Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Chi Trà (Camellia L.) thuộc họ Chè (Theaceae) là một trong những chi thực vật có giá trị kinh tế và ứng dụng y dược phong phú với khoảng 300 loài trên thế giới và gần 70 loài ghi nhận tại Việt Nam. Các nghiên cứu hóa thực vật trước đây chỉ ra rằng các loài thuộc chi này chứa hàm lượng cao các polyphenol, catechin, flavonoid, saponin và polysaccharide, mang lại nhiều tác dụng sinh học như chống oxy hóa, kháng khuẩn, bảo vệ gan, hạ đường huyết và phòng ngừa ung thư. Trong đó, Hải đường (hay Hải đường Việt Nam), danh pháp khoa học là Camellia amplexicaulis (Pit.) Cohen-Stuart, là loài thực vật đặc hữu của Việt Nam, từng phát hiện cá thể tự nhiên tại Vườn Quốc gia Tam Đảo. Dù theo Danh lục Đỏ của IUCN loài này đã được ghi nhận tuyệt chủng ngoài tự nhiên, cây hiện vẫn được nhân giống và trồng làm cảnh phổ biến tại các tỉnh phía Bắc như Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Bắc Giang và Hà Nội nhờ hoa màu đỏ hồng đặc trưng.

Tuy nhiên, các dữ liệu khoa học về đặc điểm giải phẫu vi phẫu, thành phần hóa thực vật cũng như hoạt tính sinh học định hướng tác dụng chống oxy hóa của loài Camellia amplexicaulis tại Việt Nam còn rất hạn chế. Để bổ sung cơ sở khoa học nhằm nâng cao giá trị sử dụng của dược liệu này, khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ với đề tài "Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học định hướng tác dụng chống oxy hóa của cây Hải đường (Camellia sp.)" đã được thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội và Trường Đại học Phenikaa (năm 2024).

Đề tài đặt ra 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể được đánh số như sau:

  1. Mô tả đặc điểm hình thái và giải phẫu của thân và lá Hải đường.
  2. Phân lập được 1-2 chất tinh khiết từ lá của loài Hải đường (Camellia amplexicaulis (Pit.) Cohen-Stuart).
  3. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các chất vừa phân lập được trên mô hình DPPH.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng thực vật: Mẫu cành mang lá và hoa của cây Hải đường được thu hái tại huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên vào tháng 11 năm 2023. Tên khoa học của mẫu được giám định là Camellia amplexicaulis (Pit.) Cohen-Stuart (bởi ThS. Nghiêm Đức Trọng). Mẫu tiêu bản khô được lưu giữ tại Phòng tiêu bản cây thuốc, Trường Đại học Dược Hà Nội với mã số HNIP/18824/24.
  • Đối tượng hóa học: 2 kg bột lá Hải đường đã được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 60°C đến độ ẩm dưới 10% và nghiền nhỏ để phục vụ cho các thực nghiệm chiết xuất, phân lập và thử hoạt tính sinh học in vitro.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế kết hợp giữa phương pháp mô tả hình thái - giải phẫu thực vật học, phương pháp hóa thực vật (phân tích định tính, chiết xuất phân đoạn, phân lập sắc ký, xác định cấu trúc phổ) và thử nghiệm sinh học in vitro định hướng hoạt tính chống oxy hóa.

Cơ sở lý thuyết và phân loại học

Khóa luận tổng quan vị trí phân loại của chi Camellia L. trong ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), bộ Chè (Theales), họ Chè (Theaceae). Tổng quan tài liệu về thành phần hóa học của chi Trà chỉ ra sự hiện diện của các polyphenol quan trọng (catechin, rutin, quercetin, acid gallic, kaempferol). Đối với loài Camellia amplexicaulis, các công trình công bố trước đây của Cuc N.T và cộng sự, Nguyễn Hữu Tùng và cộng sự đã ghi nhận sự có mặt của các hợp chất amplexicosid A-D, chrysandrosid A-B, camelliquercetisid C, camelliosid A, isolarciresinol cùng một số dẫn xuất neolignan.

