Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, sở hữu hệ thực vật phong phú và đa dạng. Sự trù phú này là nền tảng thuận lợi cho ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên phát triển, đóng góp quan trọng vào y học cổ truyền lẫn hiện đại trong công tác chăm sóc sức khỏe. Trong kho tàng dược liệu dân gian, các loài thuộc chi Đinh lăng (Polyscias) từ lâu đã được nhân dân sử dụng như vị thuốc bồi bổ sức khỏe, tăng cường sức đề kháng, làm chậm quá trình lão hóa và điều trị nhiều chứng bệnh như suy nhược, nhức đầu, đau tức ngực, tiêu hóa kém hoặc hỗ trợ ức chế sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư.

Trong hệ thống phân loại thực vật, chi Polyscias thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) là chi có quy mô lớn thứ hai trong họ. Mặc dù nhiều loài trong chi như Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa) hay Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana) đã được nghiên cứu tương đối kỹ lưỡng về cả thành phần hóa thực vật lẫn dược lý, loài Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.) tại thời điểm thực hiện đề tài mới chỉ được khảo sát sơ bộ, chủ yếu tập trung trên bộ phận lá cây. Bộ phận vỏ thân của loài này chưa có công trình nào công bố chi tiết về việc phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp. Nhằm đóng góp thêm dữ liệu khoa học về hóa thực vật của chi Đinh lăng tại Việt Nam, đề tài "Khảo sát thành phần hóa học vỏ thân cây Đinh lăng trổ Polyscias guilfoylei Bail. Họ Nhân Sâm (Araliaceae)" đã được tiến hành.

Mục tiêu và các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể của khóa luận bao gồm:

  1. Thu hái, xử lý nguyên liệu và khảo sát sơ bộ vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.).
  2. Điều chế cao chiết tổng ethanol từ bột vỏ thân khô và tiến hành chiết phân bố lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan, etyl acetat, n-butanol).
  3. Sử dụng các kỹ thuật sắc ký cột cổ điển và sắc ký lớp mỏng để phân lập, cô lập các hợp chất tinh khiết từ các phân đoạn cao chiết tiềm năng (cao hexan và cao butanol).
  4. Sử dụng các phương pháp phân tích hóa lý hiện đại, đặc biệt là phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1D-NMR, 2D-NMR) và phổ khối lượng (LC/MS-ESI) để biện luận và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.), thuộc chi Polyscias, họ Nhân sâm (Araliaceae). Mẫu thực vật tươi được thu hái tại tỉnh Khánh Hòa vào tháng 7 năm 2011 và được nhận danh bởi ThS. Liêu Hồ Mỹ Trang thuộc Bộ môn Hóa Thực Vật, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.
  • Phạm vi nghiên cứu: Khóa luận tập trung vào quá trình chiết tách thực nghiệm, phân lập hóa học và khảo sát cấu trúc các hợp chất hữu cơ từ vỏ thân mẫu cây thu thập; toàn bộ thực nghiệm chiết tách được thực hiện tại Bộ môn Hóa Hữu cơ - Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh và đo phổ tại Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Hà Nội), hoàn thành vào tháng 5 năm 2012.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng dựa trên cơ sở lý thuyết về hóa học các hợp chất tự nhiên, trọng tâm là nhóm hợp chất triterpenoid saponin, hợp chất steroid, hợp chất phenolic và lipid (acid béo) - những nhóm chất đặc trưng của chi Polyscias và họ Araliaceae. Về mặt phân loại hóa học, các saponin phân lập từ chi này thường mang phần aglycon là acid oleanolic hoặc hederagenin, liên kết với các mạch đường đơn hoặc đa đường (như glucose, glucuronic acid, rhamnose, arabinose, galactose) qua liên kết ether hoặc ester glycosid.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được tác giả triển khai bao gồm:

