CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT Cây hà thủ ô trắng còn có tên là hà thủ ô nam, bạch hà thủ ô, củ vú bò, dây sữa bò, dây mốc, cây sừng bò cây đa lông, khâu cần cà (Thổ), khâu nước (Lạng Sơn), mã liên an, mã lìn ón, khua mak tang ning (Lào), khua khao (Luang Prabang), chừa ma sìn (Thái). Thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae). Cây và củ hà thủ ô trắng 1.
Mô tả chung Hà thủ ô trắng là một loại dây leo dài từ 2 đến 5m. Thân và cành màu hơi đỏ hay nâu đỏ, có rất nhiều lông, khi già thì nhẵn dần. Lá mọc đối, hình mác dài, đầu nhọn, đáy tròn hoặc hơi hình nón cụt, có lông mịn và nhiều ở mặt dưới, mặt trên cũng có lông ngắn hơn. Phiến lá dài 4-14 cm, rộng 2-9 cm, cuống lá dài 5-8 cm cũng có nhiều lông.
Hoa màu nâu nhạt hoặc vàng tía mọc thành xim, rất nhiều lông. Quả đại tách đôi ngang ra trông như sừng bò. Quả hình thoi, màu xám nhiều lông, dài 7-11 cm, rộng 8 mm. Hạt dẹt, phồng ở lưng, dài 5-7 mm, rộng 2 mm, có chùm lông mịn dài 2 cm.
Toàn cây bấm thân, lá, quả non chỗ nào cũng ra thứ nhựa trắng như sữa. Rễ củ dài mẫm và trắng, giữa có lõi trông như củ sắn nhưng có vị đắng.[1] 2 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên 1. Vùng phân bố Cây hà thủ ô trắng mọc hoang ở khắp những đồi núi trọc ở nước ta. Thường ưa những nơi đất đồi cứng vùng Vĩnh Phúc, Hà Tây, Hà Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng, Lạng Sơn.[1] Ngoài ra, cây còn mọc ở Trung Quốc, Campuchia, Ấn Độ, Indonesia, Lào, Myanmar, Thái Lan.
CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH 1. Dược tính theo y học cổ truyền Cây hà thủ ô trắng làm cho người già trẻ lại, giúp cho sự giao hợp được bền lâu, tóc bạc hóa đen. Người ta dùng củ và thân lá cây chữa cảm sốt, cảm nắng, sốt rét.[1] Dịch trích nước rễ cây hà thủ ô trắng dùng giải độc, chữa cảm sốt, trị vết sưng đau, vết thương do rắn cắn, làm thuốc bổ cho các bệnh khác như thấp khớp, suy nhược thần kinh, và chứng khó tiêu. Nghiên cứu về dược tính Năm 2002, có nghiên cứu dùng cao chiết cồn đậm đặc của rễ củ hà thủ ô trắng tăng cholesterol ngoại sinh trên chuột.
Ngoài ra, trong dịch chiết của cây hà thủ ô trắng có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư bạch cầu HL-60 ở người đáng kể. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC Năm 2003, Jun-ya Ueda và cộng sự đã phát hiện ra hai mươi mốt hợp chất: acovenosigenin A digitoxoside (1), digitoxigenin gentiobioside (2), digitoxigenin 3-O- [O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 6)–O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 4)-3-O-acetyl-β-D- 2 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên digitoxopyranoside] (3), digitoxigenin 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 6)–O-β-D- glucopyranosyl-(1 → 4)–O-β-D-digitalopyranosyl-(1 → 4)–β-D-cymaropyranoside] (4), periplogenin 3-O-(4-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-digitalopyranoside) (5), (4R)-4- hydroxy-3- (1-metyletyl)pentyl rutinoside (6), (R)-2-etyl-3-metylbutyl rutinoside (7), acovenosigenin A (8), periplogenin 3-O-β-digitoxoside (9), periplocymarin (10), periplogenin (11), digitoxigenin (12), digitoxigenin 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 6)–O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 4)–β-D-digitoxopyranoside] (13), digitoxigenin sophoroside (14), echujin (15), periplogenin glucoside (16), corchorusoside C (17), subalpinoside (18), acid caffeic (19), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (20), 2-phenylethyl rutinoside (75). Rashan và cộng sự đã cô lập thêm sáu hợp chất cũng có khung cardenolide: 17-H-periplogenin-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-acetyl-β-D- digitalopyranoside (42), oleandrin (43), oleandrigenin-3-O-β-D-sarmentoside (44), neritaloside (45), odoroside H (46), odoroside A (47). 5 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên 6 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên 7 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên 8 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên Chú thích: 9 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.
HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP 2. Hoá chất Silica gel 37 – 63 μm, Himedia dùng cho sắc kí cột. Sắc kí lớp mỏng loại DC - Alufolein 20×20, Kiesel gel 60 F , Merck. 254 Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, chloroform , ethyl acetate, acetone, methanol, acetic acid và nước cất.
Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên lớp mỏng: sử dụng H2SO4 20%. Thiết bị Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu. Máy cô quay chân không. Bếp cách thuỷ.
Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm. Cân điện tử. Phương pháp tiến hành Phương pháp phân lập các hợp chất Cô lập các hợp chất hữu cơ bằng phương pháp sắc kí, bao gồm kỹ thuật sắc kí cột silica gel pha thường và sắc kí lớp mỏng. Được hiện hình bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 20%.
Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), 2D-NMR trên máy Bruker Avance được ghi tại phòng NMR, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18, Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội. Thu hái nguyên liệu Mẫu cây dùng trong nguyên cứu đề tài là rễ cây hà thủ ô trắng (Streptocaulon 10 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên juventas (Lour) Merr.) được thu hái ở Tịnh Biên tỉnh An Giang vào tháng 10 năm 2016. Mẫu cây đã được Th.S Hoàng Việt, trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh nhận danh tên khoa học là “Streptocaulon juventas”, họ Thiên lý (Asclepiadaceae). Xử lý mẫu nguyên liệu Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn.
ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Bột rễ cây hà thủ ô được đun hoàn lưu với dung môi methanol ở nhiệt độ 64-65oC, mỗi mẽ đun 3 lần mỗi lần đun trong 3 giờ. Sau đó đem lọc, thu được dịch, rồi đem cô quay với áp suất thấp thu được cao methanol thô. Cao methanol thô được chiết lỏng – lỏng với dung môi chloroform, cô quay dịch chiết thu được cao chloroform. Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.
Bột rễ hà thủ ô (20 kg) - Trích nóng với methanol - Lọc bã Bã khô Dịch methanol Cô quay thu hồi dung môi Cao methanol Methanol thu hồi thô (2.02 kg) - Chiết lỏng – lỏng với dung môi chloroform. - Cô quay thu hồi dung môi Cao chloroform Cao còn lại (400g) Sơ đồ 2. Quy trình điều chế cao chloroform từ rễ cây hà thủ ô trắng 11 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên 2. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO CHLOROFORM 2.
Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform Cao chloroform (400g) được sắc kí cột (SKC) silica gel, giải lý với hệ dung môi H:EA có độ phân cực tăng dần từ 0% đến 100% EA, sau đó giải ly lần lượt với các hệ dung môi EA:Me 9:1, EA:Me:H2O 8:1:1, EA:Me:H2O 4:1:1, EA:Me:H2O 2:1:1 và 100%Me. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ theo dõi quá trình giải ly bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM). Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn. Kết quả thu được 12 phân đoạn (A-L) Bảng 2.
Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform Khối lượng Sắc kí lớp STT Phân đoạn Dung môi giải ly Ghi chú (g) mỏng 1 A H 3.6 Nhiều vết Chưa khảo sát 2 B H: EA 99:1 5.0 Nhiều vết Chưa khảo sát 3 C H:EA 95:5 5.6 Nhiều vết Khảo sát 4 D H:EA 9:1 6.0 Nhiều vết Đã khảo sát 5 E H:EA 85:15 8.4 Nhiều vết Chưa khảo sát 6 F H:EA 8:2 13 Nhiều vết Chưa khảo sát 7 G H:EA 1:1 19.6 Nhiều vết Chưa khảo sát 8 H EA 26.8 Nhiều vết Chưa khảo sát 9 I EA:Me 9:1 31.0 Nhiều vết Chưa khảo sát 10 J EA:Me:H2O 8:1:1 41.2 Nhiều vết Chưa khảo sát 11 K EA:Me:H2O 4:1:1 53 Nhiều vết Chưa khảo sát 12 L EA:Me:H2O 2:1:1 71.6 Vệt dài Chưa khảo sát Ghi chú: H: hexan, EA: ethyl acetat, Me: methanol, H2O: nước. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C của bảng 2.1 Phân đoạn C cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn C được thực hiện SKC silica gel, giải ly với hệ dung môi H:C:EA có độ kém phân cực giảm dần từ 100% đến 0% H và tỉ lệ C:EA là 1:1 được giữ nguyên. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 12 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên Bảng 2.
Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C Khối lượng Sắc kí lớp STT Phân đoạn Dung môi giải ly Ghi chú (mg) mỏng 1 C.4 Nhiều vết Chưa khảo sát 2 C.4 Nhiều vết Chưa khảo sát 3 C.2 Nhiều vết Khảo sát 4 C.9 Nhiều vết Chưa khảo sát 5 C.6 Nhiều vết Chưa khảo sát Ghi chú: H: hexan, C: Chloroform, EA: ethyl acetat. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C.3 cho SKLM hai vết tách rõ nên phân đoạn C.3 được SKC silica gel với hệ dung môi H:C:EA 40:1:1, sau đó giải ly tiếp tục với hệ 30:1:1. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 5 phân đoạn (C.5), được trình bày trong bảng 2.
Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C.3 Khối lượng Sắc kí lớp STT Phân đoạn Dung môi giải ly Ghi chú (mg) mỏng 1 C.4 1 vết tách rõ Chưa khảo sát 2 C.7 2 vết tách rõ Chưa khảo sát 3 C.6 1 vết tách rõ Khảo sát 4 C.9 2 vết tách rõ Khảo sát 5 C.6 1 vết tách rõ Khảo sát Phân đoạn C.3 có SKLM cho vết rõ có màu cam, thu được hợp chất có dạng hình vảy, màu trắng.5 có SKLM cho vết rõ màu nâu, thu được hợp chất có dạng hình kim màu trắng.4, qua một lần SKC tách ra hai vết trùng với phân đoạn C. Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2. 13 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên Cao chloroform 400 g - Sắc kí cột silica gel - Giải ly H:EA, EA:Me:H2O - Cô quay thu hồi dung môi A B C D E F G H I J K L 3.6 g g g g g g g g g g g g - Sắc kí cột silica gel - Giải ly H:C:EA C.6 mg mg mg mg mg - Sắc kí cột silica gel - Giải ly H:C:EA C.4 mg mg mg mg mg Q1 Q2 394. Quy trình cô lập hợp chất 14 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.
KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT Q2 Hợp chất Q2 (427.6 mg) thu được từ phân đoạn C.5 có những đặc điểm như sau: - Dạng tinh thể hình kim, màu trắng, hòa tan được trong dung môi chloroform. - Sắc kí lớp mỏng cho một vết duy nhất khi hiện hình bằng H2SO4 20%, hơ nóng bảng mỏng cho vết có màu nâu (dung môi giải ly hexan:chloroform:ethyl acetat 8:1:1, Rf = 0. - Phổ 1H-NMR (CDCl3, phụ lục 1, Bảng 3.