Phương pháp nghiên cứu thực vật học

  • Đặc điểm hình thái: Quan sát, phân tích, chụp ảnh chi tiết các cơ quan sinh dưỡng (thân, cành, lá, lá bao chồi) và cơ quan sinh sản (hoa, đài, tràng, bộ nhị, bộ nhụy) bằng mắt thường và máy ảnh quang học.
  • Đặc điểm giải phẫu vi phẫu: Cắt lát mỏng vi phẫu thân non và lá tươi, làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm kép sử dụng thuốc nhuộm xanh methylen và đỏ son phèn sau khi tẩy bằng dung dịch Javen và rửa qua acid acetic loãng. Quan sát và chụp ảnh cấu trúc giải phẫu dưới kính hiển vi quang học ở các độ phóng đại vật kính 4x, 10x và 40x.

Phương pháp nghiên cứu hóa học

  • Định tính sơ bộ: Sử dụng các phản ứng hóa học ống nghiệm đặc trưng theo giáo trình Thực tập Dược liệu (Đại học Dược Hà Nội) để phát hiện sự có mặt của các nhóm hợp chất tự nhiên: flavonoid (phản ứng Cyanidin, FeCl3 5%, kiềm loãng, hơi amoniac), alcaloid (thuốc thử Mayer, Dragendorff, Bouchardat), anthranoid (phản ứng Borntraeger), coumarin (phản ứng đóng mở vòng lacton, Diazo), saponin (thử nghiệm tạo bọt, phản ứng Liebermann-Burchard), tanin (dung dịch FeCl3 5%, chì acetat 10%), acid amin (thuốc thử Ninhydrin), đường khử (thuốc thử Fehling A và B), chất béo và sterol.
  • Chiết xuất và phân đoạn: Bột lá khô (2 kg) được ngâm chiết kiệt với ethanol 96% ở nhiệt độ phòng (10 lít/lần x 3 lần, mỗi lần 48 giờ). Gộp dịch chiết, cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay thu cao toàn phần. Phân tán cao toàn phần vào nước cất và chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, ethyl acetat và n-butanol.
  • Phân lập hợp chất: Kết hợp các kỹ thuật sắc ký:
    • Sắc ký lớp mỏng (TLC) pha thường (Silica gel 60 F254) và pha đảo (RP-18 F254) để theo dõi và kiểm tra vết.
    • Sắc ký cột hấp phụ pha đảo với chất nhồi Silica gel LiChroprep RP-18 (40–63 µm), rửa giải gradient hệ dung môi methanol - nước từ 40% đến 100% MeOH.
    • Sắc ký lọc gel rây phân tử qua cột Sephadex LH-20, rửa giải bằng methanol 100%.
    • Sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Prep-HPLC) sử dụng hệ pha động acetonitrile - nước có bổ sung 0,01% acid formic để thu nhận các chất tinh khiết.
  • Xác định cấu trúc hóa học: Đo phổ khối ion hóa phun điện tử (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều bao gồm 1H-NMR (600 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) đo trong dung môi CD3OD, đối chiếu dữ liệu phổ thực nghiệm với tài liệu tham khảo đã công bố.

Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa

Khả năng bắt giữ gốc tự do được đánh giá qua mô hình 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) in vitro. Hỗn hợp phản ứng gồm 20 µL dịch thử nghiệm ở các nồng độ pha loãng và 180 µL dung dịch DPPH 0,1 mM trong methanol, ủ tối 30 phút ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thụ quang học tại bước sóng 517 nm trên đầu đọc vi đĩa Epoch Biotek. Quercetin được sử dụng làm chất đối chứng dương. Khả năng ức chế gốc tự do được tính theo phần trăm và giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% gốc tự do DPPH) được xử lý thống kê bằng phần mềm GraphPad Prism 5.

