Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Gốc tự do được hình thành liên tục trong cơ thể sinh vật và con người, có khả năng phá hủy các bào quan và cấu trúc bên trong tế bào, dẫn đến đột biến và thoái hóa tế bào. Quá trình oxy hóa tế bào là nguyên nhân của nhiều bệnh nguy hiểm như Alzheimer, Parkinson, tăng huyết áp, ung thư, đái tháo đường. Việc nghiên cứu và ứng dụng các hợp chất tự nhiên có khả năng trung hòa gốc tự do vì vậy ngày càng được chú trọng trong lĩnh vực y học và dược phẩm.

Cây Sài hồ nam (Pluchea pteropoda Hemsl.), hay còn gọi là cây Lức, là một loài thuộc chi Pluchea, họ Asteraceae, phân bố chủ yếu ở vùng ven biển nhiệt đới châu Á. Tại Việt Nam, cây tập trung ở các tỉnh miền Trung và Đồng bằng sông Cửu Long, đặc thù thích nghi tốt với vùng nước lợ, nước ngọt và vùng nhiễm mặn. Trong y học dân gian, rễ cây Sài hồ nam được sử dụng để điều trị nhức đầu, hạ sốt, chống viêm và tức ngực. Tuy nhiên, đến thời điểm thực hiện đề tài (2023), các công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài này còn rất hạn chế. Ở Việt Nam, nghiên cứu trước đó mới chỉ dừng ở việc khảo sát các bộ phận trên mặt đất và phân lập các chất từ cao chiết có độ phân cực thấp.

Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận bao gồm năm nhiệm vụ cụ thể:

  1. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của thân cây P. pteropoda.
  2. Xác định thành phần hóa học của các mẫu cao chiết thân cây bằng phương pháp LC-MS.
  3. Chiết tách và xác định thành phần hóa học trong tinh dầu thân cây bằng phương pháp GC-MS.
  4. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu cao chiết để lựa chọn phân đoạn tiềm năng phân lập.
  5. Phân lập các hợp chất từ cao chiết thân cây P. pteropoda.

Đối tượng nghiên cứu là thân cây Sài hồ nam (Pluchea pteropoda Hemsl.), được thu hái tại tỉnh Sóc Trăng. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào bộ phận thân cây và cao phân đoạn PPT2-F4 — là phân đoạn 4 thu được từ quá trình phân tách sắc ký cột nhanh (CC-F) từ cao ethyl acetate của mẫu cao thân.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và khái niệm nền tảng

Khóa luận xây dựng trên nền tảng kiến thức về hóa học hợp chất tự nhiên, bao gồm các nhóm chất chính đã biết trong chi Pluchea: terpene (monoterpene, sesquiterpene, diterpene, triterpene), lignan glycoside, caffeoylquinic acid, flavonoid, steroid và dẫn xuất thiophene. Tổng quan tài liệu trình bày chi tiết hơn 185 hợp chất đã được phân lập từ các loài trong chi, kèm cấu trúc hóa học và nguồn tài liệu tham khảo.

Về lý thuyết chống oxy hóa, khóa luận trình bày cơ chế hình thành gốc tự do trong cơ thể, vai trò của chất chống oxy hóa, và nguyên tắc hoạt động của phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). Chỉ số IC50 (nồng độ ức chế 50% gốc tự do) được dùng làm thước đo chính để đánh giá và so sánh hoạt tính chống oxy hóa giữa các mẫu cao chiết và chứng dương.

Phương pháp nghiên cứu

Khóa luận áp dụng tổ hợp nhiều phương pháp thực nghiệm:

  • Định tính sơ bộ thành phần hóa học bằng phản ứng hóa học đặc trưng, thực hiện trên các dịch chiết từ các hệ dung môi khác nhau (hexane, cồn, cồn thủy phân, nước, nước thủy phân).
  • Chiết xuất tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, sau đó phân tích thành phần bằng sắc ký khí — khối phổ (GC-MS) trên cột HP5-MS, so sánh chỉ số lưu giữ (RI) với cơ sở dữ liệu Adams book và NIST Chemistry Webbook.
  • Phân tích thành phần cao chiết bằng sắc ký lỏng — khối phổ (HPLC-MS) ở cả chế độ ion dương và ion âm, theo chương trình pha động đã thiết lập.
  • Điều chế cao phân đoạn: chiết siêu âm để thu cao thô ethanol, chiết lỏng — lỏng để phân tách thành cao n-hexane, cao ethyl acetate, cao n-buthanol và cao nước; sau đó dùng sắc ký cột nhanh (CC-F) phân tách cao ethyl acetate thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau.
  • Khảo sát sắc ký bản mỏng (TLC) với các hệ dung môi: hexane:chloroform (5:5) + 5 giọt formic acid, 100% chloroform, và chloroform:methanol (9:1) + 5 giọt formic acid.
  • Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH, xác định giá trị IC50 qua đường cong % ức chế theo nồng độ.

