Khóa luận nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn ethyl acetat từ cây trai lá hoa

Khóa luận nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn ethyl acetat từ cây trai lá hoa, cung cấp thông tin quý giá cho ngành dược liệu.

• Tác giả: Khúc Thị Thúy Hạnh
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Đức Lợi
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn ethyl acetat từ cây trai lá hoa
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về chi Murdannia
• 1.2. Vị trí phân loại của chi Murdannia
• 1.3. Số lượng loài và sự phân bố các loài thuộc chi Murdannia
• 1.4. Đặc điểm thực vật chi Murdannia
• 1.5. Tổng quan về loài Murdannia bracteata
• 1.6. Đặc điểm hình thái loài Murdannia bracteata
• 1.7. Đặc điểm phân bố loài Murdannia bracteata
• 1.8. Thành phần hóa học của loài Murdannia bracteata
• 1.9. Tác dụng sinh học của Murdannia bracteata
• 1.10. Công dụng của Murdannia bracteata theo y học cổ truyền
• 1.11. Sản phẩm có thành phần Murdannia bracteata trên thị trường
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất, trang thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất
• 2.5. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Kết quả chiết xuất, phân lập một số hợp chất
• 3.2. Chiết xuất phân đoạn
• 3.3. Phân lập các hợp chất
• 3.4. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được
• 3.4.1. Hợp chất MB01: Nonadecan-1-ol
• 3.4.2. Hợp chất MB03: β-sitosterol
• 3.4.3. Hợp chất MB10: Acid betulinic
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Hợp chất MB01: Nonadecan-1-ol
• 4.2. Hợp chất MB03: β-sitosterol
• 4.3. Hợp chất MB10: Acid betulinic
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hóa học phân đoạn ethyl acetat từ cây trai lá hoa

Cây trai lá hoa, hay còn gọi là Murdannia bracteata, là một loài thực vật có giá trị dược liệu cao. Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây này, đặc biệt là phân đoạn ethyl acetat, đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Phân đoạn này chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, hứa hẹn mang lại những ứng dụng tiềm năng trong y học. Việc chiết xuất và phân lập các hợp chất từ cây trai lá hoa không chỉ giúp hiểu rõ hơn về thành phần hóa học mà còn mở ra cơ hội phát triển các sản phẩm dược phẩm mới.

1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố của cây trai lá hoa

Cây trai lá hoa thuộc họ Thài lài, có đặc điểm hình thái dễ nhận biết. Loài này phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam và một số nước Đông Nam Á. Đặc điểm sinh trưởng và môi trường sống của cây ảnh hưởng đến thành phần hóa học của nó.

1.2. Tầm quan trọng của ethyl acetat trong nghiên cứu hóa học

Phân đoạn ethyl acetat được sử dụng rộng rãi trong chiết xuất các hợp chất hữu cơ. Nó giúp tách biệt các hợp chất có giá trị từ cây trai lá hoa, từ đó xác định được các hoạt chất tiềm năng cho y học.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu cây trai lá hoa

Mặc dù cây trai lá hoa có nhiều tiềm năng, nhưng việc nghiên cứu thành phần hóa học của nó vẫn gặp nhiều thách thức. Thiếu thông tin về các hợp chất cụ thể và tác dụng sinh học của chúng là một trong những vấn đề lớn. Hơn nữa, việc chiết xuất và phân lập các hợp chất từ cây này cần phải được thực hiện một cách chính xác để đảm bảo chất lượng và hiệu quả.

2.1. Thiếu hụt dữ liệu về thành phần hóa học

Nhiều nghiên cứu trước đây chỉ tập trung vào một số hợp chất nhất định, trong khi các hợp chất khác có thể có hoạt tính sinh học mạnh mẽ vẫn chưa được khám phá.

2.2. Khó khăn trong quy trình chiết xuất và phân lập

Quy trình chiết xuất từ cây trai lá hoa cần được tối ưu hóa để tăng hiệu suất thu hồi các hợp chất có giá trị. Việc lựa chọn dung môi và phương pháp chiết xuất phù hợp là rất quan trọng.

III. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất từ cây trai lá hoa

Để nghiên cứu thành phần hóa học của cây trai lá hoa, các phương pháp chiết xuất và phân lập hiện đại đã được áp dụng. Phương pháp sắc ký cột và sắc ký bản mỏng là những kỹ thuật phổ biến giúp tách biệt các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat. Những phương pháp này không chỉ hiệu quả mà còn đảm bảo tính chính xác trong việc xác định cấu trúc của các hợp chất.

3.1. Quy trình chiết xuất ethyl acetat

Quy trình chiết xuất bắt đầu bằng việc thu hái và chế biến cây trai lá hoa. Sau đó, sử dụng dung môi ethyl acetat để chiết xuất các hợp chất có trong cây, giúp thu được phân đoạn giàu hoạt chất.

3.2. Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất

Sau khi chiết xuất, các hợp chất được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột. Các hợp chất này sau đó được xác định cấu trúc bằng các kỹ thuật như NMR và MS, giúp hiểu rõ hơn về tính chất hóa học của chúng.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của ethyl acetat

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng phân đoạn ethyl acetat từ cây trai lá hoa chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hợp chất này có thể được ứng dụng trong điều trị nhiều bệnh lý khác nhau, từ kháng viêm đến chống ung thư. Kết quả nghiên cứu không chỉ mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc mà còn khẳng định giá trị của cây trai lá hoa trong y học cổ truyền.

4.1. Các hợp chất chính được phân lập từ ethyl acetat

Một số hợp chất như apigenin và quercetin đã được phân lập từ phân đoạn ethyl acetat. Những hợp chất này đã được chứng minh có tác dụng chống oxy hóa và kháng viêm.

4.2. Ứng dụng trong y học cổ truyền và hiện đại

Cây trai lá hoa không chỉ được sử dụng trong y học cổ truyền mà còn có tiềm năng lớn trong y học hiện đại. Các nghiên cứu tiếp theo có thể giúp phát triển các sản phẩm dược phẩm mới từ cây này.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về thành phần hóa học của phân đoạn ethyl acetat từ cây trai lá hoa đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực dược học. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để khám phá thêm nhiều hợp chất mới và đánh giá tác dụng sinh học của chúng. Việc phát triển các sản phẩm từ cây trai lá hoa có thể mang lại lợi ích lớn cho sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc xác định thêm các hợp chất mới và đánh giá tác dụng của chúng trong điều trị bệnh.

5.2. Hướng phát triển sản phẩm từ cây trai lá hoa

Việc phát triển các sản phẩm dược phẩm từ cây trai lá hoa có thể giúp nâng cao giá trị kinh tế và bảo tồn nguồn tài nguyên thực vật quý giá này.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Việt Nam sở hữu nguồn tài nguyên thực vật phong phú nhờ đặc trưng khí hậu nhiệt đới gió mùa và địa hình đa dạng. Theo ước tính được trích dẫn trong công trình, cả nước có trên 12.000 loài thực vật bậc cao (chiếm khoảng 4 - 5% tổng số loài thực vật bậc cao đã biết trên thế giới), trong đó có khoảng 3.850 loài thuộc 309 họ được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền và dân gian. Nhiều loài cây thuốc có tác dụng điều trị rõ rệt trên lâm sàng nhưng chưa được nghiên cứu sáng tỏ về mặt thành phần hóa học cũng như cơ chế tác dụng sinh học. Đồng thời, sự xuất hiện của các bệnh truyền nhiễm mới cùng xu hướng gia tăng, trẻ hóa của các bệnh lý rối loạn chuyển hóa đã đặt ra nhu cầu cấp thiết về việc tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên từ thảo dược nhằm tạo ra nguồn dược phẩm thay thế có chi phí hợp lý và ít tác dụng không mong muốn.