Nội dung chính theo từng chương

Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về chi Camellia L. và loài Camellia amplexicaulis. Tác giả hệ thống hóa vị trí phân loại, đặc điểm hình thái học của chi Trà, thành phần hóa học nổi bật của các loài như C. sinensis, C. chrysantha, C. japonica, C. oleifera, C. nitidissima, cùng các hoạt tính sinh học đã chứng minh (chống oxy hóa, kháng khuẩn, hạ đường huyết, chống ung thư). Riêng với loài Hải đường (C. amplexicaulis), chương tổng quan nêu rõ lịch sử phân loại từ khi được Pitard phát hiện năm 1910, các công bố phân lập 17 hợp chất neolignan và glycoside trước đó, cùng các tác dụng theo y học cổ truyền (thanh nhiệt, giải độc, hoạt huyết, tiêu sưng, cầm máu).

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết nguồn gốc nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi phân tích và các thiết bị sử dụng (kính hiển vi, máy cô quay Buchi, máy đo NMR, máy đọc đĩa vi thể). Quy trình thực nghiệm được mô tả thành các bước cụ thể: xử lý mẫu thực vật, giám định tên khoa học, quy trình nhuộm kép vi phẫu, các bước phản ứng định tính 9 nhóm chất, sơ đồ chiết xuất phân bố lỏng - lỏng từ 2 kg bột dược liệu, quy trình sắc ký cột RP-18 và Sephadex LH-20, quy trình chạy Prep-HPLC phân lập chất tinh khiết và quy trình thử nghiệm DPPH.

Chương 3. Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương thực nghiệm tập trung vào 4 nhóm kết quả chính:

1. Đặc điểm thực vật và giải phẫu vi phẫu

  • Hình thái: Cây bụi hoặc gỗ nhỏ cao 2,5–3 m; cành già màu nâu bóng loang lổ đen; thân non màu xanh nhẵn. Lá đơn mọc so le, không cuống, gốc lá hình tim ôm lấy thân, phiến lá thuôn dài 12–25 cm, rộng 5–12 cm, mặt dưới có nhiều tuyến đen, mép có răng cưa nông. Hoa mọc đơn độc ở đầu cành, đường kính 5–9 cm; cuống hoa ngắn 0,5–1 cm; đài 6 phiến rời không đều; tràng 9–11 cánh màu đỏ hồng dính nhau ở gốc; bộ nhị gồm 300–320 nhị xếp nhiều vòng, chỉ nhị dính liền ở gốc đến 1/2 chiều dài; bộ nhụy gồm 3 lá noãn hợp thành bầu trên 3 ô, vòi nhụy xẻ 3 rời dạng sợi dài 4–5 cm.
  • Vi phẫu lá: Gân giữa lồi ở cả hai mặt (mặt dưới lồi nhiều hơn). Biểu bì trên và dưới hóa cutin; mô dày dưới 3–5 lớp tế bào đa giác góc dày; mô cứng 3–5 lớp bao quanh bó libe - gỗ xếp hình cung; mạch gỗ xếp thành dãy xuyên tâm; tinh thể calci oxalat hình khối nằm rải rác. Phiến lá có mô giậu 1–2 lớp tế bào xếp sít nhau thẳng đứng; mô khuyết nhiều gian bào; thể cứng phân nhánh hình nhiều thùy nằm rải rác trong mô mềm.
  • Vi phẫu thân: Tiết diện gần tròn; biểu bì phủ cutin ngoài cùng; mô dày 1–2 lớp; mô mềm vỏ tế bào vách mỏng; mô cứng 2–3 lớp hóa gỗ bắt màu xanh tạo vòng; libe cấp 2 và gỗ cấp 2 xếp thành dãy xuyên tâm; gỗ sơ cấp nằm trong cùng; mô mềm ruột chứa tinh thể calci oxalat hình khối và thể cứng hình gai.

