Luận Văn Thạc Sĩ Về Thành Phần Hóa Học Cao Chloroform Rễ Cây Hà Thủ Ô Trắng

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu góp phần tìm hiểu thành phần hóa học cao chloroform rễ cây hà thủ ô trắng, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện pháp hoàn thiện trong

• Tác giả: Trần Thị Tú Quyên
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Xuân Hào
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Hóa Học
• Đề tài: Khám Phá Thành Phần Hóa Học Cao Chloroform Từ Rễ Cây Hà Thủ Ô Trắng
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
• 1.2. Mô tả chung
• 1.3. Vùng phân bố
• 1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH
• 1.4.1. Dược tính theo y học cổ truyền
• 1.4.2. Nghiên cứu về dược tính
• 1.5. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Phương pháp tiến hành
• 2.2. Thu hái nguyên liệu
• 2.3. Xử lý mẫu nguyên liệu
• 2.4. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO
• 2.5. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO CHLOROFORM
• 2.5.1. Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform
• 2.5.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C của bảng 2
• 2.5.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C.3
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT Q2
• 3.2. KHẢO SÁT HỢP CHẤT Q1
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về cây Hà Thủ Ô Trắng

Cây Hà Thủ Ô Trắng, có tên khoa học là Streptocaulon juventas, thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae). Cây này được biết đến với nhiều công dụng trong y học cổ truyền, như làm trẻ hóa cơ thể, hỗ trợ sức khỏe sinh lý và điều trị một số bệnh như cảm sốt, đau lưng. Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về các hợp chất có trong nó mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các loại thuốc từ thiên nhiên. Việc chiết xuất Cao Chloroform từ rễ cây Hà Thủ Ô Trắng là một trong những phương pháp hiệu quả để thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Kết quả từ nghiên cứu này có thể cung cấp những chứng cứ khoa học cho nền y học cổ truyền Việt Nam.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua các phương pháp chiết xuất và phân tích hóa học. Rễ cây Hà Thủ Ô Trắng được thu hái, rửa sạch, phơi khô và xay thành bột mịn. Sau đó, bột rễ được chiết xuất bằng dung môi methanol và tiếp tục chiết lỏng-lỏng với Cao Chloroform. Các hợp chất hữu cơ trong Cao Chloroform được cô lập bằng phương pháp sắc ký cột silica gel. Phân tích cấu trúc của các hợp chất được thực hiện bằng các kỹ thuật như NMR (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) và sắc ký lớp mỏng. Phương pháp này cho phép xác định các hợp chất có trong rễ cây và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy từ Cao Chloroform, hai hợp chất chính đã được cô lập là Q1 và Q2. Hợp chất Q2 có cấu trúc được xác định là 11-oxo-α-amyrin acetate, với các đặc điểm như dạng tinh thể hình kim, màu trắng và hòa tan trong dung môi chloroform. Hợp chất Q1, mặc dù chưa được xác định cấu trúc rõ ràng do độ tinh khiết chưa đạt yêu cầu, nhưng cũng cho thấy tiềm năng trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm. Các hợp chất này có thể có tác dụng ức chế tế bào ung thư, mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc điều trị bệnh. Việc phân tích các hợp chất này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu khoa học mà còn có thể ứng dụng trong y học hiện đại.

IV. Kết luận

Nghiên cứu về thành phần hóa học của Cao Chloroform từ rễ cây Hà Thủ Ô Trắng đã cho thấy những kết quả khả quan. Các hợp chất được cô lập không chỉ có giá trị trong việc phát triển thuốc mà còn góp phần củng cố nền tảng khoa học cho y học cổ truyền. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các hợp chất này sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực dược phẩm, đặc biệt là trong việc điều trị các bệnh lý nghiêm trọng như ung thư. Kết quả nghiên cứu này khẳng định tầm quan trọng của việc khai thác và nghiên cứu các loại thảo dược trong y học hiện đại.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Khóa luận tốt nghiệp "Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học cao chloroform rễ cây hà thủ ô trắng Streptocaulon juventas" được thực hiện bởi sinh viên Trần Thị Tú Quyên dưới sự hướng dẫn của TS. Bùi Xuân Hào tại Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh (tháng 5 năm 2018). Đề tài thuộc lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên, tập trung vào đối tượng thực vật có giá trị dược liệu truyền thống lâu đời tại Việt Nam.