Nguồn dữ liệu

Nguyên liệu thực vật được thu hái từ tỉnh Sóc Trăng. Hóa chất, thiết bị thực nghiệm được liệt kê chi tiết trong phần phương pháp. Tài liệu tham khảo về chi Pluchea bao gồm các công bố quốc tế và trong nước từ năm 1978 đến năm 2023.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này cung cấp bức tranh toàn diện về cây Sài hồ nam và chi Pluchea. Tác giả trình bày nguồn gốc, phân bố và mô tả thực vật học của P. pteropoda: thân thảo cao 40–60 cm, rất phân nhánh ở gốc, thân hình trụ nhẵn với vỏ ngoài màu đỏ nâu, lá hình bầu dục hoặc hình trứng ngược dài 3–4 cm, rộng 1–2 cm, mùa hoa quả vào tháng 5–7.

Phần kinh nghiệm dân gian tổng hợp tác dụng dược lý của 14 loài trong chi Pluchea qua bảng tra cứu gồm loài, bộ phận dùng và công dụng. Phần thành phần hóa học điểm lại toàn bộ kết quả nghiên cứu đã công bố: riêng với P. pteropoda, nghiên cứu đầu tiên (Đoàn Thanh Tường, 2001) phân lập được 7 hợp chất từ dịch chiết n-hexane, trong đó hợp chất hop-17(21)-en-22-ol-3β-yl acetate là chất mới thuộc nhóm triterpenoid; nghiên cứu GC-MS tiếp theo xác định 29 hợp chất (tổng 90,4%) trong tinh dầu các bộ phận trên mặt đất, với 2,5-dimethoxy-p-cymene (43,5%) là thành phần chính.

Phần tổng quan về chi Pluchea liệt kê chi tiết hơn 185 hợp chất thuộc các nhóm: eudesmane và eudesmanolide sesquiterpene, guaiane sesquiterpene, modhephene, diterpene, triterpene, flavonoid, hợp chất vòng thơm và lignan glycoside, caffeoylquinic acid, steroid và thiophene — mỗi nhóm kèm theo sơ đồ cấu trúc và trích dẫn tài liệu gốc. Phần cuối chương trình bày lý thuyết về gốc tự do, chất chống oxy hóa và phương pháp DPPH.

Chương 2: Phương pháp nghiên cứu

Chương trình bày toàn bộ quy trình thực nghiệm theo sơ đồ khối, từ xử lý nguyên liệu đến phân tích kết quả, bao gồm: quy trình chuẩn bị các dịch chiết định tính, quy trình chiết xuất và khảo sát thành phần tinh dầu bằng GC-MS, điều kiện vận hành thiết bị HPLC-MS (chương trình pha động chi tiết) và GC-MS (cột HP5-MS, so sánh RIE với RIL), phương pháp thử nghiệm DPPH và quy trình điều chế cao phân đoạn cùng khảo sát cao PPT2. Phần xử lý số liệu mô tả cách tính % ức chế và IC50.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương trình bày kết quả của toàn bộ thực nghiệm, bao gồm: kết quả định tính sơ bộ nhóm chức, thành phần tinh dầu thân cây (22 hợp chất xác định bằng GC-MS), kết quả phân tích LC-MS dự đoán 12 hợp chất trong cao thô, hoạt tính chống oxy hóa DPPH của các mẫu cao chiết (bảng % ức chế và giá trị IC50) và kết quả khảo sát cao PPT2 bằng TLC (sắc ký bản mỏng với ba hệ dung môi khác nhau). Chi tiết được trình bày ở mục tiếp theo.

Kết quả và đóng góp

Kết quả định tính sơ bộ

Bằng phản ứng hóa học đặc trưng, tác giả xác định được các nhóm hợp chất có trong thân cây P. pteropoda gồm: carotenoid, tinh dầu, triterpenoid tự do, coumarin, polyphenol, tannin, saponin và acid hữu cơ.