2. Định tính thành phần hóa học bột lá

Kết quả phản ứng hóa học định tính các nhóm hợp chất tự nhiên trong bột lá Hải đường được tổng hợp trong bảng sau:

STT Tên nhóm chất Phản ứng thực hiện Hiện tượng / Kết quả Kết luận
1 Flavonoid Cyanidin / Kiềm loãng / FeCl3 5% / Amoniac Chuyển đỏ / Tủa vàng / Xanh đen / Vàng đậm Dương tính (+)
2 Alcaloid Mayer / Dragendorff / Bouchardat Không xuất hiện kết tủa đặc trưng Âm tính (-)
3 Anthranoid Phản ứng Borntraeger Lớp kiềm có màu đỏ sẫm Dương tính (+)
4 Coumarin Mở vòng lacton / Diazo hóa Không có hiện tượng mở - đóng vòng Âm tính (-)
5 Saponin Tạo bọt / Liebermann-Burchard Bọt bền sau 15 phút / Vòng tím đỏ, lớp trên xanh Dương tính (+)
6 Tanin Dung dịch FeCl3 5% / Chì acetat 10% Tủa màu xanh đen / Tủa bông Dương tính (+)
7 Acid amin Thuốc thử Ninhydrin Không xuất hiện màu xanh tím Âm tính (-)
8 Đường khử Thuốc thử Fehling A và B đun sôi Xuất hiện kết tủa đỏ gạch Dương tính (+)
9 Chất béo Thử vết mờ trên giấy lọc Không để lại vết mờ Âm tính (-)

3. Chiết xuất phân đoạn và sàng lọc hoạt tính DPPH

Từ 2 kg bột lá, dịch chiết ethanol 96% cô đặc thu được 144,71 g cao toàn phần (CA1). Chiết phân bố lỏng - lỏng thu được 22,8 g cao n-hexan (CA2), 13,13 g cao ethyl acetat (CA3), 52,87 g cao n-butanol (CA4) và phân đoạn nước (CA5). Kết quả thử hoạt tính bắt gốc DPPH của các phân đoạn được thể hiện ở bảng sau:

Ký hiệu mẫu Phân đoạn chiết Giá trị IC50 (µg/mL) Khoảng tin cậy 95% (µg/mL) Hệ số R²
CA1 Cao toàn phần 7,51 4,70 – 10,53 0,9084
CA2 Cao n-hexan 40,36 35,59 – 45,77 0,9933
CA3 Cao ethyl acetat 6,89 4,51 – 10,53 0,9745
CA4 Cao n-butanol 11,24 9,06 – 13,94 0,9923
CA5 Phân đoạn nước 10,09 7,80 – 13,06 0,9887

Phân đoạn ethyl acetat (CA3) thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất (IC50 = 6,89 µg/mL) nên được chọn để thực hiện phân lập hoạt chất.

4. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học

Từ 2,40 g cao ethyl acetat, qua sắc ký cột RP-18 thu được 11 phân đoạn. Phân đoạn E2 (0,79 g) qua cột Sephadex LH-20 thu 7 phân đoạn nhỏ. Phân đoạn E2.1 (234,8 mg) được tinh chế bằng Prep-HPLC thu được 2 hợp chất tinh khiết:

  • Hợp chất CAE2.1 (35,6 mg): Tinh thể màu trắng vàng. Phổ ESI-MS cho pic ion phân tử m/z 171 [M+H]+. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 600 MHz) có 1 tín hiệu singlet tại δH 7,08 ppm (2H, s, H-2, H-6) của vòng thơm đối xứng. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) xuất hiện 5 tín hiệu carbon: δC 122,03 (C-1), 110,33 (C-2, C-6), 146,39 (C-3, C-5), 139,57 (C-4) và 170,42 (C-7, nhóm -COOH). Cấu trúc được xác định là acid gallic (acid 3,4,5-trihydroxybenzoic).
  • Hợp chất CAE2.2 (16,6 mg): Bột vô định hình màu nâu. Phổ ESI-MS cho pic ion m/z 183 [M-H]-. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 600 MHz) xuất hiện tín hiệu singlet thơm tại δH 7,064 ppm (2H, s, H-2, H-6) và 1 nhóm methoxy tại δH 3,845 ppm (3H, s, -OCH3). Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) xuất hiện các tín hiệu: δC 121,45 (C-1), 110,05 (C-2, C-6), 146,50 (C-3, C-5), 139,76 (C-4), 169,02 (C-7) và 52,25 (-OCH3). Cấu trúc được xác định là methyl gallat (methyl 3,4,5-trihydroxybenzoat).

