Nghiên Cứu Thành Phần Phenolic Trong Một Số Loài Thuộc Họ Apiaceae Ở Miền Bắc Việt Nam

Nghiên cứu thành phần phenolic trong các loài họ Apiaceae ở miền Bắc Việt Nam, góp phần hiểu biết về giá trị dược liệu và sinh học.

• Tác giả: Ngô Hồng Duy
• Người hướng dẫn: TS. Vũ Xuân Giang
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa Dược
• Đề tài: Nghiên Cứu Thành Phần Phenolic Trong Một Số Loài Thuộc Họ Apiaceae Ở Miền Bắc Việt Nam
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• 1. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• 2. DANH MỤC CÁC BẢNG
• 3. DANH MỤC CÁC HÌNH
• 4. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 4.1. Tổng quan về chi Heracleum L.
• 4.1.1. Vị trí phân loại của chi Heracleum L.
• 4.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Heracleum L.
• 4.1.3. Vị trí phân bố và sinh thái của chi Heracleum L.
• 4.1.4. Thành phần hóa học
• 4.2. Tổng quan về loài Heracleum bivittatum
• 4.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố của Heracleum bivittatum
• 4.2.2. Thành phần hóa học
• 4.3. Tổng quan về loài Cryptotaenia japonica
• 4.3.1. Đặc điểm thực vật và phân loại
• 4.3.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố
• 4.3.3. Thành phần hóa học
• 4.4. Tổng quan về chi Xyloselinum Pimenov & Kljuykov
• 4.4.1. Đặc điểm thực vật, phân loại và phân bố
• 5. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 5.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu
• 5.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 5.1.2. Phương tiện nghiên cứu
• 5.2. Nội dung nghiên cứu
• 5.2.1. Nghiên cứu thành phần hóa học
• 5.2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 5.2.2.1. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học
• 6. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 6.1. Định tính sơ bộ các nhóm hợp chất hữu cơ trong 4 mẫu nghiên cứu
• 6.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
• 6.3. Xác định một số hợp chất trong cao chiết các mẫu nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ và mạng dữ liệu phân tử GNPS
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC
• A.1. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu thành phần phenolic trong Apiaceae

Nghiên cứu về thành phần phenolic trong các loài thuộc họ Apiaceae ở miền Bắc Việt Nam đang trở thành một lĩnh vực quan trọng. Các loài trong họ này không chỉ có giá trị dinh dưỡng mà còn có tiềm năng y học lớn. Tuy nhiên, thông tin về các hợp chất phenolic trong các loài này vẫn còn hạn chế. Việc tìm hiểu và phân tích các hợp chất phenolic sẽ giúp nâng cao hiểu biết về giá trị sử dụng của chúng trong y học và thực phẩm.

1.1. Đặc điểm sinh học và phân bố của các loài Apiaceae

Các loài thuộc họ Apiaceae thường mọc ở vùng núi, ven suối và đất ngập nước. Chúng có sự phân bố rộng rãi ở miền Bắc Việt Nam, với nhiều loài đặc hữu. Việc nghiên cứu đặc điểm sinh học của các loài này sẽ giúp xác định môi trường sống và điều kiện phát triển của chúng.

1.2. Tầm quan trọng của thành phần phenolic trong thực vật

Các hợp chất phenolic đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ thực vật khỏi sâu bệnh và điều kiện môi trường khắc nghiệt. Chúng cũng có tác dụng chống oxy hóa và kháng viêm, góp phần vào sức khỏe con người. Nghiên cứu về tác dụng của phenolic sẽ mở ra hướng đi mới trong việc phát triển sản phẩm từ thực vật.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu thành phần phenolic

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nhưng nghiên cứu về thành phần phenolic trong các loài Apiaceae vẫn gặp nhiều thách thức. Thiếu hụt dữ liệu và phương pháp nghiên cứu chưa đầy đủ là những vấn đề chính. Việc xác định chính xác các hợp chất phenolic trong các loài này cần có sự hỗ trợ từ công nghệ hiện đại và các phương pháp phân tích tiên tiến.

2.1. Thiếu hụt dữ liệu về thành phần hóa học

Nhiều loài trong họ Apiaceae chưa được nghiên cứu đầy đủ về thành phần phenolic. Điều này dẫn đến việc thiếu thông tin cần thiết cho các nghiên cứu sâu hơn. Cần có các nghiên cứu bổ sung để làm phong phú thêm cơ sở dữ liệu về hợp chất phenolic.

2.2. Khó khăn trong việc xác định hợp chất phenolic

Việc xác định các hợp chất phenolic trong các loài thực vật thường gặp khó khăn do sự đa dạng và phức tạp của chúng. Các phương pháp phân tích như HPLC-MS cần được áp dụng để đạt được kết quả chính xác hơn.

III. Phương pháp nghiên cứu thành phần phenolic trong Apiaceae

Để nghiên cứu thành phần phenolic, các phương pháp chiết xuất và phân tích hiện đại được áp dụng. Việc sử dụng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng khối phổ giúp xác định và phân tích các hợp chất phenolic một cách hiệu quả. Các phương pháp này không chỉ giúp xác định thành phần mà còn đánh giá được hoạt tính sinh học của chúng.