Cây hà thủ ô trắng có tên khoa học là Streptocaulon juventas (Lour.) Merr., thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae). Theo các ghi chép dược học cổ truyền, vị thuốc này được sử dụng nhằm mục đích bồi bổ cơ thể, giúp đen râu tóc, trị đau lưng nhức mỏi, cảm sốt, sốt rét, giải độc, trị vết thương do rắn cắn và hỗ trợ tiết sữa cho phụ nữ sau sinh. Bên cạnh kinh nghiệm dân gian, y học hiện đại đã ghi nhận các phân đoạn chiết và một số hoạt chất từ loài cây này có khả năng hạ cholesterol cũng như ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư ở người (như A549, HT-1080, HeLa, HL-60). Tuy nhiên, các dẫn liệu về thành phần hóa thực vật trong các phân đoạn chiết trung bình và kém phân cực của nguồn dược liệu thu hái tại Việt Nam vẫn cần được khảo sát liên tục và chuyên sâu.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể như sau:

1. Chiết xuất bột rễ củ hà thủ ô trắng bằng phương pháp ngâm chiết nóng hồi lưu với dung môi methanol, sau đó chiết phân bố lỏng - lỏng để thu nhận phân đoạn cao chloroform.
2. Ứng dụng các kỹ thuật sắc ký cột silica gel pha thường và sắc ký lớp mỏng để phân tách, tinh chế các hợp chất hữu cơ sạch từ phân đoạn cao chloroform.
3. Giải mã và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được bằng việc phân tích các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D-NMR và 2D-NMR, kết hợp so sánh với các tài liệu khoa học đã công bố.

Về đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu rễ củ cây hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas (Lour.) Merr., họ Asclepiadaceae) thu hái tại huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng 10 năm 2016. Mẫu thực vật đã được giám định tên khoa học bởi ThS. Hoàng Việt thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
• Phạm vi nghiên cứu: Tập trung cô lập và khảo sát thành phần hóa học trong phân đoạn cao chloroform điều chế từ 20 kg nguyên liệu rễ khô, thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh; dữ liệu phổ nghiệm được đo đạc tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Nghiên cứu được xây dựng trên cơ sở lý thuyết về hóa học hợp chất tự nhiên, kế thừa các công bố trong và ngoài nước về thành phần hóa thực vật của chi Streptocaulon. Các tài liệu tham khảo chính ghi nhận rễ hà thủ ô trắng chứa nhóm hoạt chất tiêu biểu là cardenolide glycoside (như các dẫn xuất của periplogenin, digitoxigenin, acovenosigenin A được phân lập bởi Jun-ya Ueda, Rashan, Rui Xue) cùng một số dẫn xuất triterpenoid và phenylpropanoid.

Phương pháp thực nghiệm được triển khai đồng bộ qua ba giai đoạn kỹ thuật:

1. Phương pháp chiết tách và xử lý mẫu:

   • Mẫu rễ củ sau khi thu hái được rửa sạch, loại tạp, phơi khô trong bóng râm và xay thành bột mịn (tổng khối lượng 20 kg).
   • Quá trình chiết xuất áp dụng phương pháp đun hồi lưu nhiệt với dung môi methanol ở 64–65°C (3 mẻ, mỗi mẻ đun 3 lần, mỗi lần 3 giờ), sau đó lọc bỏ bã, cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để nhận cao methanol thô.
   • Cao methanol thô được phân tán và chiết lỏng - lỏng với dung môi chloroform, cô đuổi dung môi để thu cao tổng chloroform.

2. Phương pháp phân lập và tinh chế:

   • Sắc ký cột cổ điển (SKC): Sử dụng chất hấp phụ pha thường silica gel kích thước hạt 37–63 µm (Himedia). Quá trình giải ly sử dụng hệ dung môi gradient với độ phân cực tăng dần: n-hexane (H), ethyl acetate (EA), methanol (Me) và nước (H2O), phối hợp với hệ dung môi ba thành phần n-hexane : chloroform : ethyl acetate (H:C:EA).
   • Sắc ký lớp mỏng (SKLM): Thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel DC-Alufolein 20×20, Kieselgel 60 F254 (Merck).
   • Phát hiện chất: Soi dưới đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm; hiện hình vết hóa học bằng thuốc thử dung dịch acid sulfuric (H2SO4) 20% trong cồn kết hợp hơ nóng bản mỏng.