Thành phần tinh dầu (GC-MS)

Phân tích GC-MS xác định được 22 hợp chất trong tinh dầu thân cây. Thành phần chính là L-(+)-ascorbic acid 2,6-dihexadecanoate chiếm 56,16% — một dẫn xuất vitamin C có tiềm năng hoạt tính kháng oxy hóa.

Thành phần cao chiết (HPLC-MS)

Phân tích HPLC-MS (cả chế độ ion dương và âm) dự đoán 12 hợp chất trong cao thô ethanol, thuộc các nhóm: monoterpene, sesquiterpene, caffeoylquinic acid, flavonoid và alcohol. Các hợp chất được dự đoán bao gồm godotol A, 9α-hydroxy-11β,13-dihydrosantamarin, 3,5-di-O-caffeoylquinic acid, 1,4-dicaffeoylquinic acid và 3,4,5-tricaffeoylquinic acid.

Hoạt tính chống oxy hóa (DPPH)

Mẫu IC50 (µg/mL)
Cao phân đoạn 4 (PPT2-F4, ethyl acetate) 15,220
Ascorbic acid (chứng dương) 10,890

Phân đoạn 4 của mẫu cao thân chiết từ ethyl acetate (ký hiệu T24) cho IC50 = 15,220 µg/mL, xấp xỉ với chứng dương ascorbic acid (IC50 = 10,890 µg/mL), chứng tỏ khả năng chống oxy hóa mạnh. Đây là cơ sở để chọn PPT2-F4 là phân đoạn tiềm năng tiến hành phân lập tiếp theo.

Khảo sát cao PPT2 bằng TLC

Sắc ký bản mỏng của cao PPT2-F4 và các cao phân đoạn được triển khai với ba hệ dung môi khác nhau, cho thấy sự phân tách hợp chất trong phân đoạn này.

Đóng góp của nghiên cứu

  • Lần đầu tiên khảo sát riêng biệt thân cây P. pteropoda (tách biệt với các bộ phận trên mặt đất đã nghiên cứu trước), mở rộng phạm vi nghiên cứu về bộ phận của loài này.
  • Lần đầu tiên ứng dụng HPLC-MS để dự đoán thành phần cao chiết thân cây P. pteropoda tại Việt Nam.
  • Xác định hợp chất chính trong tinh dầu thân cây là L-(+)-ascorbic acid 2,6-dihexadecanoate (56,16%) — dẫn xuất vitamin C chưa từng được báo cáo là thành phần chính trong tinh dầu loài này.
  • Cung cấp bằng chứng thực nghiệm về hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết thân cây, góp phần cơ sở khoa học cho các ứng dụng dân gian của loài này.
  • Lựa chọn được phân đoạn PPT2-F4 làm đối tượng phân lập hợp chất có độ phân cực cao hơn so với các nghiên cứu trước.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Phạm vi nghiên cứu chỉ tập trung vào thân cây, chưa khảo sát đồng thời các bộ phận khác như rễ, lá, hoa và quả trên cùng một quy trình so sánh. Phân tích HPLC-MS mới ở mức dự đoán thành phần dựa trên dữ liệu phổ khối, chưa phân lập và định danh đầy đủ từng hợp chất bằng phổ NMR. Hoạt tính chống oxy hóa mới được đánh giá theo phương pháp DPPH; các phương pháp khác như ABTS chưa được thực hiện trong nghiên cứu này.

Hướng tiếp theo mà đề tài đặt ra là phân lập và định danh các hợp chất từ cao phân đoạn PPT2-F4, đặc biệt các hợp chất thuộc nhóm caffeoylquinic acid và flavonoid có độ phân cực cao — vốn chưa được phân lập trong các công bố trước đây về loài này tại Việt Nam.