3.1. Phương pháp chiết xuất hợp chất phenolic

Chiết xuất bằng ethanol 70% là phương pháp phổ biến để thu nhận hợp chất phenolic từ các loài thực vật. Phương pháp này giúp tối ưu hóa việc thu hồi các hợp chất phenolic có giá trị.

3.2. Phân tích thành phần phenolic bằng HPLC MS

Sử dụng HPLC-MS cho phép xác định chính xác các hợp chất phenolic trong mẫu nghiên cứu. Phương pháp này giúp phát hiện các hợp chất mới và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng.

IV. Kết quả nghiên cứu thành phần phenolic trong các loài Apiaceae

Kết quả nghiên cứu cho thấy các loài thuộc họ Apiaceae chứa nhiều hợp chất phenolic khác nhau. Các hợp chất như luteolin, kaempferol, và acid caffeic đã được xác định trong các mẫu nghiên cứu. Những phát hiện này mở ra hướng đi mới cho việc ứng dụng các hợp chất phenolic trong y học và thực phẩm.

4.1. Thành phần phenolic trong loài Heracleum bivittatum

Nghiên cứu cho thấy loài Heracleum bivittatum chứa nhiều hợp chất phenolic có giá trị. Các hợp chất này có thể được sử dụng trong y học cổ truyền và thực phẩm.

4.2. Ứng dụng của hợp chất phenolic trong y học

Các hợp chất phenolic từ loài Apiaceae có tiềm năng lớn trong việc phát triển thuốc và thực phẩm chức năng. Chúng có thể giúp cải thiện sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu thành phần phenolic

Nghiên cứu về thành phần phenolic trong các loài Apiaceae ở miền Bắc Việt Nam đã chỉ ra nhiều tiềm năng chưa được khai thác. Cần tiếp tục nghiên cứu để làm rõ hơn về tác dụng của phenolic và ứng dụng của chúng trong y học và thực phẩm. Việc phát triển các phương pháp nghiên cứu hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc khai thác giá trị của các loài thực vật này.

5.1. Hướng đi tương lai cho nghiên cứu phenolic

Cần có các nghiên cứu sâu hơn về hợp chất phenolic trong các loài Apiaceae để phát hiện và ứng dụng các hợp chất mới. Việc hợp tác giữa các nhà nghiên cứu và các tổ chức sẽ thúc đẩy tiến bộ trong lĩnh vực này.

5.2. Tầm quan trọng của bảo tồn và phát triển bền vững

Bảo tồn các loài thực vật thuộc họ Apiaceae là rất quan trọng để duy trì nguồn tài nguyên thiên nhiên. Việc phát triển bền vững sẽ giúp bảo vệ đa dạng sinh học và khai thác hiệu quả các hợp chất phenolic.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Họ Hoa tán (Apiaceae) là một trong những họ thực vật có mức độ đa dạng cao tại Việt Nam, sở hữu nhiều giá trị ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm và y học cổ truyền. Địa hình và điều kiện khí hậu các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam tạo môi trường thuận lợi cho sự phân bố của nhiều loài thuộc họ này. Mặc dù vậy, các công trình nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học của nhiều đại diện thuộc họ Apiaceae sinh trưởng tại Việt Nam hiện vẫn còn tương đối hạn chế.

Nhiều loài thực vật đặc hữu hoặc phân bố hẹp ở miền Bắc Việt Nam vẫn chưa được khảo sát đầy đủ về hóa thực vật. Cụ thể, loài Cần dại (Heracleum bivittatum H. Boissieu), Thìa là thân gỗ Việt (Xyloselinum vietnamense Pimenov & Kljuykov) và Thìa là hóa gỗ Leonid (Xyloselinum leonidii Pimenov & Kljuykov) có rất ít công bố khoa học trong và ngoài nước. Trong khi đó, loài Áp nhĩ cần (Cryptotaenia japonica Hassk) đã được ghi nhận phân bố tại Việt Nam nhưng chưa từng có công trình nghiên cứu chính thức nào về thành phần hóa học được công bố trong nước.

Nhằm lấp đầy khoảng trống dữ liệu này, khóa luận tốt nghiệp ngành Hóa dược của tác giả Ngô Hồng Duy (Trường Đại học Dược Hà Nội, năm 2024) đã thực hiện đề tài "Nghiên cứu thành phần Phenolic trong một số loài thuộc họ Apiaceae ở miền Bắc Việt Nam". Đề tài hướng đến mục tiêu thiết lập cơ sở dữ liệu khoa học về thành phần hóa học, đặc biệt là nhóm phenolic, tạo tiền đề cho các định hướng sàng lọc hoạt tính sinh học và phân lập hoạt chất về sau.