Cây Trai lá hoa (Murdannia bracteata J.Hong), còn có tên gọi dân gian là Cỏ rươi lá bắc hoặc Bao tử, thuộc chi Murdannia, họ Thài lài (Commelinaceae). Chi Murdannia gồm nhiều loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và ôn đới ấm; thành phần hóa học của chi này đa dạng và có sự khác biệt giữa các loài cũng như giữa các vùng địa lý khác nhau. Tại Trung Quốc và Malaysia, cây Trai lá hoa được sử dụng trong y học cổ truyền để chữa bệnh tiêu hóa, cảm lạnh, tiểu đường và ung thư. Tại Việt Nam, cây được dùng theo kinh nghiệm dân gian để điều trị đau dạ dày. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của loài dược liệu này còn rất hạn chế. Để cung cấp dẫn liệu khoa học cho việc phát triển các sản phẩm dược liệu trong tương lai, đề tài tập trung giải quyết 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Chiết xuất, phân lập được một số hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của cây Trai lá hoa (Murdannia bracteata J.Hong).
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được.

Đối tượng nghiên cứu của khóa luận là phần trên mặt đất (lá cây có hoa) của loài Trai lá hoa (Murdannia bracteata J.Hong), được thu hái tại huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định vào tháng 11 năm 2021. Mẫu thực vật đã được giám định tên khoa học chính xác bởi ThS. Nguyễn Thúc Thu Hương, giảng viên Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội (Phiếu giám định số: UMP-082021). Phạm vi nghiên cứu giới hạn ở việc khảo sát thành phần hóa học của phân đoạn dịch chiết ethyl acetat từ lá cây, thực hiện các quy trình thực nghiệm tại Trường Đại học Y Dược (Đại học Quốc gia Hà Nội) và Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) trong giai đoạn 2021 - 2023.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Về cơ sở phân loại học thực vật, khóa luận sử dụng Hệ thống phân loại thực vật hạt kín APG IV (Angiosperm Phylogeny Group IV) để xác định vị trí của đối tượng nghiên cứu: Giới Thực vật (Plantae), Thực vật hạt kín (Angiospermae), Thực vật một lá mầm (Monocots), Bộ Thài Lài (Commelinales), Họ Thài Lài (Commelinaceae), Chi Murdannia, Loài Murdannia bracteata J.Hong. Về mặt hóa thực vật, tác giả tổng quan các nghiên cứu quốc tế và trong nước đã ghi nhận sự có mặt của các nhóm chất chính trong loài như: lignan/lactone (bracteanolid A, B), flavonoid (isovitexin, apigenin, quercetin), phenolic acid (acid (+)-(R)-p-hydroxyphenyllactic, dẫn xuất acid caffeic), galactolipid (dLGG và 6 dẫn xuất khác), cùng các hợp chất steroid, acid amin và acid hữu cơ.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế và triển khai tuần tự theo các bước chuẩn hóa của chuyên ngành Dược học và Hóa thực vật:

• Phương pháp chiết xuất: Sử dụng kỹ thuật ngâm chiết kết hợp hỗ trợ siêu âm ở nhiệt độ 40°C với dung môi ethanol 80% (tỷ lệ dung môi/dược liệu giảm dần: 10:1, 8:1, 6:1 l/kg, mỗi lần chiết 3 giờ). Dịch chiết sau khi gộp và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không tạo thành cao chiết tổng ethanol (ký hiệu MBT). Cao tổng được phân tán vào nước cất và chiết phân bố lỏng - lỏng liên tục với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexan và ethyl acetat (tỷ lệ thể tích 1:1, lặp lại 3 lần cho mỗi dung môi) nhằm thu các cao phân đoạn tương ứng: phân đoạn n-hexan (MBH), phân đoạn ethyl acetat (MBE) và cắn dịch nước (MBW).
• Phương pháp phân tách và làm sạch: Khảo sát và tinh chế cắn phân đoạn ethyl acetat bằng sắc ký cột hấp phụ (Column Chromatography - CC) với chất hấp phụ pha thường là silica gel (Merck) có kích thước hạt 0,063 - 0,200 mm và 0,040 - 0,063 mm, cùng pha đảo RP-18 (0,03 - 0,05 mm). Quá trình rửa giải sử dụng các hệ dung môi gradient có độ phân cực tăng dần: n-hexan - ethyl acetat - methanol (50:1:0,1 đến 1:1:0,1 v/v/v), n-hexan - aceton (30:1 đến 1:1 v/v), dicloromethan - methanol (10:1 v/v). Quá trình phân đoạn được kiểm tra và theo dõi liên tục bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 và RP-18 F254 (Merck, độ dày 0,2 - 0,25 mm, được hoạt hóa ở 110°C trong 1 giờ). Chất thử phát hiện vết sắc ký bao gồm đèn soi tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 365 nm và dung dịch acid sulfuric (H2SO4) 10% trong ethanol 96% có hơ nóng.
• Phương pháp xác định cấu trúc: Tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của tinh thể trên máy SMP10 BioCote; ghi phổ khối lượng ion hóa phun điện tử (ESI-MS); ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân gồm phổ proton (1H-NMR), phổ cacbon (13C-NMR) và phổ DEPT trên thiết bị Bruker AVANCE 500 MHz / 600 MHz. Dữ liệu phổ thực nghiệm được phân tích dịch chuyển hóa học (δ, ppm), hình dạng vạch phổ, hằng số tương tác spin-spin (J, Hz) và so sánh trực tiếp với các tài liệu chuẩn quốc tế đã công bố.

Nguồn dữ liệu của nghiên cứu là dữ liệu thực nghiệm sơ cấp thu được từ quá trình xử lý 5 kg mẫu dược liệu khô tại phòng thí nghiệm, kết hợp dữ liệu phổ đối chiếu thứ cấp từ các tạp chí hóa học và dược học chuyên ngành.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa toàn diện các thông tin về chi Murdannia và loài Murdannia bracteata. Trên phạm vi toàn cầu, chi Murdannia có khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới châu Á (>50%), châu Phi (11 loài), Ấn Độ (29 loài) và châu Mỹ (6 loài). Tại Việt Nam, tác giả tổng hợp được 16 loài thuộc chi này, trong đó 7 loài được dùng làm thuốc. Phân bố địa lý của loài Murdannia bracteata trải dài từ các tỉnh phía Bắc (Ninh Bình, Nam Định) đến Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, tại các vùng đất ẩm ven đường, bờ kênh rạch, ven rừng.

Về đặc điểm thực vật, loài là cây thân thảo sống lâu năm, rễ sợi đường kính 0,15 - 0,4 mm; thân hình trụ có khía dọc, phân đốt dài 3 - 10 cm, phủ lông trắng dày đặc. Lá đơn, mọc so le, bẹ lá dài 0,7 - 1,3 cm màu xanh nhạt có lông trắng, phiến lá hình dải hoặc hình mác thuôn, đầu nhọn. Cụm hoa mọc ở nách lá hoặc ngọn; hoa lưỡng tính đều, cuống dài màu xanh nhẵn, tràng 3 cánh rời màu tím; 3 nhị hữu thụ mang lông tím dài ở chân chỉ nhị và 3 nhị bất thụ hình sợi mang bao phấn 3 thùy; mùa hoa kéo dài từ tháng 5 đến tháng 11.