  1. Phương pháp xử lý và chuẩn bị mẫu: Mẫu vỏ thân tươi sau khi làm sạch tạp chất và loại bỏ phần hư hại được sấy khô ở nhiệt độ 60 - 65°C đến khối lượng không đổi để xác định độ ẩm trung bình, sau đó nghiền thành bột mịn phục vụ quá trình chiết xuất.
  2. Phương pháp chiết xuất và phân tách phân đoạn:
    • Chiết ngâm dầm (maceration) bột vỏ thân khô trong dung môi ethanol 96° ở nhiệt độ phòng trong thời gian 24 giờ mỗi lần, lặp lại nhiều lần đến khi kiệt hoạt chất, sau đó lọc và cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để thu cao chiết toàn phần.
    • Chiết lỏng - lỏng phân bố cao ethanol lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etyl acetat và n-butanol, thu được các phân đoạn cao tương ứng.
  3. Phương pháp phân lập và tinh chế:
    • Sắc ký cột (Column Chromatography - CC) pha thường sử dụng chất nhồi là Silica gel 60 (kích thước hạt 0.06 mm, hãng Merck).
    • Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) pha thường tráng sẵn Kieselgel $60F_{254}$ (Merck) và sắc ký lớp mỏng pha đảo RP-18 ($25\text{DC}$, Merck) để kiểm tra độ tinh khiết và theo dõi quá trình gom phân đoạn.
    • Thuốc thử hiện hình: Dung dịch acid sulfuric ($H_2SO_4$) đậm đặc kết hợp sấy nhiệt để phát hiện vết chất.
  4. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ($^1\text{H-NMR}$) thực hiện trên thiết bị BRUKER AC.20, tần số 500 MHz.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ($^{13}\text{C-NMR}$) kết hợp kỹ thuật DEPT thực hiện trên thiết bị BRUKER AC.200, tần số 500 MHz.
    • Phổ cộng hưởng từ 2 chiều (2D-NMR) gồm phổ tương quan đồng nhân COSY ($^1\text{H-}^1\text{H}$), phổ tương quan dị nhân qua 1 liên kết HSQC ($^1\text{H-}^{13}\text{C}$) và phổ tương quan dị nhân tầm xa qua 2-3 liên kết HMBC ($^1\text{H-}^{13}\text{C}$).
    • Phổ khối lượng sắc ký lỏng (LC/MS) sử dụng kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI) ở chế độ ion âm.
    • Các dung môi dùng đo phổ: Pyridin-$d_5$ (đối với hợp chất BU-1) và $CDCl_3$ (đối với hợp chất ED-1).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương này trình bày chi tiết ba mảng nội dung chính: mô tả đặc điểm hình thái thực vật học, tổng hợp thành phần hóa thực vật đã biết của chi Polyscias và lược khảo các nghiên cứu dược lý thực nghiệm liên quan.

Về đặc điểm thực vật, cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.) là dạng cây bụi cao 3-4 m, thân ít phân nhánh. Lá có hình thái đa dạng, màu lục sáng, viền lá màu trắng đặc trưng, xẻ lông chim đều đặn; cuống lá ngắn và to, có sọc hoặc đốm; lá chét thuôn dài với mép răng cưa không đều.

Về thành phần hóa học, tác giả tổng hợp các công trình tiêu biểu trong chi Polyscias:

  • Polyscias guilfoylei Bail.: Năm 2010, Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã cô lập từ lá cây 8 hợp chất gồm isophytol, acid oleanolic và chuỗi các saponin dẫn xuất từ acid oleanolic như acid 3-O-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic, acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1→3)-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic, acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1→4)-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic, các dạng bisdesmosid mang gốc đường ester hóa ở vị trí C-28. Năm 2011, Văn Bá Lãnh cô lập từ lá loài này 2 hợp chất gồm 3-O-$\beta$-D-glucopyranosylstigmasterol và 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1→4)-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic 28-O-$\beta$-D-glucopyranosyl ester.
  • Các loài cùng chi khác: Tác giả tổng quan chi tiết thành phần hóa học của P. amplifolia (các saponin chứa khung oleanolic), P. dichroostachya (saponin chứa khung hederagenin), P. filicifolia (chứa phytosterol, flavonoid, triterpenoid saponin), P. fulva (chứa hederagenin saponin, dammaran glycosid, ceramid, cerebrosid), P. fruticosa (tinh dầu chứa $\beta$-elemen, $\beta$-germacren-D, E-$\gamma$-bisabolen, $\alpha$-bergamoten; các dẫn xuất polyacetylen như falcarinol, panaxydol; 11 saponin triterpenoid), P. nodosa, P. scutellaria và P. balfouriana.

