung thư gan (Hep-G2), ung thư tiền liệt tuyến (PC3) và ung thư phổi (A549); đánh giá hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật kiểm định.
    • Tinh dầu lá tươi Tử châu lá to (C. macrophylla): Thử nghiệm gây độc tế bào in vitro trên các dòng ung thư Hep-G2, PC3, A549 và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.
  • Hoạt tính gây độc tế bào của các cặn chiết:
    • Khảo sát độc tính tế bào in vitro của cặn chiết tổng methanol từ lá, quả và thân cành của cả 2 loài C. macrophylla và C. candicans.
    • Khảo sát độc tính tế bào của các cặn chiết phân đoạn (n-hexane, ethyl acetate, nước) từ lá cây Tử châu lá to và Nàng nàng.
  • Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất sạch: Đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro của các hợp chất diterpenoid, triterpenoid, steroid và flavonoid phân lập được trên 3 dòng tế bào ung thư người gồm ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (Lu-1) và ung thư vú (MCF-7), ghi nhận các giá trị nồng độ ức chế IC50 thực nghiệm.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

  1. Phát hiện các hợp chất có cấu trúc hóa học mới: Luận án đã phân lập, xác định công thức phân tử và cấu trúc không gian của 02 hợp chất mới từ lá cây Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla Vahl):
    • Hợp chất diterpenoid mới: Callimacrophylla A (ký hiệu M1).
    • Hợp chất triterpenoid mới: Callimacrophylla B (ký hiệu M8).
  2. Bổ sung dẫn liệu hóa thực vật: Luận án lần đầu tiên cung cấp hệ thống dữ liệu phổ nghiệm đầy đủ (HR-ESI-MS, ESI-MS, 1D-NMR, 2D-NMR gồm HSQC, HMBC, COSY, NOESY) của 18 hợp chất thuộc các lớp chất diterpenoid, triterpenoid, steroid và flavonoid từ lá hai loài C. candicans và C. macrophylla thu hái tại Việt Nam.
  3. Cung cấp dữ liệu thành phần tinh dầu: Xác định thành phần hóa học tinh dầu lá (tươi, khô, có hỗ trợ vi sóng) và hoa của loài Nàng nàng (C. candicans) cũng như tinh dầu lá tươi loài Tử châu lá to (C. macrophylla) bằng kỹ thuật GC-MS.

Những đóng góp mới về mặt thực tiễn và hoạt tính sinh học

  1. Cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên các dòng ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1, A549), tiền liệt tuyến (PC3) và vú (MCF-7) của các mẫu tinh dầu, cao chiết phân đoạn và các hợp chất tinh khiết phân lập được từ hai loài nghiên cứu.
  2. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu lá hai loài C. candicans và C. macrophylla.
  3. Kết quả nghiên cứu tạo nền tảng khoa học giải thích tác dụng điều trị trong dân gian của các loài thuộc chi Callicarpa, đồng thời cung cấp nguồn dữ liệu thực nghiệm phục vụ định hướng khai thác và sử dụng nguồn dược liệu tự nhiên của Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Bộ phận nghiên cứu: Mặc dù luận án có khảo sát sơ bộ cặn chiết tổng từ thân cành và quả, quá trình phân lập sâu các hợp chất sạch chỉ mới tập trung chủ yếu trên bộ phận lá của hai loài cây.
  • Phạm vi thu hái: Mẫu nguyên liệu phục vụ nghiên cứu chỉ mới thu hái tại một địa điểm (huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên) vào một thời điểm (tháng 10/2017), chưa so sánh biến thiên hàm lượng hoạt chất theo mùa và theo các vùng sinh thái địa lý khác nhau.
  • Mức độ thử nghiệm sinh học: Các thử nghiệm hoạt tính sinh học mới dừng lại ở quy mô in vitro (độc tế bào ung thư và kháng vi sinh vật kiểm định), chưa tiến hành nghiên cứu cơ chế tác động phân tử chuyên sâu hay thử nghiệm dược lý trên mô hình động vật in vivo đối với 2 hợp chất mới M1 và M8.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Tiếp tục nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ các phân đoạn còn lại của thân cành, rễ và quả của hai loài Callicarpa candicans và Callicarpa macrophylla.
  • Mở rộng phạm vi thu thập mẫu ở các vùng địa lý khác nhau trên cả nước để đánh giá biến thiên thành phần hóa học và hàm lượng tinh dầu.
  • Tiến hành thử nghiệm sâu hơn về cơ chế tác động tế bào, khả năng ức chế sinh trưởng khối u và độc tính in vivo của các hợp chất mới (Callimacrophylla A, Callimacrophylla B) và các dẫn xuất terpenoid có hoạt tính cao.