Dữ liệu phổ NMR đối chiếu của hai hợp chất được tổng hợp trong bảng:

Vị trí carbon Hợp chất CAE2.1 (Acid gallic) Acid gallic tham khảo [40] Hợp chất CAE2.2 (Methyl gallat) Methyl gallat tham khảo [36]
δC (ppm) δC (ppm) δC (ppm) δC (ppm)
C-1 122,03 122,04 121,45 121,54
C-2, C-6 110,33 110,37 110,05 110,11
C-3, C-5 146,39 146,44 146,50 146,52
C-4 139,57 139,63 139,76 139,74
C-7 170,42 170,45 169,02 169,05
-OCH3 — — 52,25 52,30

5. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các chất phân lập

Thử nghiệm trên mô hình bắt gốc tự do DPPH cho kết quả hoạt tính của hai hợp chất phân lập đối chiếu với chất chuẩn Quercetin:

Hợp chất thử nghiệm Giá trị IC50 (µg/mL) Khoảng tin cậy 95% (µg/mL) Hệ số tương quan R²
CAE2.1 (Acid gallic) 16,57 9,45 – 19,04 0,9858
CAE2.2 (Methyl gallat) 35,42 31,58 – 39,72 0,9988
Quercetin (Chuẩn đối chứng) 10,70 8,76 – 13,08 0,9922

Cả hai hợp chất đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa rất mạnh (IC50 < 50 µg/mL). Trong đó, acid gallic có hoạt tính bắt gốc DPPH mạnh hơn methyl gallat, điều này được tác giả bàn luận là do nhóm thế ester hóa (-OCH3) ở vị trí C-7 làm giảm bớt mức độ tự do không gian và ảnh hưởng tới khả năng nhường hydro của các nhóm phenolic hydroxyl.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

  1. Đặc điểm thực vật: Đã mô tả chi tiết hình thái thực vật và giải phẫu vi phẫu của thân và lá cây Hải đường (Camellia amplexicaulis (Pit.) Cohen-Stuart) thu hái tại Phú Lương, Thái Nguyên. Chỉ ra các đặc điểm nhận diện đặc thù: phiến lá không cuống ôm thân, mặt dưới lá có tuyến đen; cấu tạo hoa đỏ hồng gồm 6 lá đài, 9–11 cánh tràng, 300–320 nhị dính liền gốc và bầu 3 ô; vi phẫu có sự hiện diện của thể cứng phân nhánh lớn và tinh thể calci oxalat hình khối.
  2. Thành phần hóa học: Xác định sự có mặt của các nhóm hợp chất flavonoid, anthranoid, saponin, tanin, đường khử và không chứa alcaloid trong bột lá.
  3. Chiết xuất và phân lập: Từ 2 kg lá khô đã chiết xuất được 144,71 g cao toàn phần; phân đoạn ethyl acetat có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất (IC50 = 6,89 µg/mL). Bằng sắc ký cột RP-18, Sephadex LH-20 và Prep-HPLC đã phân lập được 35,6 mg acid gallic và 16,6 mg methyl gallat.
  4. Hoạt tính sinh học: Xác định giá trị IC50 bắt gốc tự do DPPH của acid gallic là 16,57 µg/mL và methyl gallat là 35,42 µg/mL.