Về hoạt tính sinh học và ứng dụng y học:

  • Tác dụng tăng thể lực, tăng sức chịu đựng, chống stress và chống trầm cảm trên mô hình động vật của P. fruticosa ở liều 45-180 mg/kg thể trọng.
  • Ứng dụng cao Đinh lăng lá tròn (P. balfouriana) trong chế phẩm thương mại CERATO hỗ trợ tăng cường sinh lực nam giới.
  • Dịch chiết P. filicifolia có khả năng kháng mạnh vi khuẩn Staphylococcus aureus và kháng đột biến gen trên chủng Salmonella typhimurium TA98, TA100.
  • Các saponin từ P. amplifolia thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thư buồng trứng người A2780.
  • Riêng loài P. guilfoylei, dịch chiết nước và dịch chiết diclorometan từ lá tươi được ghi nhận có hoạt tính quyến rũ ruồi đục quả.

Chương 2: Thực nghiệm

Chương 2 mô tả chi tiết toàn bộ các bước hóa học thực nghiệm từ khâu chiết xuất thô, phân bố dung môi, đến quy trình sắc ký cột phân đoạn và cô lập các chất sạch.

  1. Chuẩn bị và chiết xuất cao tổng:

    • Mẫu vỏ thân tươi thu hái tại Khánh Hòa sau khi xử lý được đem sấy khô, xác định độ ẩm trung bình.
    • Bột khô vỏ thân được ngâm dầm với dung môi ethanol 96° ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ mỗi lần, lọc dịch trích và cô quay chân không nhiều lần, thu được 111,730 g cao ethanol toàn phần.
    • Tiến hành chiết phân bố lỏng - lỏng cao ethanol với n-hexan, etyl acetat và n-butanol, thu được:
      • Cao hexan: 5,000 g
      • Cao etyl acetat: 16,420 g
      • Cao butanol: 20,100 g
    • Dựa trên việc phân tích bản sắc ký lớp mỏng đối chiếu và tham khảo tài liệu, tác giả lựa chọn cao hexan và cao butanol để tiếp tục cô lập hợp chất.