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo chuyên môn cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

  • Cán bộ nghiên cứu, nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược và Dược học: Có thể tham khảo chi tiết quy trình chiết xuất phân đoạn lỏng - lỏng, kỹ thuật sắc ký cột phân lập các hợp chất terpenoid và flavonoid kém phân cực và phân cực trung bình, cũng như phương pháp chưng cất tinh dầu có hỗ trợ vi sóng.
  • Các nhà nghiên cứu cấu trúc phân tử: Phần phân tích phổ nghiệm 1D-NMR, 2D-NMR (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) và HR-ESI-MS của 02 hợp chất mới (Callimacrophylla A, Callimacrophylla B) là tài liệu tham khảo trực tiếp cho việc biện giải cấu trúc các khung diterpenoid và triterpenoid phức tạp.
  • Các cơ sở nghiên cứu sàng lọc dược chất sinh học: Dữ liệu thử nghiệm độc tính tế bào ung thư in vitro (phương pháp SRB và MTT trên dòng Hep-G2, Lu-1, MCF-7, PC3, A549) và kháng vi sinh vật kiểm định cung cấp dẫn liệu tham chiếu thực nghiệm cho việc sàng lọc hoạt chất từ thảo dược họ Verbenaceae.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phát hiện những hợp chất hóa học mới nào?

Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 02 hợp chất mới từ lá loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla Vahl):

  • Callimacrophylla A (ký hiệu M1): Hợp chất mới thuộc nhóm diterpenoid.
  • Callimacrophylla B (ký hiệu M8): Hợp chất mới thuộc nhóm triterpenoid.

2. Mẫu thực vật nghiên cứu được thu thập ở đâu và được định danh như thế nào?

Mẫu lá, thân cành và quả của loài Nàng nàng (Callicarpa candicans) và Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla) được thu hái tại huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên vào tháng 10 năm 2017. Tên khoa học của hai loài được TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định, với số tiêu bản lưu giữ tại Bảo tàng là CA20171001.HN (C. candicans) và CA20171002.HN (C. macrophylla).

3. Những kỹ thuật phổ nghiệm nào được sử dụng để xác định cấu trúc các hợp chất tinh chế?

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định thông qua tổ hợp các kỹ thuật:

  • Đo điểm nóng chảy (mp) trên máy Kofler micro-hotstage và độ quay cực ([α]D) trên máy JASCO DIP-1000 KUY.
  • Phổ khối lượng ESI-MS trên máy Agilent 1200 Trap và phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS trên máy FT-ICR-Mass spectrometer.
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đo trên máy Bruker Avance 500 MHz gồm phổ 1D (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và phổ 2D (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY) với chất chuẩn nội TMS trong các dung môi CDCl3, CD3OD hoặc DMSO-d6.

4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất sạch và cao chiết được thử nghiệm trên những dòng tế bào nào?

Hoạt tính gây độc tế bào in vitro được đánh giá bằng phương pháp SRB và MTT trên các dòng tế bào ung thư người gồm: ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (Lu-1, A549), ung thư tiền liệt tuyến (PC3) và ung thư vú (MCF-7), cùng với thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.

5. Phương pháp chưng cất tinh dầu có hỗ trợ vi sóng trong luận án được tiến hành theo thông số nào?

Quá trình chưng cất lôi cuốn hơi nước có hỗ trợ vi sóng được thực hiện với 200 g nguyên liệu lá trong bình cầu dung tích 2 lít, công suất vi sóng thiết lập ở mức 450 W, thời gian tách chiết trong 60 phút; tinh dầu sau đó được làm khan bằng Na2SO4 và bảo quản ở nhiệt độ 4°C.


Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Vũ Thị Thu Lê đã hoàn thành việc nghiên cứu thành phần hóa học và thử nghiệm hoạt tính sinh học của loài Nàng nàng (Callicarpa candicans) và Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla) thu hái tại Thái Nguyên, Việt Nam. Công trình đã phân lập và xác định cấu trúc 18 hợp chất từ lá hai loài cây này, trong đó công bố 02 hợp chất mới là Callimacrophylla A (diterpenoid) và Callimacrophylla B (triterpenoid). Đồng thời, luận án đã phân tích thành phần hóa học tinh dầu và cung cấp dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung thư người (Hep-G2, Lu-1, MCF-7, PC3, A549) cùng hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. Các kết quả đạt được đóng góp dữ liệu khoa học có hệ thống cho lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên và cung cấp cơ sở tham khảo cho việc nghiên cứu phát triển nguồn dược liệu chi Callicarpa tại Việt Nam.