Nhiệm vụ nghiên cứu được cụ thể hóa thành 4 nội dung thực nghiệm:

1. Định tính sơ bộ các nhóm hợp chất hữu cơ tự nhiên trong 4 mẫu nghiên cứu bằng các phản ứng hóa học ống nghiệm thường quy.
2. Chiết xuất cao chiết ethanol 70% từ 4 mẫu dược liệu bằng phương pháp đun hồi lưu.
3. Định tính thành phần hóa học trong cao chiết toàn phần và cao chiết sau thủy phân bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC/HPTLC).
4. Sơ bộ nhận diện và dự đoán một số hợp chất trong cao chiết các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ phân giải cao hai lần (LC-MS/MS) kết hợp công cụ mạng dữ liệu phân tử GNPS (Global Natural Product Social Molecular Networking).

Về đối tượng và phạm vi nghiên cứu, đề tài tiến hành khảo sát trên 4 mẫu dược liệu thu hái tại các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam trong năm 2023. Tên khoa học của các mẫu thực vật đã được giám định chính thức tại Phòng Tài nguyên Thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam:

• Heracleum bivittatum H. Boissieu (Cần dại / Vũ thảo): Mẫu rễ (ký hiệu SP06b), thu hái tại Sa Pa, tỉnh Lào Cai vào ngày 12/10/2023; mã số mẫu tiêu bản: CSCL.03/23-24-SP06.
• Cryptotaenia japonica Hassk (Áp nhĩ cần): Mẫu toàn cây (ký hiệu HG01), thu hái tại huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang vào ngày 31/7/2023; mã số mẫu tiêu bản: CSCL.03/23-24-HG01.
• Xyloselinum vietnamense Pimenov & Kljuykov (Thìa là thân gỗ Việt): Mẫu toàn cây (ký hiệu HG02), thu hái tại huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang vào ngày 31/7/2023; mã số mẫu tiêu bản: CSCL.03/23-24-HG02.
• Xyloselinum leonidii Pimenov & Kljuykov (Thìa là hóa gỗ Leonid): Mẫu phần trên mặt đất (ký hiệu HG03a), thu hái tại huyện Đồng Văn, tỉnh Hà Giang vào ngày 31/7/2023; mã số mẫu tiêu bản: CSCL.03/23-24-HG03a.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được triển khai dựa trên cơ sở phân loại thực vật học hiển hoa theo hệ thống của A. Downie (2017) và lý thuyết hóa thực vật học về các nhóm chất tự nhiên, trọng tâm là các hợp chất phenolic, flavonoid và furanocoumarin – những chất chuyển hóa thứ cấp điển hình của họ Apiaceae.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế theo trình tự từ định tính hóa học cổ điển đến các kỹ thuật phân tích hiện đại:

1. Phương pháp hóa học thường quy: Tiến hành định tính 12 nhóm hợp chất hữu cơ tự nhiên dựa theo quy trình chuẩn của Dược điển Việt Nam V và tài liệu chuyên môn của Bộ môn Dược liệu. Các phản ứng bao gồm: phản ứng Cyanidin (Shinoda), phản ứng với dung dịch kiềm, hơi amoniac, muối sắt (FeCl3 5%) và thuốc thử Diazo đối với flavonoid; phản ứng đóng mở vòng lacton, thử nghiệm huỳnh quang chuyển dạng đồng phân cis-trans dưới tia tử ngoại đối với coumarin; quan sát chỉ số bọt bền đối với saponin; thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff đối với alcaloid; thuốc thử gelatin 1%, chì acetat 10%, FeCl3 đối với tanin; phản ứng Borntraeger đối với anthranoid; phản ứng Liebermann-Burchard, Baljet, Legal, Keller-Kiliani đối với glycosid tim; phản ứng sủi bọt với Na2CO3 đối với acid hữu cơ; phản ứng Fehling đối với đường khử; phản ứng Ninhydrin đối với acid amin; phản ứng Lugol đối với polysaccharid; và phản ứng chuyển màu với H2SO4 đậm đặc đối với hợp chất caroten.

2. Quy trình chiết xuất và xử lý mẫu: Bột dược liệu khô được chiết xuất với dung môi ethanol 70% theo tỉ lệ khối lượng/dung môi là 1:20 (g/mL) bằng phương pháp đun hồi lưu cách thủy. Dịch chiết được lọc nóng, cô thu hồi dung môi trên nồi cách thủy rồi sấy ở 55°C đến khối lượng không đổi để thu cắn cao chiết toàn phần. Để chuẩn bị cho thử nghiệm sắc ký, dung dịch thử (A) được điều chế bằng cách hòa tan cao chiết trong methanol, siêu âm 10 phút và cho qua cột chiết pha rắn C18 (SPE C18) nhằm loại bỏ tạp chất phân cực kém như chất diệp lục (chlorophyll). Dung dịch thử (B) dùng để định tính thành phần aglycon được điều chế thông qua quá trình thủy phân acid: đun hồi lưu cao chiết với dung dịch HCl 2N ở 100°C trong 1 giờ, sau đó lắc phân bố với ethyl acetat và làm khan lớp hữu cơ bằng Na2SO4 khan.