  2. Quy trình cô lập hợp chất ED-1 từ cao hexan (5,000 g):

    • Sắc ký cột lần 1 trên 5,000 g cao hexan, giải ly bằng hệ ete dầu hỏa : clorofom (Ed : C) thu 4 phân đoạn (H.1 đến H.4).
    • Chọn phân đoạn H.3 (1,080 g, giải ly Ed : C 2:3) tiến hành sắc ký cột lần 2, thu được 3 phân đoạn (H.3.1 đến H.3.3).
    • Tiếp tục sắc ký cột trên phân đoạn H.3.2 (0,640 g, giải ly Ed : C 2:3) thu được 3 phân đoạn phụ (H.3.2.1 đến H.3.2.3).
    • Tại phân đoạn H.3.2.2 (0,200 g), xuất hiện lớp kết tủa trắng lắng ở đáy hũ; lọc tách kết tủa, rửa nhiều lần bằng clorofom, sau đó sắc ký cột tinh chế lại bằng hệ Ed : C thu được 20 mg chất bột màu trắng, ký hiệu là ED-1 ($R_f = 0.5$ trong hệ dung môi C 100%, vết đen trên bản mỏng hiện hình với $H_2SO_4$).
Phân đoạn sắc ký Khối lượng (g) Hệ dung môi giải ly (tỷ lệ thể tích) Đặc điểm bản mỏng (TLC) Hướng xử lý
Cao hexan toàn phần 5,000 Ete dầu hỏa : Clorofom (Ed : C) Theo dõi qua TLC Sắc ký cột lần 1
H.1 0,900 Ed : C (3 : 2) Vết không rõ Chưa khảo sát
H.2 1,200 Ed : C (1 : 1) Vết không rõ Chưa khảo sát
H.3 1,080 Ed : C (2 : 3) Vết rõ Khảo sát tiếp (Cột lần 2)
H.4 1,120 Ed : C (2 : 3) Nhiều vết Chưa khảo sát
Phân đoạn H.3 1,080 Ed : C Sắc ký cột lần 2 Tách 3 phân đoạn
H.3.1 0,120 Ed : C (1 : 1) 1 vết kèm vết dơ Chưa khảo sát
H.3.2 0,640 Ed : C (2 : 3) Vết rõ, tròn, tách rời Khảo sát tiếp (Cột lần 3)
H.3.3 0,130 Ed : C (2 : 3) Vết dài Chưa khảo sát
Phân đoạn H.3.2 0,640 Ed : C Sắc ký cột lần 3 Tách 3 phân đoạn
H.3.2.1 0,190 Ed : C (2 : 3) Vết mờ Chưa khảo sát
H.3.2.2 0,200 Ed : C (2 : 3) Vết màu đen, ít vết dơ Lọc tủa, rửa $\text{CHCl}_3$, cột tinh chế thu ED-1 (20 mg)
H.3.2.3 0,050 Ed : C (2 : 3) Vết mờ Chưa khảo sát
  1. Quy trình cô lập hợp chất BU-1 từ cao butanol (20,100 g):
    • Sắc ký cột lần 1 trên 20,100 g cao butanol với hệ Clorofom : Metanol (C : M) và Clorofom : Metanol : Nước ($C : M : H_2O$), thu được 6 phân đoạn (B.1 đến B.6).
    • Chọn phân đoạn B.4 (1,280 g, giải ly C : M 4:1) thực hiện sắc ký cột lần 2 với hệ C : M (17:3 và 4:1), thu được 4 phân đoạn (B.4.1 đến B.4.4).
    • Chọn phân đoạn B.4.3 (0,080 g) tiến hành sắc ký cột lần 3 với hệ $C : M : H_2O$ (40:10:1), thu được 3 phân đoạn (B.4.3.1 đến B.4.3.3).
    • Chọn phân đoạn B.4.3.2 (0,067 g) thực hiện sắc ký cột lần 4 với hệ $C : M : H_2O$ (40:10:1), thu được 2 phân đoạn (B.4.3.2.1 và B.4.3.2.2).
    • Lấy phân đoạn B.4.3.2.2 (0,027 g) rửa nhiều lần bằng metanol, sau đó sắc ký cột silica gel tinh chế với hệ $C : M : H_2O$, thu được 9.2 mg chất bột màu trắng, ký hiệu là BU-1 ($R_f = 0.4$ trong hệ giải ly $C : M : H_2O = 14 : 6 : 1$, vết tròn màu tím khi hiện hình bằng $H_2SO_4$).
Phân đoạn sắc ký Khối lượng (g) Hệ dung môi giải ly (tỷ lệ thể tích) Đặc điểm bản mỏng (TLC) Hướng xử lý
Cao butanol toàn phần 20,100 C : M và $C : M : H_2O$ Theo dõi qua TLC Sắc ký cột lần 1
B.1 0,340 C 100% Vết không rõ Chưa khảo sát
B.2 0,200 C : M (19 : 1) Vết không rõ Chưa khảo sát
B.3 2,550 C : M (9 : 1) Vết rõ SV Nguyễn Thị Kim Liên khảo sát
B.4 1,280 C : M (4 : 1) Vết rõ Khảo sát tiếp (Cột lần 2)
B.5 5,220 C : M (4 : 1) Vết rõ SV Nguyễn Thị Kim Liên khảo sát
B.6 7,450 $C : M : H_2O$ (14 : 6 : 1) Vết không rõ Chưa khảo sát
Phân đoạn B.4 1,280 C : M Sắc ký cột lần 2 Tách 4 phân đoạn
B.4.1 0,770 C : M (17 : 3) Vết dài, nhiều vết dơ Chưa khảo sát
B.4.2 0,350 C : M (4 : 1) 1 vết tròn lẫn vết dơ Chưa khảo sát
B.4.3 0,080 C : M (4 : 1) Vết rõ, tròn, ít tạp Khảo sát tiếp (Cột lần 3)
B.4.4 0,650 C : M (4 : 1) Nhiều vết Chưa khảo sát
Phân đoạn B.4.3 0,080 $C : M : H_2O$ Sắc ký cột lần 3 Tách 3 phân đoạn
B.4.3.1 0,030 C : M (17 : 3) Vết tròn lẫn vết dơ Chưa khảo sát
B.4.3.2 0,067 $C : M : H_2O$ (40 : 10 : 1) 1 vết rõ kèm vết mờ Khảo sát tiếp (Cột lần 4)
B.4.3.3 0,680 $C : M : H_2O$ (40 : 10 : 1) Nhiều vết Chưa khảo sát
Phân đoạn B.4.3.2 0,067 $C : M : H_2O$ (40 : 10 : 1) Sắc ký cột lần 4 Tách 2 phân đoạn
B.4.3.2.1 0,032 $C : M : H_2O$ (40 : 10 : 1) Vết tròn kèm vết dơ Chưa khảo sát
B.4.3.2.2 0,027 $C : M : H_2O$ (40 : 10 : 1) Vết rõ kèm vết mờ Rửa MeOH, sắc ký cột thu BU-1 (9.2 mg)

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 tập trung phân tích và biện luận chi tiết cấu trúc hóa học của hai hợp chất cô lập được thông qua hệ thống phổ thực nghiệm.