Tổng quan hóa thực vật ghi nhận các công bố nổi bật: Wang Guei Jane và cs. (2006) phân lập 4 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat; Yam Mun Fei và cs. (2009) xác định hàm lượng phenolic tổng khoảng 10%; Ooi Kheng Leong và cs. (2014) tìm ra 15 chất bay hơi qua GC-MS và 2 dẫn xuất phenolic qua UPLC; Shyur Lie Fen và cs. (2019) xác định 7 monogalatosyldiacylglycerol với dLGG chiếm 78,9%; tại Việt Nam, Lê Phương Thảo (2019) phân lập apigenin và quercetin, Đỗ Thị Thanh Hương (2021) phân lập 3 hợp chất gồm acid 2-hydroxyl-3-phenylpropanoic, acid 3-amino butanoic và acid dihydrophaseic glucopyranosid. Về dược lý, cây thể hiện hoạt tính kháng Helicobacter pylori (ức chế 8/10 chủng), bảo vệ gan trước tổn thương do CCl4 hoặc LPS/D-GalN (làm giảm men gan AST, ALT và MDA), gây độc tế bào ung thư biểu mô gan HepG2 (EC50 = 37,17 μg/mL), ức chế enzym α-glucosidase (EC50 = 117,04 μg/mL), ức chế chọn lọc enzym iNOS/sinh tổng hợp NO và giãn mạch trên động mạch chủ chuột. Trên thị trường, cây Trai lá hoa đã được ứng dụng trong sản phẩm trà Rumput Beijing Tea sản xuất tại Trung Quốc.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này trình bày chi tiết điều kiện thực nghiệm, xuất xứ mẫu dược liệu (thu hái tại Trực Ninh, Nam Định tháng 11/2021, mã số UMP-082021) và quy chuẩn trang thiết bị, hóa chất phục vụ nghiên cứu. Tác giả mô tả chi tiết quy trình chiết xuất từ 5 kg dược liệu khô xay nhỏ: ngâm chiết với dung môi ethanol 80% qua 3 lần chiết tương ứng các tỷ lệ 10:1, 8:1 và 6:1 (l/kg) có hỗ trợ siêu âm tại 40°C trong 30 phút, lọc gộp dịch chiết và cất thu hồi dung môi áp suất giảm, thu được 450,1 g cao cắn tổng ethanol (MBT).

Quy trình chiết phân đoạn lỏng - lỏng được tiến hành từ 440 g cao tổng phân tán đều trong 1,5 lít nước cất, lần lượt chiết phân đoạn 3 lần với n-hexan (tỷ lệ 1:1, v/v) và 3 lần với ethyl acetat (tỷ lệ 1:1, v/v). Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm, lượng cắn phân đoạn thu được gồm: cao n-hexan (MBH, 85,6 g), cao ethyl acetat (MBE, 158,3 g) và cắn nước (MBW, 193,1 g). Phần cắn MBE được lựa chọn để tiến hành sắc ký cột hấp phụ. Hệ thống quy trình sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo được trình bày cụ thể cùng phương pháp phân tích phổ 1D-NMR, phổ khối ESI-MS và đo điểm nóng chảy để phục vụ nhận danh cấu trúc hóa học.

Chương 3: Kết quả

Chương 3 công bố kết quả thực nghiệm chiết xuất, phân lập và cấu trúc hóa học của các chất sạch. Quá trình sắc ký cột silica gel từ cắn ethyl acetat (MBE) với hệ gradient n-hexan - EtOAc - MeOH (từ 50:1:0,1 đến 1:1:0,1) và 100% MeOH đã thu được 7 phân đoạn chính (ký hiệu D1 đến D7).

Từ phân đoạn D1, tiến hành sắc ký cột với hệ n-hexan - aceton (30:1 đến 10:1 v/v) thu được phân đoạn D1.1. Kết tủa phân đoạn D1.1 bằng aceton, lọc và rửa sạch nhiều lần bằng aceton thu được hợp chất MB01 (35 mg). Đồng thời, từ phân đoạn D1 cũng đã phân lập được hợp chất MB03 (25 mg). Từ phân đoạn D3, triển khai sắc ký cột với hệ n-hexan - aceton (5:1 đến 1:1 v/v) thu được phân đoạn phụ D3.3; tiếp tục sắc ký tinh chế D3.3 bằng hệ dicloromethan - methanol (10:1 v/v) thu được hợp chất MB10 (16 mg).