3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC): Thực hiện trên bản mỏng pha đảo Silicagel 60 F254 tráng sẵn (Merck, Đức) được kích hoạt nhiệt ở 110°C trong 30 phút. Quá trình tra mẫu được tự động hóa bằng máy chấm sắc ký CAMAG Linomat 5, buồng khai triển sắc ký tự động ADC-2, ghi nhận hình ảnh qua buồng chụp TLC Visualizer kết nối phần mềm visionCATS 2.0. Hai hệ dung môi khai triển được sử dụng gồm:

• Hệ dung môi I: Ethyl acetat – acid formic – acid acetic băng – nước (tỉ lệ thể tích 100:11:11:26), dùng để phân tích dịch thử A với chất đối chiếu là acid chlorogenic.
• Hệ dung môi II: Toluen – ethyl acetat – acid formic (tỉ lệ thể tích 14:10:1), dùng để phân tích dịch thử A và dịch thử B (phần aglycon sau thủy phân) với 3 chất đối chiếu gồm luteolin, apigenin và acid caffeic (cung cấp bởi Công ty Biopurify Phytochemicals, Trung Quốc). Bản mỏng được phát hiện màu bằng thuốc thử hiện màu chuyên biệt NP/PEG (Natural Products/Polyethylenglycol) và quan sát dưới các bước sóng tử ngoại UV 254 nm và UV 366 nm.

4. Phương pháp phân tích khối phổ phân giải cao và mạng dữ liệu phân tử: Dịch chiết loại tạp chlorophyll của 4 mẫu được phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp Exion LC kết nối đầu dò khối phổ phân giải cao X500R QTOF (Sciex, Mỹ) sử dụng nguồn ion hóa phun mù điện tử (ESI) ở chế độ ghi nhận ion âm trong dải quét m/z từ 50 đến 2000 amu. Quá trình tách chất sử dụng cột phân tích Hypersil GOLD Dim (kích thước hạt 3 µm, Thermo Scientific) với gradient pha động gồm dung dịch acid formic 0,1% trong nước (pha A) và acid formic 0,1% trong acetonitril (pha B), tốc độ dòng 0,4 mL/phút, thể tích tiêm 2,0 µL. Dữ liệu phổ phân đoạn MS/MS (MS2) sau đó được tải lên hệ sinh thái GNPS (Global Natural Product Social Molecular Networking) để xây dựng mạng phân tử với tiêu chí lọc 5 đỉnh phân mảnh mạnh nhất trong cửa sổ ± 50 Da và hệ số tương đồng cosine tối thiểu là 0,70 (yêu cầu tối thiểu 4 ion mảnh trùng khớp). Mạng lưới phân tử được trực quan hóa trên phần mềm Cytoscape 3.8 và đối chiếu với các cơ sở dữ liệu phổ chuẩn (GNPS, PubChem, Reaxys).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết có hệ thống vị trí phân loại, đặc điểm hình thái thực vật, vùng phân bố địa lý, công dụng trị liệu truyền thống và thành phần hóa học đã được công bố của ba chi: Heracleum, Cryptotaenia và Xyloselinum.

• Chi Heracleum L. gồm khoảng 70 loài, phân bố chủ yếu ở khu vực ôn đới Bắc bán cầu (đặc biệt là vùng Cáp-ca và dãy Himalaya). Về mặt hóa học, các nghiên cứu quốc tế chỉ ra chi này rất giàu tinh dầu chứa hợp chất este béo (octyl acetat, octyl hexanoat) và các hợp chất phenolic nhóm furanocoumarin phân lập từ rễ hoặc quả (như sphondin, isobergapten, bergapten, pimpinellin, heraclenin, imperatorin, psoralen...). Loài Heracleum bivittatum Boissieu (Cần dại/Vũ thảo) sinh trưởng tại Sapa ở độ cao 1700 m, tuy nhiên trước thời điểm đề tài thực hiện, chưa có bất kỳ dữ liệu hóa thực vật nào được công bố trên thế giới.
• Loài Cryptotaenia japonica Hassk (Áp nhĩ cần) phân bố tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc và một số vùng rừng ẩm miền Bắc Việt Nam. Các nghiên cứu quốc tế ghi nhận tinh dầu cây chứa nhiều sesquiterpenoid, trong khi lá và hạt chứa 19 hợp chất phenolic tiêu biểu như luteolin, kaempferol, apigenin, diosmetin, acid chlorogenic, acid caffeic, acid ferulic, acid gallic... Chưa có nghiên cứu hóa thực vật nào về loài này được công bố tại Việt Nam.
• Chi Xyloselinum Pimenov & Kljuykov là chi thực vật đặc hữu của hệ thực vật Việt Nam, được công bố mới cho khoa học năm 2006, bao gồm 2 loài phân bố hẹp tại các dãy núi đá vôi tỉnh Hà Giang và Sơn La: Xyloselinum vietnamense (Thìa là thân gỗ Việt) và Xyloselinum leonidii (Thìa là hóa gỗ Leonid - loài nằm trong danh lục thực vật nguy cấp tại cao nguyên đá Đồng Văn). Các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào tinh dầu (chứa hàm lượng lớn sabinen, myrcen, terpinene-4-ol), và mới chỉ phân lập sơ bộ được 8 hợp chất từ dịch chiết methanol của loài X. leonidii (như xyloselin, decursinol, cimifugin, hesperidin...).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu thực vật, địa điểm, thời gian thu hái và mã tiêu bản lưu trữ của 4 mẫu nghiên cứu. Nội dung chương trình bày quy trình thực nghiệm chiết xuất, thu hồi cao toàn phần và xử lý mẫu:

STT	Tên mẫu dược liệu	Tên khoa học	Ký hiệu	Bộ phận dùng	Khối lượng mẫu khô (g)	Khối lượng cao chiết (g)
1	Áp nhĩ cần	Cryptotaenia japonica	HG01	Toàn cây	60,00	8,10
2	Cần dại	Heracleum bivittatum	SP06b	Rễ	32,15	5,28
3	Thìa là thân gỗ Việt	Xyloselinum vietnamense	HG02	Toàn cây	60,00	6,52
4	Thìa là hóa gỗ Leonid	Xyloselinum leonidii	HG03a	Trên mặt đất	55,00	6,92

Chương này cũng chuẩn hóa các bước tiến hành định tính bằng phản ứng hóa học ống nghiệm (12 nhóm chất), phương pháp điều chế dịch thử A và dịch thử B (thủy phân acid nhằm khảo sát aglycon), thông số vận hành hệ thống sắc ký HPTLC tự động (bản mỏng, chất chuẩn, hệ pha động I và II, thuốc thử hiện màu NP/PEG), cùng các thông số phần cứng, phần mềm và điều kiện chạy phổ LC-MS/MS QTOF kết nối mạng phân tử GNPS.

Chương 3: Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được qua ba kỹ thuật phân tích:

1. Kết quả định tính bằng phản ứng thường quy: Thử nghiệm trên 4 mẫu dược liệu cho thấy sự tương đồng và khác biệt rõ ràng giữa các nhóm chất chuyển hóa thứ cấp:

Nhóm chất thử nghiệm	Áp nhĩ cần (HG01)	Cần dại (SP06b)	TLTG Việt (HG02)	TLTG Leonid (HG03a)
Flavonoid	Dương tính (+)	Dương tính (+)	Dương tính (+)	Dương tính (+)
Coumarin	Dương tính (+)	Dương tính (+)	Dương tính (+)	Dương tính (+)
Saponin	Dương tính (+)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Âm tính (-)
Alcaloid	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Âm tính (-)
Tanin	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Âm tính (-)
Anthranoid	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Âm tính (-)
Glycosid tim	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Âm tính (-)
Acid hữu cơ	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Âm tính (-)
Đường khử	Dương tính (+++)	Dương tính (++)	Dương tính (++)	Dương tính (+)
Acid amin	Âm tính (-)	Dương tính (+)	Dương tính (++)	Âm tính (-)
Polysaccharid	Dương tính (++)	Dương tính (+)	Dương tính (+)	Dương tính (+)
Caroten	Dương tính (+)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Âm tính (-)

Tất cả 4 mẫu nghiên cứu đều cho phản ứng dương tính rõ rệt với nhóm flavonoid, coumarin, đường khử và polysaccharid; đồng thời đều âm tính với alcaloid, tanin, anthranoid, glycosid tim và acid hữu cơ. Riêng saponin và caroten chỉ tìm thấy ở Áp nhĩ cần; acid amin chỉ xuất hiện ở Cần dại và Thìa là thân gỗ Việt.

2. Kết quả sắc ký lớp mỏng (HPTLC):

• Hệ dung môi I (phân cực mạnh): Sau khi phun thuốc thử NP/PEG và quan sát dưới UV 366 nm, mẫu Áp nhĩ cần xuất hiện vết huỳnh quang màu xanh sáng tại giá trị Rf = 0,49 hoàn toàn trùng khớp với chất chuẩn acid chlorogenic. Hai mẫu Cần dại và TLTG Leonid có sự xuất hiện của hai vết huỳnh quang xanh tương đồng ở vị trí Rf = 0,39 và Rf = 0,28. Mẫu TLTG Việt cho thấy sự khác biệt khi có một vết huỳnh quang xanh đậm ở Rf = 0,91 và vết màu vàng đặc trưng của flavonoid tại Rf = 0,39 (trong khi TLTG Leonid không xuất hiện vết này).
• Hệ dung môi II (phân cực trung bình): Trên sắc ký đồ của dịch thử A và dịch thủy phân B quan sát ở UV 366 nm (hiện màu NP/PEG), mẫu Áp nhĩ cần xuất hiện vết tương đồng với chất đối chiếu luteolin ở Rf = 0,41 và chất chuẩn apigenin ở Rf = 0,50. Cả 4 mẫu nghiên cứu đều cho vết huỳnh quang tương đồng với chất đối chiếu acid caffeic tại vị trí Rf = 0,42. Hai loài Thìa là thân gỗ (X. vietnamense và X. leonidii) thể hiện mức độ tương đồng hóa học rất cao với các vết có chung giá trị Rf = 0,22; 0,42 và 0,70. Đối với phân đoạn aglycon sau thủy phân acid, hai loài Xyloselinum tiếp tục thể hiện sự đồng nhất tại 5 vết có Rf = 0,32; 0,39; 0,42; 0,52 và 0,65.