1. Biện luận cấu trúc hợp chất BU-1

Hợp chất BU-1 (9.2 mg) thu được dưới dạng bột màu trắng từ cao butanol vỏ thân.

  • Phần aglycon (Acid oleanolic):

    • Phổ $^1\text{H-NMR}$ (dung môi Pyridin-$d_5$) ghi nhận tín hiệu của 1 proton olefin tại $\delta_H = 5.38\text{ ppm}$ ($1\text{H}, \text{br s}, =\text{CH}-$), cùng với 7 mũi đơn đặc trưng ở vùng trường cao ($\delta_H = 0.86 - 1.68\text{ ppm}$) tương ứng với 7 nhóm methyl gắn trên các carbon tứ cấp. Tín hiệu cộng hưởng tại $\delta_H = 3.30\text{ ppm}$ ($1\text{H}, \text{dd}, J = 4.0\text{ Hz}; 12.0\text{ Hz}, \text{H-18}$) là cấu trúc điển hình của khung olean-12-en.
    • Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ và DEPT cho thấy 42 tín hiệu carbon, trong đó có 2 tín hiệu carbon olefin ở $\delta_C = 122.5\text{ ppm}$ (C-12, carbon methin $=\text{CH}-$) và $\delta_C = 144.2\text{ ppm}$ (C-13, carbon tứ cấp $=\text{C}<$). Tín hiệu nhóm carboxyl xuất hiện ở trường thấp tại $\delta_C = 180.2\text{ ppm}$ (C-28). Các số liệu này xác nhận phần aglycon của BU-1 là acid oleanolic.
    • Phổ HMBC cho thấy tương quan rõ giữa proton anomer của phân tử đường thứ nhất ($\delta_H = 4.85\text{ ppm}$) với carbon C-3 của khung aglycon ($\delta_C = 89.1\text{ ppm}$), chứng minh mạch đường liên kết vào vị trí C-3 của aglycon qua cầu nối ether.

  • Phần mạch đường (Disaccharide):

    • Sự hiện diện của 2 proton anomer tại $\delta_H = 4.85\text{ ppm}$ ($1\text{H}, \text{d}, J = 7.5\text{ Hz}, \text{H-1}'$) và $\delta_H = 5.08\text{ ppm}$ ($1\text{H}, \text{d}, J = 8.0\text{ Hz}, \text{H-1}''$) chứng tỏ BU-1 mang 2 phân tử đường đều ở cấu hình $\beta$ (do hằng số ghép spin $J \ge 7.5\text{ Hz}$).
    • Trên phổ $^{13}\text{C-NMR}$, 2 carbon anomer cộng hưởng tại $\delta_C = 106.0\text{ ppm}$ (C-1') và $\delta_C = 105.9\text{ ppm}$ (C-1''). Cùng với đó là 8 carbon mang oxy xuất hiện trong vùng $\delta_C = 62.0 - 86.5\text{ ppm}$, 1 carbon hydroxymethyl ($\delta_C = 62.0\text{ ppm}, \text{C-6}''$) và 1 carbon carboxyl của acid uronic ($\delta_C = 172.5\text{ ppm}, \text{C-6}'$).
    • Phân tích phổ HSQC, COSY và HMBC cho thấy phân tử đường thứ nhất gắn trực tiếp vào C-3 của aglycon là $\beta$-D-glucuronic acid. Proton H-1' ($\delta_H = 4.85\text{ ppm}$) tương quan với C-1' ($\delta_C = 106.0\text{ ppm}$); H-2' ($\delta_H = 4.05\text{ ppm}$) tương quan với C-2' ($\delta_C = 74.2\text{ ppm}$); H-3' ($\delta_H = 4.29\text{ ppm}$) tương quan với C-3' ($\delta_C = 86.5\text{ ppm}$); H-4' ($\delta_H = 4.27\text{ ppm}$) tương quan với C-4' ($\delta_C = 71.3\text{ ppm}$); H-5' ($\delta_H = 4.41\text{ ppm}$) tương quan với C-5' ($\delta_C = 76.8\text{ ppm}$). Độ dịch chuyển của C-3' chuyển dịch về phía trường thấp ($\delta_C = 86.5\text{ ppm}$) cho thấy vị trí này bị glycosid hóa.
    • Phổ HMBC cho thấy tương quan chéo giữa proton anomer H-1'' ($\delta_H = 5.08\text{ ppm}$) của phân tử đường thứ hai với carbon C-3' ($\delta_C = 86.5\text{ ppm}$) của đường glucuronic acid. Phân tử đường thứ hai được xác định là $\beta$-D-glucose.
    • Phổ LC/MS ESI (chế độ ion âm) ghi nhận mũi ion giả tựa phân tử $[M - H]^-$ tại $m/z = 793.36$, hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử $C_{42}H_{66}O_{14}$ (khối lượng phân tử 794 đvC).