3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:

   • Sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều được ghi trên máy Bruker Avance tại Viện Hóa học (Hà Nội), bao gồm phổ proton 1H-NMR (tần số 500 MHz), phổ carbon 13C-NMR (tần số 125 MHz), cùng các phổ tương tác dị hạt nhân HSQC (tương tác trực tiếp 1J C-H) và HMBC (tương tác tầm xa qua 2 đến 3 liên kết 2,3J C-H). Dung môi đo phổ là chloroform pha deuterated (CDCl3).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa toàn diện các dữ liệu khoa học về loài Streptocaulon juventas:

• Đặc điểm thực vật học và phân bố: Cung cấp các tên gọi dân gian (hà thủ ô nam, bạch hà thủ ô, củ vú bò, dây sữa bò, dây mốc, khâu cần cà...). Mô tả chi tiết hình thái dây leo dài 2–5 m, thân cành nâu đỏ nhiều lông mịn, toàn cây có mủ trắng như sữa; quả đại tách đôi hình sừng bò dài 7–11 cm chứa hạt có chùm lông mượt; củ nạc màu trắng có lõi giữa mang vị đắng. Loài này phân bố tự nhiên ở các vùng đồi núi tại Việt Nam (Vĩnh Phúc, Hà Tây, Hà Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng, Lạng Sơn, An Giang) cùng một số quốc gia châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Lào, Campuchia, Thái Lan, Myanmar, Indonesia).
• Dược tính và hoạt tính sinh học: Tổng kết các bài thuốc dân gian trị suy nhược, sốt rét, thấp khớp, rắn cắn và bổ huyết. Khảo cứu các báo cáo dược lý hiện đại gồm tác dụng điều hòa lipid máu trên chuột thí nghiệm (Phạm Thanh Tâm, Trần Hùng, 2002) và hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư bạch cầu người HL-60.
• Thành phần hóa thực vật đã biết: Tổng hợp 21 hợp chất cardenolide và glycoside do Jun-ya Ueda cùng cộng sự cô lập năm 2003 (acovenosigenin A digitoxoside, periplogenin, digitoxigenin...), các nghiên cứu của Rashan (2011) về oleandrin, neritaloside, cùng các công bố quốc tế khác về khung cấu trúc triterpene và dẫn xuất acid quinic từ chi Streptocaulon.

Chương 2: Thực nghiệm

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thao tác phòng thí nghiệm từ khâu nguyên liệu ban đầu đến khi thu nhận các hợp chất tinh khiết:

• Xử lý và chiết xuất: Từ 20 kg bột rễ củ ban đầu, sau quá trình ngâm chiết nhiệt hồi lưu với methanol thu hồi được 2,02 kg cao methanol thô. Tiến hành chiết lỏng - lỏng phân bố với dung môi chloroform thu được 400 g cao chloroform.
• Sắc ký cột phân đoạn cao chloroform: 400 g cao chloroform được nạp lên cột silica gel, giải ly lần lượt bằng hệ H:EA (tỷ lệ từ 100% H đến 100% EA), tiếp nối bằng EA:Me (9:1), EA:Me:H2O (8:1:1, 4:1:1, 2:1:1) và 100% Me. Kết quả thu được 12 phân đoạn ký hiệu từ A đến L.

Phân đoạn	Dung môi giải ly	Khối lượng (g)	Tình trạng sắc ký lớp mỏng	Ghi chú
A	n-Hexane (H)	3,6	Nhiều vết	Chưa khảo sát
B	H : EA (99 : 1)	5,0	Nhiều vết	Chưa khảo sát
C	H : EA (95 : 5)	5,6	Nhiều vết tách rõ	Đã chọn khảo sát sâu
D	H : EA (9 : 1)	6,0	Nhiều vết	Đã khảo sát sơ bộ
E	H : EA (85 : 15)	8,4	Nhiều vết	Chưa khảo sát
F	H : EA (8 : 2)	13,0	Nhiều vết	Chưa khảo sát
G	H : EA (1 : 1)	19,6	Nhiều vết	Chưa khảo sát
H	100% EA	26,8	Nhiều vết	Chưa khảo sát
I	EA : Me (9 : 1)	31,0	Nhiều vết	Chưa khảo sát
J	EA : Me : H2O (8 : 1 : 1)	41,2	Nhiều vết	Chưa khảo sát
K	EA : Me : H2O (4 : 1 : 1)	53,0	Nhiều vết	Chưa khảo sát
L	EA : Me : H2O (2 : 1 : 1)	71,6	Vệt dài kéo đuôi	Chưa khảo sát

• Phân lập thứ cấp trên phân đoạn C: Phân đoạn C (5,6 g) tiếp tục được chạy sắc ký cột silica gel với hệ H:C:EA (giảm dần tỷ lệ n-hexane, giữ cố định C:EA tỷ lệ 1:1), thu được 5 phân đoạn phụ (C.1 đến C.5).
• Tinh chế hợp chất: Phân đoạn C.3 được sắc ký cột lặp lại với hệ dung môi H:C:EA (tỷ lệ 40:1:1 sau chuyển sang 30:1:1), tách ra được 5 phân đoạn nhỏ (C.3.1 đến C.3.5):
  • Phân đoạn C.3.3 kết tinh thu được chất Q1 (khối lượng 394,6 mg), dạng vảy màu trắng.
  • Phân đoạn C.3.5 kết tinh thu được chất Q2 (khối lượng 427,6 mg), dạng tinh thể hình kim màu trắng.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương này tập trung biện luận dữ liệu phổ để xác định cấu trúc hóa học của các chất cô lập:

• Xác định cấu trúc hợp chất Q2:
  • Dạng tinh thể hình kim màu trắng, tan trong CDCl3. SKLM cho một vết duy nhất hiển thị màu nâu khi hiện hình bằng H2SO4 20% và hơ nóng (hệ H:C:EA 8:1:1).
  • Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): Thể hiện tín hiệu của 8 nhóm methyl liên kết carbon bậc bốn (singlet), nổi bật mũi δH 0,95 ppm (3H, s, H-30); một nhóm acetoxy tại δH 2,05 ppm (3H, s, H-32); một proton olefinic bất bão hòa tại δH 5,54 ppm đặc trưng cho liên kết đôi.
  • Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): Xuất hiện 32 tín hiệu carbon trong khoảng δC 17–200 ppm, bao gồm: carbon carbonyl nhóm ceton tại δC 199,7 ppm; carbon carbonyl của nhóm ester tại δC 171,0 ppm; hai carbon của nối đôi olefin tại vùng δC 130 ppm.
  • Phổ HSQC và HMBC: HSQC xác nhận sự hiện diện của 9 nhóm methyl, 8 nhóm methylene (-CH2-), 6 nhóm methine (-CH-) và các carbon bậc bốn. Phổ HMBC xác lập các tương quan quan trọng: proton H-3 (δH 4,52 ppm) tương quan với carbon δC 28 ppm và nhóm acetyl; proton H-32 (δH 2,05 ppm) tương quan với carbon ester δC 171,0 ppm chứng minh nhóm acetate gắn tại vị trí C-3; proton H-9 (δH 2,35 ppm) tương quan với carbonyl δC 199,7 ppm chỉ rõ nhóm oxo gắn tại C-11.
  • Đối chiếu cấu trúc: So sánh với dữ liệu phổ của hợp chất 11-oxo-β-amyrin ethylated trong công bố của Iman Omer và cộng sự (2017), tác giả kết luận hợp chất Q2 có cấu trúc khung triterpenoid oleanane và xác định chính xác là 11-oxo-β-amyrin acetate.
• Khảo sát hợp chất Q1:
  • Dạng vảy màu trắng, vết SKLM kéo vệt ngắn, hiện màu cam với thuốc thử H2SO4 20% (hệ H:C:EA 9:0,4:0,4).
  • Phổ 1H-NMR sơ bộ ghi nhận hai proton thơm có tính đối xứng tại δH 8,095 ppm (mũi đơn) cùng cụm tín hiệu tại δH 4,x ppm. Tuy nhiên, do mẫu chất chưa đạt độ tinh khiết đồng nhất, phổ xuất hiện nhiều tín hiệu nhiễu xen lẫn nên chưa đủ cơ sở để quy kết cấu trúc hóa học hoàn chỉnh.

Chương 4: Kết luận và đề xuất

Tác giả đúc kết lại kết quả cô lập thành công và nhận diện cấu trúc của hợp chất Q2 từ phân đoạn cao chloroform của rễ cây hà thủ ô trắng. Khóa luận đưa ra các đề xuất tiếp nối:

1. Tiếp tục triển khai tinh chế mẫu Q1 để thu nhận chất sạch tuyệt đối phục vụ giải mã cấu trúc bằng hệ phổ NMR hoàn chỉnh.
2. Tiếp tục sắc ký khảo sát các phân đoạn còn tồn đọng (A, B, D đến L) nhằm tìm kiếm các hợp chất mới.
3. Đưa các hợp chất cô lập được vào thử nghiệm hoạt tính sinh học (đặc biệt là hoạt tính độc tế bào ung thư).