Đóng góp khoa học của đề tài

  • Tính mới về hóa thực vật: Đây là công trình đầu tiên công bố việc phân lập và xác định cấu trúc của acid gallic và methyl gallat từ lá của loài Camellia amplexicaulis (Pit.) Cohen-Stuart.
  • Tính mới về thực vật dược: Lần đầu tiên tại Việt Nam mô tả đầy đủ và có hệ thống cấu trúc vi phẫu giải phẫu của thân và lá cây Hải đường, cung cấp dữ liệu khoa học nền tảng cho việc nhận dạng, phân loại và xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu.
  • Định hướng ứng dụng: Kết quả định tính không có alcaloid (caffein) kết hợp với hàm lượng polyphenol chống oxy hóa cao mở ra tiềm năng ứng dụng lá Hải đường làm nguồn trà thảo mộc không gây mất ngủ hoặc phát triển các chế phẩm hỗ trợ chống oxy hóa và kháng viêm.

Kiến nghị của tác giả

  • Tiếp tục nghiên cứu định lượng hàm lượng acid gallic và methyl gallat trong các bộ phận của cây Hải đường bằng phương pháp HPLC.
  • Mở rộng phân lập các hợp chất khác từ phân đoạn ethyl acetat và các phân đoạn chiết còn lại (n-hexan, n-butanol, nước).
  • Đánh giá sâu hơn các tác dụng sinh học khác của các cao phân đoạn và hợp chất phân lập được trên các mô hình tế bào và in vivo.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế về phương pháp chiết xuất: Phương pháp ngâm chiết tĩnh ở nhiệt độ phòng với ethanol 96% tốn nhiều thời gian (48 giờ x 3 lần) và lượng dung môi lớn, hiệu suất chiết xuất chưa cao so với các kỹ thuật hỗ trợ hiện đại như chiết siêu âm hoặc chiết hồi lưu nhiệt.
  • Hạn chế về mô hình thử nghiệm sinh học: Đề tài mới dừng lại ở mô hình bắt gốc tự do DPPH in vitro. Mặc dù DPPH là phương pháp sàng lọc nhanh và chi phí thấp, gốc tự do này không tồn tại trực tiếp trong các hệ thống sinh học sống, do đó chưa phản ánh toàn diện cơ chế chống oxy hóa tế bào.
  • Đặc tính dược động học của hoạt chất: Acid gallic phân lập được có nhược điểm độ ổn định kém và sinh khả dụng thấp theo các tài liệu tham khảo, gây hạn chế nhất định khi chuyển giao sang dạng bào chế điều trị.
  • Hướng mở rộng nghiên cứu: Khảo sát hàm lượng hoạt chất theo các mùa thu hái khác nhau; triển khai đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên các dòng tế bào (HepG2, đại thực bào RAW 264.7) và nghiên cứu các hoạt tính kháng viêm, hạ đường huyết hoặc ức chế enzyme α-glucosidase.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và thực tiễn cao cho:

  • Sinh viên và học viên ngành Dược học, Thực vật học, Hóa thực vật: Cung cấp quy trình bài bản từ khâu thu hái, giám định tiêu bản, xử lý vi phẫu nhuộm kép đến kỹ thuật phân lập sắc ký nâng cao (kết hợp RP-18, Sephadex LH-20 và Prep-HPLC).
  • Cán bộ nghiên cứu và kiểm nghiệm dược liệu: Các mô tả chi tiết về vi phẫu thân non, lá và hình thái phấn hoa/hoa là cơ sở trực tiếp để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và chuyên luận kiểm nghiệm kiểm chứng cho dược liệu Hải đường (Camellia amplexicaulis).
  • Phần đáng tham khảo nhất: Bộ dữ liệu giải phẫu vi phẫu có chú giải chi tiết kèm hình vẽ minh họa (Mục 3.1.2) và sơ đồ chiết xuất phân đoạn kèm dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR đối chiếu (Mục 3.2.2 và 3.2.3).