Dữ liệu nhận danh cấu trúc của 3 hợp chất:

• Hợp chất MB01 (Nonadecan-1-ol): Thu được dưới dạng chất rắn màu trắng, khó tan trong các dung môi thông thường như chloroform, ethyl acetat, methanol và aceton. Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử tại m/z 285,3 [M+H]+, phù hợp với công thức phân tử C19H40O. Phổ 1H-NMR khẳng định các tín hiệu đặc trưng của ancol no mạch thẳng kéo dài.
• Hợp chất MB03 (β-sitosterol): Thu được dưới dạng chất rắn màu trắng, tan tốt trong chloroform, không hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 254 và 365 nm, tạo màu đặc trưng với thuốc thử H2SO4 10%/ethanol khi hơ nóng. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR với chất chuẩn tham khảo đã xác định hợp chất là phytosterol β-sitosterol.
• Hợp chất MB10 (Acid betulinic): Tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 316 - 318°C, không hấp thụ UV, hiện màu tím với thuốc thử H2SO4 10%/ethanol có hơ nóng. Phổ 13C-NMR và DEPT thể hiện 30 tín hiệu carbon, đặc trưng cho khung lupan triterpenoid: 2 carbon olefin lai hóa sp2 ở C-20 (150,4 ppm) và C-29 (109,7 ppm); 1 carbon mang nhóm hydroxy C-3 (79,0 ppm); 1 carbon carbonyl của nhóm acid carboxylic C-28 (179,5 ppm); 6 nhóm methyl, 10 nhóm methylen, 5 nhóm methin và 5 carbon bậc 4. Dữ liệu phổ hoàn toàn trùng khớp với tài liệu tham khảo về acid betulinic.

Chương 4: Bàn luận

Tác giả thảo luận về ý nghĩa sinh học và phân bố tự nhiên của 3 hợp chất đã được phân lập:

• Nonadecan-1-ol (MB01): Là một ancol béo no chuỗi dài từng được phân lập từ Crataegus monogyna, Euphorbia piscatoria. Tác giả dẫn chứng nghiên cứu của Alessandro Masolo và cs. (2009) về vai trò chất đánh dấu sinh dục trong tuyến tiết của loài Hystrix cristata, cùng nghiên cứu của Southmendranath Chatterjee và cs. (2018) chứng minh nonadecan-1-ol có vòng ức chế lớn nhất trong số các hợp chất thử nghiệm đối kháng vi khuẩn gây bệnh Salmonella gallinarum.
• β-sitosterol (MB03): Là phytosterol phổ biến cấu thành màng tế bào thực vật. Chương bàn luận điểm lại các minh chứng dược lý: cải thiện triệu chứng đường tiết niệu trong u phì đại lành tính tuyến tiền liệt (Wilt và cs., 1999); ức chế phình động mạch nội sọ qua trung gian TNF-α (Yang và cs., 2019); hoạt tính giải lo âu và hiệp đồng tác dụng với thuốc chống trầm cảm fluoxetin trên mô hình chuột (Panayotis và cs., 2021); thúc đẩy biệt hóa tạo xương (Nguyễn Thị Thanh Huyền và cs., 2022); và ức chế phản ứng viêm trong mô hình hen suyễn do ovalbumin (Wang và cs., 2022).
• Acid betulinic (MB10): Là triterpenoid khung lupan có hoạt tính kháng ung thư nổi bật. Tác giả đi sâu phân tích cơ chế gây chết tế bào ung thư bàng quang (dòng T-24, UMUC-3, 5637) theo nghiên cứu của So Young Kim và cs. (2021): làm giảm các chất điều hòa chu kỳ tế bào (cyclin B1, cyclin A, Cdk2, Cdc2, Cdc25c), tăng biểu hiện protein Bax và PARP phân cắt, kích hoạt caspase 3, 8, 9 theo cơ chế không phụ thuộc gốc oxy hóa tự do (ROS), đồng thời ức chế sự di căn. Tác nhân này còn được ghi nhận hiệu quả ức chế tế bào ung thư đại trực tràng, buồng trứng, biểu mô thận, đường mật và u thần kinh ngoại bì thông qua việc tác động trực tiếp lên ty thể.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã chiết xuất và phân bố phân đoạn thành công 440 g cao tổng ethanol từ 5 kg lá Trai lá hoa khô, phân lập và nhận diện đầy đủ cấu trúc hóa học của 3 hợp chất sạch từ phân đoạn ethyl acetat.