Đối chiếu toàn bộ số liệu NMR của BU-1 với hợp chất chuẩn acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1→3)-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic do Nguyễn Thị Ánh Tuyết (2010) cô lập từ lá cho thấy sự trùng khớp hoàn toàn. Cấu trúc hóa học của hợp chất BU-1 được xác định là: Acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1→3)-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic.

2. Biện luận cấu trúc hợp chất ED-1

Hợp chất ED-1 (20 mg) thu được dưới dạng bột màu trắng từ phân đoạn cao hexan.

  • Phổ $^1\text{H-NMR}$ (dung môi $CDCl_3$) ghi nhận:
    • Mũi ba (triplet) tại $\delta_H = 2.34\text{ ppm}$ ($2\text{H}, \text{t}, J = 7.5\text{ Hz}$) đặc trưng cho nhóm methylen gắn trực tiếp với nhóm carboxyl ($-\text{CH}_2-\text{COO}-$), bị tương tác spin-spin với nhóm methylen lân cận.
    • Tín hiệu mũi đa tại $\delta_H = 1.60\text{ ppm}$ ($2\text{H}, \text{m}$) ứng với nhóm methylen ở vị trí $\beta$ so với nhóm carboxyl ($-\text{CH}_2-\text{CH}_2-\text{COO}-$).
    • Tín hiệu mũi ba tại $\delta_H = 0.88\text{ ppm}$ ($3\text{H}, \text{t}$) đặc trưng cho nhóm methyl tận cùng của mạch hydrocarbon dài ($-(\text{CH}_2)_n-\text{CH}_3$).
    • Vùng $\delta_H = 1.25\text{ ppm}$ xuất hiện mũi đơn rộng cường độ lớn tương ứng với chuỗi các nhóm methylen $-(\text{CH}_2)_n-$ trong mạch béo no.
  • Từ các dữ kiện phổ $^1\text{H-NMR}$, cấu trúc của ED-1 được đề nghị là một acid béo no mạch thẳng có công thức tổng quát: $\text{CH}_3-(\text{CH}_2)_n-\text{COOH}$ (với $n \ge 3$).

Chương 4: Kết luận và đề xuất

Tác giả tổng kết các kết quả đạt được từ quá trình khảo sát thành phần hóa học vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.) tại Khánh Hòa, bao gồm việc cô lập thành công và xác định cấu trúc của 2 hợp chất (BU-1 thuộc nhóm triterpenoid saponin và ED-1 thuộc nhóm acid béo no). Đồng thời, tác giả đề xuất định hướng nghiên cứu tiếp theo: tăng khối lượng mẫu thực vật ban đầu để phân lập lượng chất lớn hơn, mở rộng khảo sát thành phần hóa học trên bộ phận rễ của loài này và tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học đối với các cao phân đoạn và các hợp chất tinh khiết đã cô lập.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã đạt được những kết quả cụ thể với số liệu thực nghiệm đầy đủ:

  1. Số liệu chiết xuất và phân lập:
    • Điều chế thành công 111,730 g cao ethanol toàn phần từ bột khô vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.).
    • Phân đoạn cao thô thu được: 5,000 g cao hexan; 16,420 g cao etyl acetat và 20,100 g cao butanol.
    • Cô lập thành công 20 mg hợp chất ED-1 từ cao hexan và 9.2 mg hợp chất BU-1 từ cao butanol.
  2. Số liệu nhận danh cấu trúc:
    • Xác định chính xác cấu trúc hóa học của hợp chất BU-1 là Acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1→3)-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic có công thức phân tử $C_{42}H_{66}O_{14}$, khối lượng phân tử 794 đvC ($m/z = 793.36\text{ }[M - H]^-$).
    • Xác định sơ bộ cấu trúc hợp chất ED-1 là một acid béo no mạch thẳng $\text{CH}_3-(\text{CH}_2)_n-\text{COOH}$ ($n \ge 3$).
Ký hiệu hợp chất Khối lượng cô lập Dạng tồn tại / Màu sắc Phân đoạn nguồn gốc Công thức / Cấu trúc đề nghị
BU-1 9.2 mg Bột màu trắng Cao butanol vỏ thân (B.4.3.2.2) Acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1→3)-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic ($C_{42}H_{66}O_{14}$)
ED-1 20 mg Bột màu trắng Cao hexan vỏ thân (H.3.2.2) Acid béo no mạch thẳng $\text{CH}_3-(\text{CH}_2)_n-\text{COOH}$ ($n \ge 3$)

Đóng góp khoa học của đề tài:

  • Đây là công trình thực nghiệm khảo sát thành phần hóa học trên bộ phận vỏ thân của loài Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.) thu hái tại Khánh Hòa.
  • Kết quả nghiên cứu chứng minh sự hiện diện của hợp chất triterpenoid saponin khung oleanan liên kết disaccharide (acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1→3)-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic) trong vỏ thân loài này, cung cấp thêm dẫn liệu khoa học về sự tương đồng và phân bố hóa thực vật giữa các bộ phận (lá và vỏ thân) cũng như giữa các loài trong chi Polyscias.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tồn tại một số hạn chế do điều kiện thực nghiệm được tác giả nêu rõ:

  • Khối lượng mẫu vỏ thân ban đầu sử dụng còn hạn chế dẫn đến lượng hợp chất tinh khiết cô lập được tương đối nhỏ (BU-1 chỉ đạt 9.2 mg, ED-1 đạt 20 mg), chưa đủ để triển khai thử nghiệm các hoạt tính sinh học.
  • Giới hạn về thời gian thực hiện khiến đề tài chưa thể khảo sát toàn diện phân đoạn cao etyl acetat (16,420 g) cũng như các phân đoạn sắc ký phụ khác từ cao hexan và butanol.
  • Hợp chất ED-1 mới chỉ được đề nghị cấu trúc khung acid béo tổng quát thông qua phổ proton ($^1\text{H-NMR}$), chưa xác định được chính xác chiều dài chuỗi carbon $n$ cụ thể qua phổ khối lượng (GC-MS hoặc LC-MS) hay nhiệt độ nóng chảy.

Hướng nghiên cứu mở rộng được đề xuất:

  • Thu hái nguyên liệu với khối lượng lớn hơn để cô lập lượng chất đủ cho các thử nghiệm chuyên sâu.
  • Mở rộng khảo sát thành phần hóa thực vật trên các bộ phận khác của cây, đặc biệt là bộ phận rễ của cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.).
  • Đánh giá hoạt tính sinh học (chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm định, độc tế bào ung thư...) trên các phân đoạn cao chiết và các hợp chất tinh khiết đã phân lập.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu học thuật chuyên khảo hữu ích cho các đối tượng và định hướng nghiên cứu:

  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa Hữu cơ, Hóa học Hợp chất thiên nhiên, Dược học và Dược liệu học: Tài liệu cung cấp quy trình chuẩn mực về chiết xuất phân bố lỏng - lỏng, phương pháp sắc ký cột cổ điển từng bước trên phân đoạn cao phân cực (butanol) để làm giàu và tinh chế saponin.
  • Tham khảo phương pháp giải phổ NMR cấu trúc Triterpenoid Saponin: Khóa luận trình bày chi tiết logic biện luận phổ 1D-NMR kết hợp các kỹ thuật phổ tương quan 2D-NMR (COSY, HSQC, HMBC) để định vị khung oleanolic acid, xác định cấu hình anomer ($\beta$) của các phân tử đường và vị trí liên kết glycosid $(1 \to 3)$ giữa các gốc đường với nhau và với khung aglycon.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu thực vật sử dụng trong khóa luận được thu hái ở đâu và do cơ quan chuyên môn nào giám định tên khoa học? Mẫu vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.) được thu hái tại tỉnh Khánh Hòa vào tháng 7 năm 2011. Tên khoa học của mẫu được giám định chính xác bởi ThS. Liêu Hồ Mỹ Trang thuộc Bộ môn Hóa Thực Vật, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.