3. Kết quả phân tích LC-MS/MS và mạng phân tử GNPS: Từ dữ liệu khối phổ phân giải cao, đề tài đã thiết lập các mã định danh mạng phân tử trên máy chủ GNPS và xử lý bằng Cytoscape:

• Ở loài Áp nhĩ cần (C. japonica), mạng phân tử đã dự đoán được 18 hợp chất, trong đó có 13 hợp chất thuộc cấu trúc phenolic. Kết quả nhận diện thành công sự có mặt của hai flavonoid chủ chốt là luteolin và apigenin, hoàn toàn phù hợp với dữ liệu trên thế giới và kết quả đối chiếu HPTLC. Ngoài ra, một hợp chất hiếm là corchorifatty acid F cũng bước đầu được dự đoán.
• Ở hai loài chi Xyloselinum, mạng phân tử đã chứng minh sự trùng khớp của 6 hợp chất chung giữa hai loài gồm: acid D-(-)-quinic, acid daucic, acid 5-O-caffeoylquinic, peucedanol, scolymosid và praerosid II. Phát hiện này củng cố mối liên hệ phát sinh loài và sự tương đồng về thành phần hóa học giữa hai loài thực vật đặc hữu này.
• Ở loài Cần dại (H. bivittatum), nghiên cứu đã dự đoán được 10 hợp chất, trong đó nhận diện được hai hợp chất phenolic tiêu biểu là dinoseb và peucedanol.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã hoàn thành toàn bộ các mục tiêu đặt ra và cung cấp các kết quả thực nghiệm định lượng, định tính cụ thể:

1. Xác định được tỷ lệ thu hồi cao chiết ethanol 70% từ 4 mẫu dược liệu: Áp nhĩ cần đạt 13,5% (8,1 g cắn/60 g dược liệu); Cần dại đạt 16,42% (5,28 g cắn/32,15 g dược liệu); Thìa là thân gỗ Việt đạt 10,87% (6,52 g cắn/60 g dược liệu); và Thìa là hóa gỗ Leonid đạt 12,58% (6,92 g cắn/55 g dược liệu).
2. Chứng minh thực nghiệm bằng phản ứng hóa học sự có mặt của 4 nhóm chất chính (flavonoid, coumarin, đường khử, polysaccharid) trong cả 4 mẫu; định danh cụ thể trên sắc ký lớp mỏng sự hiện diện của acid chlorogenic, luteolin, apigenin trong Áp nhĩ cần và acid caffeic trong cả 4 mẫu.
3. Ứng dụng thành công kỹ thuật LC-MS/MS QTOF kết hợp công cụ mạng phân tử GNPS để dự đoán 18 hợp chất trong Áp nhĩ cần, 10 hợp chất trong Cần dại, và chỉ ra 6 hợp chất phenolic/axit hữu cơ tương đồng giữa hai loài Xyloselinum Việt Nam (acid D-(-)-quinic, acid daucic, acid 5-O-caffeoylquinic, peucedanol, scolymosid, praerosid II).

Đóng góp khoa học mới của khóa luận bao gồm việc cung cấp dữ liệu hóa thực vật đầu tiên đối với loài Cần dại (Heracleum bivittatum) – loài trước đây chưa từng có tài liệu hóa học công bố; đồng thời bổ sung cơ sở dữ liệu hóa học thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam cho loài Áp nhĩ cần (Cryptotaenia japonica) và hai loài thực vật đặc hữu quý hiếm thuộc chi Xyloselinum.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Tác giả đã thẳng thắn chỉ rõ một số hạn chế nội tại trong quá trình thực nghiệm:

• Do các đối tượng thực vật nghiên cứu (đặc biệt là H. bivittatum và chi Xyloselinum) còn rất mới và chưa được khám phá nhiều trên thế giới, cơ sở dữ liệu phổ chuẩn đối chiếu trên hệ thống thư viện GNPS còn hạn chế. Do đó, số lượng hợp chất được khẳng định và dự đoán qua mạng phân tử vẫn còn tương đối khiêm tốn so với tổng số pic quan sát được trên sắc ký đồ khối phổ.
• Khóa luận mới dừng lại ở mức độ định tính hóa học, nhận diện sơ bộ qua sắc ký và khối phổ, chưa tiến hành định lượng hàm lượng phenolic tổng, flavonoid tổng cũng như chưa phân lập các hợp chất ở dạng tinh khiết.