---

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu mang lại các kết quả thực nghiệm cụ thể và đóng góp học thuật rõ ràng:

Chỉ số / Hợp chất	Giá trị thực nghiệm ghi nhận	Đặc điểm nhận dạng / Cấu trúc
Nguyên liệu thô	20 kg rễ củ khô	Thu hái tại Tịnh Biên, An Giang (10/2016)
Cao methanol thô	2,02 kg	Đun hoàn lưu nhiệt 64–65°C với MeOH
Cao chloroform tổng	400 g	Chiết lỏng - lỏng từ cao methanol
Hợp chất Q2	427,6 mg	Tinh thể hình kim màu trắng; cấu trúc: 11-oxo-β-amyrin acetate
Hợp chất Q1	394,6 mg	Dạng vảy màu trắng; chứa tín hiệu proton vòng thơm đối xứng (δH 8,095 ppm)

Đóng góp khoa học của đề tài:

• Lần đầu tiên phát hiện và cô lập thành công hợp chất triterpenoid 11-oxo-β-amyrin acetate từ loài hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas). Kết quả này bổ sung một dẫn chất triterpene mới vào cơ sở dữ liệu hóa thực vật của loài, vốn trước đây chủ yếu tập trung vào các glycoside trợ tim nhóm cardenolide.
• Cung cấp tập dữ liệu thực nghiệm chi tiết về thông số phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D (1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC) của khung triterpenoid oleanane bị oxy hóa tại C-11, tạo nguồn dữ liệu đối chiếu tin cậy cho các nghiên cứu hóa thực vật tiếp theo.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên nội dung thực tế được tác giả trình bày trong khóa luận, công trình còn tồn tại một số điểm giới hạn:

• Độ tinh khiết của hợp chất Q1: Lượng chất Q1 thu được (394,6 mg) vẫn còn lẫn tạp chất dẫn đến phổ 1H-NMR chưa đủ độ phân giải sắc nét, khiến tác giả chưa thể quy kết công thức cấu tạo của chất này.
• Mức độ khảo sát phân đoạn: Toàn bộ nghiên cứu chuyên sâu chỉ mới thực hiện trên 5,6 g của phân đoạn C (chiếm tỷ lệ 1,4% khối lượng cao chloroform), trong khi 11 phân đoạn còn lại (với tổng khối lượng hơn 390 g) chưa được tách phân đoạn thứ cấp.
• Thử nghiệm sinh học: Khóa luận hoàn toàn dừng lại ở bước chiết tách và định danh hóa học, chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro (kháng viêm, độc tế bào hay kháng sinh) trên hợp chất Q2 thu được.

Hướng mở rộng được đề xuất:

• Tinh chế lại hợp chất Q1 bằng sắc ký lặp lại hoặc kết tinh phân đoạn trong hệ dung môi thích hợp để đo lại phổ NMR và phổ khối (MS).
• Mở rộng quy trình phân lập trên các phân đoạn có khối lượng lớn như phân đoạn G, H, I, J, K, L.
• Triển khai thử nghiệm sàng lọc hoạt tính kháng u và độc tế bào trên hợp chất 11-oxo-β-amyrin acetate.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị ứng dụng và tham khảo thiết thực cho các đối tượng sau:

• Sinh viên và học viên chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược, Dược học: Cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp phân lập hợp chất tự nhiên, từ kỹ thuật chiết hồi lưu, chiết lỏng - lỏng đến kỹ thuật lựa chọn dung môi giải ly cho sắc ký cột silica gel từng nấc.
• Người nghiên cứu phổ cấu trúc triterpenoid: Phần biện luận phổ của hợp chất Q2 là ví dụ thực tế hữu ích về cách kết hợp dữ liệu tương quan dị hạt nhân qua 1 liên kết (HSQC) và nhiều liên kết (HMBC) để quy kết vị trí nhóm chức thế (nhóm ceton tại C-11 và nhóm ester acetate tại C-3).
• Cơ sở dữ liệu dược liệu học: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm về thành phần hóa học của cây thuốc nam thu hái tại vùng Bảy Núi (Tịnh Biên, An Giang), phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa và định danh hóa thực vật nguồn dược liệu Việt Nam.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu rễ hà thủ ô trắng sử dụng trong đề tài được thu hái ở đâu và định danh như thế nào?
Mẫu rễ được thu hái tại huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng 10 năm 2016. Tên khoa học của mẫu được ThS. Hoàng Việt (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM) xác định chính xác là Streptocaulon juventas (Lour.) Merr., thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae).

2. Hiệu suất thu nhận các phân đoạn cao chiết từ nguyên liệu ban đầu đạt bao nhiêu?
Từ 20 kg bột rễ củ khô ban đầu, qua quá trình đun hoàn lưu với methanol đã điều chế được 2,02 kg cao methanol thô (đạt tỷ lệ khoảng 10,1%). Sau đó, chiết lỏng - lỏng phân bố với chloroform thu được 400 g cao chloroform (đạt tỷ lệ 2% so với bột rễ khô ban đầu).

3. Hợp chất Q2 được phân lập từ phân đoạn nào và được xác định là chất gì?
Hợp chất Q2 (khối lượng 427,6 mg) được phân lập từ phân đoạn phụ C.3.5 (thuộc phân đoạn C của cao chloroform). Qua phân tích phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC và đối chiếu tài liệu, chất Q2 được xác định là 11-oxo-β-amyrin acetate.