2. Tác giả đã thu được bao nhiêu loại cao chiết phân đoạn từ bột vỏ thân và khối lượng của từng loại là bao nhiêu? Từ 111,730 g cao chiết toàn phần bằng ethanol 96°, tác giả đã tiến hành chiết phân bố lỏng - lỏng và thu được 3 phân đoạn cao chiết: cao n-hexan (5,000 g), cao etyl acetat (16,420 g) và cao n-butanol (20,100 g).

3. Cấu trúc hóa học và công thức phân tử của hợp chất saponin BU-1 được xác định là gì? Hợp chất BU-1 có công thức phân tử là $C_{42}H_{66}O_{14}$ (khối lượng phân tử 794 đvC), tên khoa học đầy đủ là Acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1→3)-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic. Cấu trúc này gồm phần aglycon là acid oleanolic, liên kết tại vị trí C-3 với phân tử đường $\beta$-D-glucuronic acid, và đường này tiếp tục liên kết tại vị trí C-3' với phân tử đường $\beta$-D-glucose.

4. Dữ liệu phổ nào chứng minh hợp chất BU-1 chứa khung aglycon là acid oleanolic và mang 2 phân tử đường cấu hình $\beta$? Khung aglycon acid oleanolic được khẳng định qua tín hiệu proton olefin ở $\delta_H = 5.38\text{ ppm}$ ($\text{br s}$), proton H-18 ở $\delta_H = 3.30\text{ ppm}$ ($\text{dd}, J = 4.0; 12.0\text{ Hz}$), 7 nhóm methyl singlet trường cao, cùng 2 carbon olefin C-12 ($\delta_C = 122.5\text{ ppm}$) và C-13 ($\delta_C = 144.2\text{ ppm}$). Hai phân tử đường cấu hình $\beta$ được xác nhận qua 2 tín hiệu proton anomer tại $\delta_H = 4.85\text{ ppm}$ ($J = 7.5\text{ Hz}$) và $\delta_H = 5.08\text{ ppm}$ ($J = 8.0\text{ Hz}$) tương ứng với 2 carbon anomer tại $\delta_C = 106.0\text{ ppm}$ và $105.9\text{ ppm}$.

5. Hợp chất ED-1 được cô lập từ phân đoạn nào và có đặc điểm cấu trúc ra sao? Hợp chất ED-1 (20 mg) được cô lập từ phân đoạn cao hexan vỏ thân qua sắc ký cột silica gel và tinh chế tủa bằng clorofom. Phổ $^1\text{H-NMR}$ ($CDCl_3$) cho thấy các tín hiệu đặc trưng của một acid béo no mạch thẳng: $\delta_H = 2.34\text{ ppm}$ ($2\text{H}, \text{t}, J = 7.5\text{ Hz}, -\text{CH}_2\text{COO}-$), $\delta_H = 1.60\text{ ppm}$ ($2\text{H}, \text{m}, -\beta\text{CH}_2-$), $\delta_H = 1.25\text{ ppm}$ (dãy $-\text{CH}_2-$) và $\delta_H = 0.88\text{ ppm}$ ($3\text{H}, \text{t}, -\text{CH}_3$). Công thức đề nghị của ED-1 là $\text{CH}_3-(\text{CH}_2)_n-\text{COOH}$ ($n \ge 3$).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp cử nhân hóa học của sinh viên Nguyễn Trần Bảo Huy đã hoàn thành việc khảo sát thành phần hóa học vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail., họ Araliaceae) thu hái tại Khánh Hòa. Từ các phân đoạn cao hexan và cao butanol, tác giả đã cô lập thành công hai hợp chất tinh khiết là BU-1 (9.2 mg) và ED-1 (20 mg). Thông qua hệ thống phổ NMR 1 chiều, 2 chiều và phổ khối lượng LC/MS-ESI, cấu trúc của BU-1 được xác định rõ là triterpenoid saponin acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1→3)-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic và ED-1 là acid béo no mạch thẳng dạng $\text{CH}_3-(\text{CH}_2)_n-\text{COOH}$ ($n \ge 3$). Các kết quả đạt được đã đóng góp dữ liệu thực nghiệm quan trọng vào việc nghiên cứu hóa thực vật của chi Đinh lăng tại Việt Nam.