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu thực vật cây Hải đường trong khóa luận được thu hái ở đâu và lưu trữ với mã số tiêu bản nào?

Mẫu cành mang lá và hoa được thu hái tại huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên vào tháng 11 năm 2023. Tiêu bản thực vật đã được giám định tên khoa học là Camellia amplexicaulis (Pit.) Cohen-Stuart bởi ThS. Nghiêm Đức Trọng và được lưu giữ tại Phòng tiêu bản cây thuốc, Trường Đại học Dược Hà Nội với mã số HNIP/18824/24.

2. Kết quả định tính sơ bộ bằng phản ứng hóa học ống nghiệm cho thấy lá Hải đường có và không có những nhóm chất nào?

Kết quả thực nghiệm xác định trong bột lá Hải đường có chứa các nhóm chất: flavonoid, anthranoid, saponin, tanin và đường khử. Ngược lại, mẫu không có phản ứng dương tính với alcaloid, coumarin, acid amin và chất béo.

3. Trong các phân đoạn chiết xuất, phân đoạn nào có hoạt tính chống oxy hóa DPPH mạnh nhất và hiệu suất phân lập ra sao?

Phân đoạn ethyl acetat (CA3) có hoạt tính bắt gốc tự do DPPH mạnh nhất với giá trị IC50 = 6,89 µg/mL (khoảng tin cậy 95%: 4,51 – 10,53 µg/mL). Từ 2,40 g cao ethyl acetat này, tác giả đã phân lập được 35,6 mg hợp chất CAE2.1 (acid gallic) và 16,6 mg hợp chất CAE2.2 (methyl gallat).

4. Bằng chứng phổ nào khẳng định cấu trúc của 2 hợp chất phân lập được?

  • Hợp chất CAE2.1 có phổ ESI-MS m/z 171 [M+H]+; 1H-NMR cho 1 tín hiệu singlet duy nhất của 2 proton thơm đối xứng tại δH 7,08 ppm (H-2, H-6); 13C-NMR cho 5 pic carbon tương ứng với vòng benzen 4 nhóm thế và nhóm carboxyl (δC 170,42 ppm), phù hợp hoàn toàn với acid gallic.
  • Hợp chất CAE2.2 có phổ ESI-MS m/z 183 [M-H]-; ngoài khung thơm tương tự acid gallic, phổ 1H-NMR xuất hiện thêm tín hiệu nhóm methoxy tại δH 3,845 ppm (3H, s) và 13C-NMR có tín hiệu carbon nhóm -OCH3 tại δC 52,25 ppm, khẳng định cấu trúc methyl gallat.

5. Hoạt tính chống oxy hóa của 2 chất phân lập được so sánh với chất chuẩn Quercetin như thế nào?

Cả hai chất đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa rất mạnh theo thang phân loại chuẩn (IC50 < 50 µg/mL). Trong đó, acid gallic (IC50 = 16,57 µg/mL) có hoạt tính cao hơn methyl gallat (IC50 = 35,42 µg/mL) và tiệm cận với hoạt tính của chất đối chứng dương Quercetin (IC50 = 10,70 µg/mL).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của dược sĩ Lê Thị Linh đã hoàn thành toàn diện các mục tiêu nghiên cứu thực nghiệm đối với loài Hải đường (Camellia amplexicaulis (Pit.) Cohen-Stuart) thu hái tại Thái Nguyên. Công trình đã xác lập mô tả vi phẫu giải phẫu lá và thân chi tiết đầu tiên tại Việt Nam, đồng thời lần đầu tiên phân lập và chứng minh sự hiện diện của hai hợp chất polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa mạnh là acid gallic và methyl gallat từ loài này. Kết quả nghiên cứu không chỉ đóng góp dữ liệu khoa học xác thực cho công tác kiểm nghiệm, chuẩn hóa dược liệu mà còn mở ra tiềm năng ứng dụng lá Hải đường trong nghiên cứu phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe nguồn gốc tự nhiên.