Giá trị tham khảo

Khóa luận này là tài liệu tham khảo phù hợp cho:

  • Sinh viên và học viên cao học ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học, Hóa dược, Dược học: phần tổng quan tài liệu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Pluchea (hơn 185 hợp chất được tổng hợp có hệ thống) là nguồn tra cứu có giá trị.
  • Người thực hiện đề tài khảo sát dược liệu: phần phương pháp thực nghiệm mô tả chi tiết quy trình định tính sơ bộ thành phần hóa học bằng phản ứng hóa học đặc trưng, quy trình chiết siêu âm, chiết lỏng — lỏng và phân tách bằng sắc ký cột nhanh CC-F.
  • Người làm đề tài phân tích tinh dầu bằng GC-MS hoặc cao chiết bằng HPLC-MS: phần thực nghiệm cung cấp điều kiện vận hành thiết bị và cách đối chiếu chỉ số lưu giữ RI với cơ sở dữ liệu chuẩn.
  • Người nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa: phần đánh giá hoạt tính DPPH (xây dựng đường cong % ức chế và tính IC50) là ví dụ quy trình chuẩn có thể tham khảo.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả chọn thân cây mà không phải lá hay rễ làm đối tượng nghiên cứu? Các nghiên cứu trước tại Việt Nam về P. pteropoda chỉ khảo sát các bộ phận trên mặt đất nói chung và phân lập chất từ cao chiết có độ phân cực thấp. Đề tài chủ động chọn thân cây để khảo sát riêng từng bộ phận và hướng đến phân lập các hợp chất có độ phân cực cao hơn, mở rộng hiểu biết về thành phần hóa học của loài.

2. Hợp chất nào chiếm tỷ lệ cao nhất trong tinh dầu thân cây P. pteropoda và ý nghĩa của nó là gì? L-(+)-ascorbic acid 2,6-dihexadecanoate chiếm 56,16% — đây là dẫn xuất vitamin C. Sự hiện diện với tỷ lệ cao của hợp chất này cho thấy tiềm năng hoạt tính kháng oxy hóa của thân cây Sài hồ nam, phù hợp với kết quả thử nghiệm DPPH trong đề tài.

3. Phân đoạn PPT2-F4 được chuẩn bị như thế nào và tại sao được chọn làm đối tượng phân lập? Cao thô ethanol được điều chế bằng chiết siêu âm, sau đó chiết lỏng — lỏng thu cao ethyl acetate. Cao ethyl acetate tiếp tục được phân tách bằng sắc ký cột nhanh (CC-F) thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau. Phân đoạn 4 (PPT2-F4) được chọn vì cho giá trị IC50 = 15,220 µg/mL trong thử nghiệm DPPH, gần với chứng dương ascorbic acid (IC50 = 10,890 µg/mL), thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất trong các phân đoạn được khảo sát.

4. Phương pháp HPLC-MS đã dự đoán được những nhóm hợp chất nào trong cao chiết thân cây? Phân tích HPLC-MS (cả hai chế độ ion dương và âm) dự đoán 12 hợp chất thuộc các nhóm: monoterpene, sesquiterpene, caffeoylquinic acid (gồm 3,5-di-O-caffeoylquinic acid, 1,4-dicaffeoylquinic acid, 3,4,5-tricaffeoylquinic acid), flavonoid và alcohol. Trong đó godotol A và 9α-hydroxy-11β,13-dihydrosantamarin là các sesquiterpene đã từng được phân lập trong chi Pluchea.

5. Kết quả định tính sơ bộ xác định được những nhóm hợp chất nào trong thân cây P. pteropoda? Bằng phản ứng hóa học đặc trưng trên các dịch chiết từ nhiều hệ dung môi khác nhau, tác giả xác định được sự có mặt của carotenoid, tinh dầu, triterpenoid tự do, coumarin, polyphenol, tannin, saponin và acid hữu cơ trong thân cây.

Kết luận

Khóa luận cung cấp dữ liệu thực nghiệm đầu tiên về thành phần hóa học của riêng thân cây Pluchea pteropoda Hemsl. thu hái tại Sóc Trăng thông qua tổ hợp các phương pháp GC-MS, HPLC-MS, định tính hóa học và sắc ký cột. Kết quả nổi bật là việc xác định L-(+)-ascorbic acid 2,6-dihexadecanoate là thành phần chính trong tinh dầu thân cây (56,16%) và ghi nhận hoạt tính chống oxy hóa đáng kể của cao phân đoạn PPT2-F4 với IC50 = 15,220 µg/mL — tương đương với chứng dương ascorbic acid (IC50 = 10,890 µg/mL). Những kết quả này đặt cơ sở khoa học cho việc phân lập và định danh các hợp chất cụ thể từ phân đoạn tiềm năng này trong các nghiên cứu tiếp theo, đồng thời góp phần giải thích một phần công dụng của cây Sài hồ nam trong y học dân gian.