Các hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất:

1. Tiếp tục triển khai các phương pháp sắc ký điều chế để phân lập các hợp chất phenolic, furanocoumarin tinh khiết từ các phân đoạn cao chiết có hoạt tính.
2. Tiến hành định lượng cụ thể hàm lượng polyphenol toàn phần và flavonoid toàn phần trong các mẫu nghiên cứu bằng các phương pháp đo quang chuẩn hóa.
3. Thực hiện các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học in vitro như khả năng chống oxy hóa (DPPH, ABTS), hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm nhằm xác lập mối tương quan giữa thành phần hóa học và tác dụng sinh học.
4. Mở rộng điều tra, thu thập mẫu và khảo sát hóa thực vật đối với các đại diện khác thuộc họ Apiaceae tại các vùng núi phía Bắc Việt Nam nhằm làm giàu thêm cơ sở dữ liệu tài nguyên cây thuốc Việt Nam.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị dành cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên các chuyên ngành Dược học, Hóa dược, Hóa học các hợp chất tự nhiên và Thực vật học.
• Những người thực hiện đề tài liên quan đến chiết xuất, chuẩn hóa dược liệu, hoặc nghiên cứu sàng lọc hoạt chất tự nhiên từ các loài thuộc họ Hoa tán (Apiaceae).

Các nội dung có giá trị tham khảo ứng dụng cao trong văn bản bao gồm:

• Quy trình chiết xuất và kỹ thuật xử lý làm sạch mẫu dịch chiết qua cột chiết pha rắn C18 (SPE C18) để loại bỏ chất diệp lục mà không làm thất thoát các hợp chất phenolic.
• Điều kiện phân tích HPTLC tối ưu trên hai hệ dung môi phân cực khác nhau để tách và nhận diện các aglycon flavonoid và acid phenolic sau thủy phân.
• Quy trình ứng dụng phương pháp phân tích chuyển hóa (metabolomics) thông qua công cụ phân tích mạng dữ liệu phân tử GNPS và Cytoscape trên nền dữ liệu khối phổ phân giải cao HR-MS/MS ion âm.

Câu hỏi thường gặp

1. Bốn loài thực vật trong khóa luận được thu hái ở những địa phương nào và có mã số tiêu bản giám định ra sao?
Các mẫu thực vật được thu hái trong năm 2023 tại miền Bắc Việt Nam và được giám định tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật (VAST): Cần dại (Heracleum bivittatum) thu tại Sa Pa, Lào Cai (mã tiêu bản CSCL.03/23-24-SP06); Áp nhĩ cần (Cryptotaenia japonica) thu tại Quản Bạ, Hà Giang (mã CSCL.03/23-24-HG01); Thìa là thân gỗ Việt (Xyloselinum vietnamense) thu tại Quản Bạ, Hà Giang (mã CSCL.03/23-24-HG02); và Thìa là hóa gỗ Leonid (Xyloselinum leonidii) thu tại Đồng Văn, Hà Giang (mã CSCL.03/23-24-HG03a).

2. Hiệu suất thu hồi cao chiết ethanol 70% của từng mẫu dược liệu là bao nhiêu?
Từ khối lượng bột dược liệu ban đầu, khối lượng cao chiết khô thu được lần lượt là: mẫu rễ Cần dại thu 5,28 g cao từ 32,15 g mẫu (hiệu suất 16,42%); mẫu Áp nhĩ cần thu 8,10 g cao từ 60,00 g mẫu (hiệu suất 13,50%); mẫu Thìa là hóa gỗ Leonid thu 6,92 g cao từ 55,00 g mẫu (hiệu suất 12,58%); và mẫu Thìa là thân gỗ Việt thu 6,52 g cao từ 60,00 g mẫu (hiệu suất 10,87%).

3. Sắc ký lớp mỏng (HPTLC) đã xác định được những chất chuẩn phenolic cụ thể nào trong các mẫu?
Phân tích HPTLC đối chiếu với các chất chuẩn tinh khiết đã xác định: Áp nhĩ cần chứa acid chlorogenic (Rf = 0,49 trên hệ dung môi I), luteolin (Rf = 0,41 trên hệ dung môi II) và apigenin (Rf = 0,50 trên hệ dung môi II). Ngoài ra, cả 4 mẫu nghiên cứu đều xác định có chứa acid caffeic (vết tương đồng ở Rf = 0,42 trên hệ dung môi II).

4. Hai loài Thìa là thân gỗ đặc hữu thuộc chi Xyloselinum có những hợp chất chung nào được phát hiện qua mạng phân tử GNPS?
Mạng phân tử GNPS đã phát hiện 6 hợp chất chung có mặt ở cả hai loài Xyloselinum vietnamense và Xyloselinum leonidii bao gồm: acid D-(-)-quinic, acid daucic, acid 5-O-caffeoylquinic, peucedanol, scolymosid và praerosid II.