Phân đoạn chiết xuất	Dung môi chiết phân bố	Khối lượng cắn thu được (g)	Tỷ lệ so với cao tổng đưa vào chiết (%)
Phân đoạn n-hexan (MBH)	n-hexan	85,6	19,45
Phân đoạn ethyl acetat (MBE)	Ethyl acetat	158,3	35,98
Cắn dịch nước (MBW)	Nước cất	193,1	43,89

Từ 158,3 g cao phân đoạn ethyl acetat, 3 hợp chất nguyên chất đã được tinh chế và xác định cấu trúc:

Ký hiệu	Tên hợp chất	Cảm quan / Tính chất vật lý	Khối lượng phân lập (mg)	Nhóm cấu trúc / Công thức phân tử
MB01	Nonadecan-1-ol	Chất rắn màu trắng, khó tan trong CHCl3, EtOAc, MeOH, aceton	35	Ancol béo no mạch thẳng (C19H40O)
MB03	β-sitosterol	Chất rắn màu trắng, tan trong CHCl3, hiện màu với H2SO4/EtOH hơ nóng	25	Phytosterol khung stigmastan (C29H50O)
MB10	Acid betulinic	Tinh thể hình kim màu trắng, đnc: 316 - 318°C, hiện màu tím với H2SO4/EtOH	16	Pentacyclic triterpenoid khung lupan (C30H48O3)

Đóng góp khoa học cốt lõi của khóa luận là việc lần đầu tiên phát hiện, phân lập và công bố sự hiện diện của cả 3 hợp chất nonadecan-1-ol, β-sitosterol và acid betulinic trong lá cây Trai lá hoa (Murdannia bracteata J.Hong). Kết quả này bổ sung những dẫn liệu hóa thực vật quan trọng cho chi Murdannia tại Việt Nam, đồng thời tạo cơ sở khoa học giải thích cho các tác dụng sinh học theo kinh nghiệm dân gian (chữa viêm, bảo vệ gan, hỗ trợ điều trị ung thư) của loài thảo dược này.

Về mặt giải pháp và đề xuất ứng dụng, tác giả kiến nghị tiếp tục tận dụng các phân đoạn sắc ký chưa xử lý hết để chiết tách thêm các thành phần hóa học khác từ phân đoạn ethyl acetat, đồng thời đẩy mạnh các thử nghiệm sinh học in vitro và in vivo nhằm đánh giá hoạt tính chống viêm, kháng khuẩn và giảm đau của các phân đoạn dịch chiết cũng như các hợp chất tinh khiết thu được.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận phản ánh một số hạn chế gắn liền với phạm vi và điều kiện thực nghiệm:

• Phạm vi khảo sát hóa thực vật mới chỉ thực hiện trên phân đoạn ethyl acetat của lá cây thu hái tại một địa phương duy nhất (Trực Ninh, Nam Định) vào một thời điểm nhất định trong năm (tháng 11/2021); chưa khảo sát các phân đoạn phân cực khác (như n-hexan, nước) cũng như các bộ phận thực vật khác của cây (thân, rễ).
• Chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính dược lý thực nghiệm (in vitro/in vivo) trực tiếp trên các hợp chất tinh khiết thu được để chứng minh hoạt tính chống viêm, giảm đau, kháng khuẩn trên mẫu nghiên cứu tại Việt Nam do giới hạn thời gian thực hiện của chương trình khóa luận dược sĩ đại học.