4. Dấu hiệu phổ nào chứng minh nhóm acetyl và nhóm ceton lần lượt nằm tại C-3 và C-11 trên hợp chất Q2?
Trên phổ HMBC, proton H-3 (δH 4,52 ppm) tương quan với carbon ester δC 171,0 ppm của nhóm acetyl (H-32 có δH 2,05 ppm cũng tương quan với carbon này), khẳng định nhóm acetate gắn tại C-3. Đồng thời, proton H-9 (δH 2,35 ppm) cho tương quan HMBC tầm xa trực tiếp đến carbon carbonyl ceton tại δC 199,7 ppm, chứng minh nhóm oxo (ceton) nằm tại vị trí C-11 của khung triterpene.

5. Vì sao tác giả chưa thể quy kết cấu trúc phân tử của hợp chất Q1?
Hợp chất Q1 (394,6 mg) thu được ở phân đoạn C.3.3 có dạng vảy trắng nhưng khi kiểm tra sắc ký lớp mỏng vẫn kéo vệt ngắn và phổ 1H-NMR ghi nhận mẫu chưa đạt độ tinh khiết cao, xuất hiện nhiều mũi tín hiệu phụ che khuất tín hiệu chính nên chưa đủ dữ liệu phổ học tin cậy để xác định cấu trúc.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Trần Thị Tú Quyên đã hoàn thành mục tiêu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn cao chloroform từ rễ cây hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas) thu hái tại Tịnh Biên, An Giang. Bằng kỹ thuật sắc ký cột silica gel pha thường kết hợp hệ dung môi gradient, tác giả đã cô lập thành công 427,6 mg hợp chất sạch Q2 và 394,6 mg hợp chất sơ bộ Q1. Dựa trên phân tích toàn diện hệ phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D (1H, 13C, HSQC, HMBC), cấu trúc của Q2 được chứng minh là 11-oxo-β-amyrin acetate – hoạt chất lần đầu tiên được ghi nhận hiện diện trong loài thực vật này. Công trình cung cấp dẫn liệu thực nghiệm có giá trị cho lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên và đóng góp cơ sở khoa học cho kho tàng dược liệu cổ truyền Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT Cây hà thủ ô trắng còn có tên là hà thủ ô nam, bạch hà thủ ô, củ vú bò, dây sữa bò, dây mốc, cây sừng bò cây đa lông, khâu cần cà (Thổ), khâu nước (Lạng Sơn), mã liên an, mã lìn ón, khua mak tang ning (Lào), khua khao (Luang Prabang), chừa ma sìn (Thái). Thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae). Cây và củ hà thủ ô trắng 1.

Mô tả chung Hà thủ ô trắng là một loại dây leo dài từ 2 đến 5m. Thân và cành màu hơi đỏ hay nâu đỏ, có rất nhiều lông, khi già thì nhẵn dần. Lá mọc đối, hình mác dài, đầu nhọn, đáy tròn hoặc hơi hình nón cụt, có lông mịn và nhiều ở mặt dưới, mặt trên cũng có lông ngắn hơn. Phiến lá dài 4-14 cm, rộng 2-9 cm, cuống lá dài 5-8 cm cũng có nhiều lông.

Hoa màu nâu nhạt hoặc vàng tía mọc thành xim, rất nhiều lông. Quả đại tách đôi ngang ra trông như sừng bò. Quả hình thoi, màu xám nhiều lông, dài 7-11 cm, rộng 8 mm. Hạt dẹt, phồng ở lưng, dài 5-7 mm, rộng 2 mm, có chùm lông mịn dài 2 cm.

Toàn cây bấm thân, lá, quả non chỗ nào cũng ra thứ nhựa trắng như sữa. Rễ củ dài mẫm và trắng, giữa có lõi trông như củ sắn nhưng có vị đắng.[1] 2 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên 1. Vùng phân bố Cây hà thủ ô trắng mọc hoang ở khắp những đồi núi trọc ở nước ta. Thường ưa những nơi đất đồi cứng vùng Vĩnh Phúc, Hà Tây, Hà Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng, Lạng Sơn.[1] Ngoài ra, cây còn mọc ở Trung Quốc, Campuchia, Ấn Độ, Indonesia, Lào, Myanmar, Thái Lan.

CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH 1. Dược tính theo y học cổ truyền Cây hà thủ ô trắng làm cho người già trẻ lại, giúp cho sự giao hợp được bền lâu, tóc bạc hóa đen. Người ta dùng củ và thân lá cây chữa cảm sốt, cảm nắng, sốt rét.[1] Dịch trích nước rễ cây hà thủ ô trắng dùng giải độc, chữa cảm sốt, trị vết sưng đau, vết thương do rắn cắn, làm thuốc bổ cho các bệnh khác như thấp khớp, suy nhược thần kinh, và chứng khó tiêu. Nghiên cứu về dược tính Năm 2002, có nghiên cứu dùng cao chiết cồn đậm đặc của rễ củ hà thủ ô trắng tăng cholesterol ngoại sinh trên chuột.

Ngoài ra, trong dịch chiết của cây hà thủ ô trắng có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư bạch cầu HL-60 ở người đáng kể. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC Năm 2003, Jun-ya Ueda và cộng sự đã phát hiện ra hai mươi mốt hợp chất: acovenosigenin A digitoxoside (1), digitoxigenin gentiobioside (2), digitoxigenin 3-O- [O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 6)–O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 4)-3-O-acetyl-β-D- 2 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên digitoxopyranoside] (3), digitoxigenin 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 6)–O-β-D- glucopyranosyl-(1 → 4)–O-β-D-digitalopyranosyl-(1 → 4)–β-D-cymaropyranoside] (4), periplogenin 3-O-(4-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-digitalopyranoside) (5), (4R)-4- hydroxy-3- (1-metyletyl)pentyl rutinoside (6), (R)-2-etyl-3-metylbutyl rutinoside (7), acovenosigenin A (8), periplogenin 3-O-β-digitoxoside (9), periplocymarin (10), periplogenin (11), digitoxigenin (12), digitoxigenin 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 6)–O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 4)–β-D-digitoxopyranoside] (13), digitoxigenin sophoroside (14), echujin (15), periplogenin glucoside (16), corchorusoside C (17), subalpinoside (18), acid caffeic (19), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (20), 2-phenylethyl rutinoside (75). Rashan và cộng sự đã cô lập thêm sáu hợp chất cũng có khung cardenolide: 17-H-periplogenin-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-acetyl-β-D- digitalopyranoside (42), oleandrin (43), oleandrigenin-3-O-β-D-sarmentoside (44), neritaloside (45), odoroside H (46), odoroside A (47). 5 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên 6 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên 7 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên 8 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên Chú thích: 9 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.

HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP 2. Hoá chất Silica gel 37 – 63 μm, Himedia dùng cho sắc kí cột. Sắc kí lớp mỏng loại DC - Alufolein 20×20, Kiesel gel 60 F , Merck. 254 Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, chloroform , ethyl acetate, acetone, methanol, acetic acid và nước cất.

Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên lớp mỏng: sử dụng H2SO4 20%. Thiết bị Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu. Máy cô quay chân không. Bếp cách thuỷ.

Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm. Cân điện tử. Phương pháp tiến hành Phương pháp phân lập các hợp chất Cô lập các hợp chất hữu cơ bằng phương pháp sắc kí, bao gồm kỹ thuật sắc kí cột silica gel pha thường và sắc kí lớp mỏng. Được hiện hình bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 20%.

Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), 2D-NMR trên máy Bruker Avance được ghi tại phòng NMR, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18, Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội. Thu hái nguyên liệu Mẫu cây dùng trong nguyên cứu đề tài là rễ cây hà thủ ô trắng (Streptocaulon 10 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên juventas (Lour) Merr.) được thu hái ở Tịnh Biên tỉnh An Giang vào tháng 10 năm 2016. Mẫu cây đã được Th.S Hoàng Việt, trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh nhận danh tên khoa học là “Streptocaulon juventas”, họ Thiên lý (Asclepiadaceae). Xử lý mẫu nguyên liệu Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn.

ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Bột rễ cây hà thủ ô được đun hoàn lưu với dung môi methanol ở nhiệt độ 64-65oC, mỗi mẽ đun 3 lần mỗi lần đun trong 3 giờ. Sau đó đem lọc, thu được dịch, rồi đem cô quay với áp suất thấp thu được cao methanol thô. Cao methanol thô được chiết lỏng – lỏng với dung môi chloroform, cô quay dịch chiết thu được cao chloroform. Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.

Bột rễ hà thủ ô (20 kg) - Trích nóng với methanol - Lọc bã Bã khô Dịch methanol Cô quay thu hồi dung môi Cao methanol Methanol thu hồi thô (2.02 kg) - Chiết lỏng – lỏng với dung môi chloroform. - Cô quay thu hồi dung môi Cao chloroform Cao còn lại (400g) Sơ đồ 2. Quy trình điều chế cao chloroform từ rễ cây hà thủ ô trắng 11 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên 2. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO CHLOROFORM 2.

Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform Cao chloroform (400g) được sắc kí cột (SKC) silica gel, giải lý với hệ dung môi H:EA có độ phân cực tăng dần từ 0% đến 100% EA, sau đó giải ly lần lượt với các hệ dung môi EA:Me 9:1, EA:Me:H2O 8:1:1, EA:Me:H2O 4:1:1, EA:Me:H2O 2:1:1 và 100%Me. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ theo dõi quá trình giải ly bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM). Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn. Kết quả thu được 12 phân đoạn (A-L) Bảng 2.

Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform Khối lượng Sắc kí lớp STT Phân đoạn Dung môi giải ly Ghi chú (g) mỏng 1 A H 3.6 Nhiều vết Chưa khảo sát 2 B H: EA 99:1 5.0 Nhiều vết Chưa khảo sát 3 C H:EA 95:5 5.6 Nhiều vết Khảo sát 4 D H:EA 9:1 6.0 Nhiều vết Đã khảo sát 5 E H:EA 85:15 8.4 Nhiều vết Chưa khảo sát 6 F H:EA 8:2 13 Nhiều vết Chưa khảo sát 7 G H:EA 1:1 19.6 Nhiều vết Chưa khảo sát 8 H EA 26.8 Nhiều vết Chưa khảo sát 9 I EA:Me 9:1 31.0 Nhiều vết Chưa khảo sát 10 J EA:Me:H2O 8:1:1 41.2 Nhiều vết Chưa khảo sát 11 K EA:Me:H2O 4:1:1 53 Nhiều vết Chưa khảo sát 12 L EA:Me:H2O 2:1:1 71.6 Vệt dài Chưa khảo sát Ghi chú: H: hexan, EA: ethyl acetat, Me: methanol, H2O: nước. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C của bảng 2.1 Phân đoạn C cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn C được thực hiện SKC silica gel, giải ly với hệ dung môi H:C:EA có độ kém phân cực giảm dần từ 100% đến 0% H và tỉ lệ C:EA là 1:1 được giữ nguyên. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 12 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên Bảng 2.

Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C Khối lượng Sắc kí lớp STT Phân đoạn Dung môi giải ly Ghi chú (mg) mỏng 1 C.4 Nhiều vết Chưa khảo sát 2 C.4 Nhiều vết Chưa khảo sát 3 C.2 Nhiều vết Khảo sát 4 C.9 Nhiều vết Chưa khảo sát 5 C.6 Nhiều vết Chưa khảo sát Ghi chú: H: hexan, C: Chloroform, EA: ethyl acetat. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C.3 cho SKLM hai vết tách rõ nên phân đoạn C.3 được SKC silica gel với hệ dung môi H:C:EA 40:1:1, sau đó giải ly tiếp tục với hệ 30:1:1. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 5 phân đoạn (C.5), được trình bày trong bảng 2.

Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C.3 Khối lượng Sắc kí lớp STT Phân đoạn Dung môi giải ly Ghi chú (mg) mỏng 1 C.4 1 vết tách rõ Chưa khảo sát 2 C.7 2 vết tách rõ Chưa khảo sát 3 C.6 1 vết tách rõ Khảo sát 4 C.9 2 vết tách rõ Khảo sát 5 C.6 1 vết tách rõ Khảo sát Phân đoạn C.3 có SKLM cho vết rõ có màu cam, thu được hợp chất có dạng hình vảy, màu trắng.5 có SKLM cho vết rõ màu nâu, thu được hợp chất có dạng hình kim màu trắng.4, qua một lần SKC tách ra hai vết trùng với phân đoạn C. Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2. 13 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên Cao chloroform 400 g - Sắc kí cột silica gel - Giải ly H:EA, EA:Me:H2O - Cô quay thu hồi dung môi A B C D E F G H I J K L 3.6 g g g g g g g g g g g g - Sắc kí cột silica gel - Giải ly H:C:EA C.6 mg mg mg mg mg - Sắc kí cột silica gel - Giải ly H:C:EA C.4 mg mg mg mg mg Q1 Q2 394. Quy trình cô lập hợp chất 14 Luan van Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT Q2 Hợp chất Q2 (427.6 mg) thu được từ phân đoạn C.5 có những đặc điểm như sau: - Dạng tinh thể hình kim, màu trắng, hòa tan được trong dung môi chloroform. - Sắc kí lớp mỏng cho một vết duy nhất khi hiện hình bằng H2SO4 20%, hơ nóng bảng mỏng cho vết có màu nâu (dung môi giải ly hexan:chloroform:ethyl acetat 8:1:1, Rf = 0. - Phổ 1H-NMR (CDCl3, phụ lục 1, Bảng 3.