5. Thử nghiệm định tính hóa học thường quy cho kết quả âm tính đồng loạt ở những nhóm chất nào?
Cả 4 mẫu nghiên cứu (C. japonica, H. bivittatum, X. vietnamense, X. leonidii) đều cho kết quả âm tính hoàn toàn với 5 nhóm hợp chất tự nhiên: alcaloid, tanin, anthranoid, glycosid tim và acid hữu cơ.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Ngô Hồng Duy đã hoàn thành nghiên cứu thực nghiệm khảo sát thành phần hóa học của 4 loài thuộc họ Apiaceae thu hái tại miền Bắc Việt Nam, đặc biệt là nhóm phenolic. Bằng việc kết hợp các phản ứng định tính thường quy, sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và kỹ thuật LC-MS/MS phân giải cao kết nối mạng dữ liệu phân tử GNPS, đề tài đã chứng minh sự hiện diện của các flavonoid và dẫn chất acid phenolic chủ chốt, đồng thời xác lập mức độ tương đồng hóa thực vật cao giữa hai loài đặc hữu thuộc chi Xyloselinum. Các kết quả đạt được là nguồn cơ sở dữ liệu thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam đối với loài Heracleum bivittatum và Cryptotaenia japonica, đặt nền tảng tin cậy cho các hướng nghiên cứu phân lập hoạt chất và thăm dò hoạt tính sinh học trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Họ Hoa tán (Apiaceae), là một trong những họ thực vật đa dạng và phong phú ở Việt Nam. Các loài trong họ này không chỉ đóng vai trò quan trọng trong ngành nông nghiệp, thực phẩm, mà còn có giá trị lớn trong y học cổ truyền. Sự đa dạng sinh học của Việt Nam, đặc biệt là ở miền Bắc, cung cấp một môi trường phong phú cho sự phát triển của nhiều loài cây thuộc họ Apiaceae. Mặc dù vậy, cho đến nay, nghiên cứu về thành phần hóa học của nhiều loài trong họ Apiaceae ở Việt Nam vẫn còn hạn chế.

Do đó, nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong họ Apiaceae ở miền Bắc Việt Nam trở nên cần thiết để cung cấp kiến thức quan trọng trong việc hiểu biết và tận dụng tối đa tiềm năng y học và dinh dưỡng của các loài cây này. Hiện nay, loài Cần dại (Heracleum bivitttum H. Boissieu); loài Áp nhĩ cần (Cryptotaenia japonica Hassk); loài Thìa là thân gỗ việt (Xyloselinum vietnamense Pimenov & Kljuykov) và Thìa là hóa gỗ leonid (Xyloselinum leonidii Pimenov & Kljuykov) vẫn chưa có nhiều nghiên cứu tại Việt Nam cũng như trên thế giới trong khi loài Áp nhĩ cần (Cryptotaenia japonica Hassk) cũng đã được ghi nhận ở Việt Nam nhưng chưa được nghiên cứu. Vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần Phenolic trong một số loài thuộc họ Apiaceae ở miền Bắc Việt Nam” nhằm mục tiêu cung cấp các cơ sở dữ liệu về thành phần hóa học để làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về tác dụng sinh học để tìm ra các hợp chất có tác dụng sinh học từ các loài này.

Để thực hiện mục tiêu trên, đề tài tiến hành các nội dung sau: - Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong 4 mẫu nghiên cứu. - Chiết xuất cao chiết ethanol 70% từ 4 mẫu nghiên cứu. - Định tính cao chiết bằng sắc ký lớp mỏng. - Sơ bộ dự đoán một số hợp chất trong cao chiết các mẫu nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ và mạng dữ liệu phân tử GNPS.

Tổng quan về chi Heracleum L. Vị trí phân loại của chi Heracleum L. Theo hệ thống phân loại thực vật hiển hoa (Flowering plants) của tác giả A. Downie (2017) [33], vị trí của chi Heracleum L.

trong giới thực vật như sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Cúc (Asteridae) Bộ: Hoa tán (Apiales) Họ: Hoa tán (Apiaceae) Chi: Heracleum L. Đặc điểm thực vật của chi Heracleum L. Chi Heracleum có cây hai năm hoặc lâu năm. Rễ hình thoi hoặc hình trụ, phình to, hiếm khi có xơ.

Thân mọc thẳng, hình trụ và thường có gân hoặc rãnh, phân nhánh. Lá ở gốc và lá phía dưới có cuống; bẹ cuống lá thường rộng dễ thấy; lá thường phân nhánh thành ba lá hoặc lá phân ba, có lông hoặc nhẵn. Chùm hoa rộng ở đỉnh và hai bên, ở đỉnh thường mang cả hoa đực và hoa cái, còn ở hai bên thường chỉ có hoa đực; lá bắc ít hoặc không có, thường rụng; tia hoa nhiều, mở rộng và hướng lên; nhiều lá bắc, hình dải hoặc hình mác, nguyên vẹn; chùm nhiều hoa. Đài hoa có răng hình tam giác, hình mũi mác hoặc không có.

Cánh hoa màu trắng, hiếm khi màu hồng hoặc vàng nhạt, hình tim ngược hoặc hình tim, dưới hình nêm, đỉnh có khía với một thùy cong hẹp; các bông hoa ở rìa thường to lớn với cánh hoa bên ngoài phình to, hình tim ngược, đỉnh sâu 2 thùy. Phần chóp bầu nhụy hình nón; kiểu ngắn, thẳng đứng hoặc cong xuống.