Các hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất từ văn bản:

• Tiếp tục nghiên cứu chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất hóa học còn lại trong các phân đoạn sắc ký D2, D4, D5, D6, D7 của phân đoạn ethyl acetat từ lá cây Trai lá hoa.
• Thiết kế các thử nghiệm sinh học nhằm sàng lọc và đánh giá tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, giảm đau của các phân đoạn dịch chiết và các hợp chất phân lập từ cây Trai lá hoa.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Dược học, Dược liệu - Dược học cổ truyền và Hóa học các hợp chất thiên nhiên:

• Tham khảo về phương pháp luận thực nghiệm: Cung cấp quy trình chi tiết về việc chiết xuất phân đoạn lỏng - lỏng phân bố, kỹ thuật phân tách sắc ký cột hấp phụ pha thường sử dụng các hệ dung môi rửa giải n-hexan - ethyl acetat - methanol, n-hexan - aceton và dicloromethan - methanol đối với các phân đoạn giàu triterpenoid và sterol.
• Tham khảo về dữ liệu phổ học: Cung cấp bộ thông số phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và khối phổ ESI-MS thực nghiệm chi tiết của nonadecan-1-ol, β-sitosterol và acid betulinic được đo trên các thiết bị hiện đại (Bruker AVANCE 500 MHz / 600 MHz), làm tài liệu tham khảo đối chiếu cho các nghiên cứu phân lập hợp chất tự nhiên tương tự.
• Tham khảo về tra cứu dược liệu: Cung cấp danh lục phân loại học chi Murdannia, đặc điểm hình thái chi tiết và tổng hợp tài liệu quốc tế về thành phần hóa học cùng hoạt tính sinh học của loài Murdannia bracteata.

Câu hỏi thường gặp

1. Nguồn mẫu thực vật Trai lá hoa được thu hái ở đâu và định danh khoa học như thế nào? Mẫu cây Trai lá hoa có hoa được thu hái tại huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định vào tháng 11 năm 2021. Mẫu đã được ThS. Nguyễn Thúc Thu Hương, giảng viên Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội giám định tên khoa học là Murdannia bracteata J.Hong (theo hệ thống phân loại APG IV), lưu trữ với Phiếu giám định số UMP-082021.

2. Quy trình chiết phân đoạn từ cao tổng ethanol thu được các phân đoạn nào và khối lượng ra sao? Từ 5 kg dược liệu khô chiết với ethanol 80% thu được 450,1 g cao tổng (MBT). Phân tán 440 g cao tổng trong 1,5 lít nước cất rồi chiết lỏng - lỏng phân đoạn thu được: 85,6 g cao phân đoạn n-hexan (MBH), 158,3 g cao phân đoạn ethyl acetat (MBE) và 193,1 g cắn dịch nước (MBW).

3. Khóa luận đã phân lập được những hợp chất sạch nào từ phân đoạn ethyl acetat và hàm lượng là bao nhiêu? Bằng phương pháp sắc ký cột silica gel kết hợp rửa tủa và kết tinh, tác giả đã phân lập được 3 hợp chất tinh khiết gồm: hợp chất MB01 (nonadecan-1-ol, khối lượng 35 mg), hợp chất MB03 (β-sitosterol, khối lượng 25 mg) và hợp chất MB10 (acid betulinic, khối lượng 16 mg).

4. Căn cứ phổ học nào chứng minh hợp chất MB10 là acid betulinic? Hợp chất MB10 có dạng tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 316 - 318°C. Phổ 13C-NMR và DEPT xuất hiện 30 tín hiệu carbon đặc trưng của triterpenoid khung lupan: 2 carbon olefin lai hóa sp2 ở C-20 (150,4 ppm) và C-29 (109,7 ppm); 1 carbon methin mang oxy ở C-3 (79,0 ppm); 1 carbon carbonyl của nhóm acid carboxylic ở C-28 (179,5 ppm); cùng 6 nhóm methyl, 10 nhóm methylen, 5 nhóm methin và 5 carbon bậc 4, hoàn toàn trùng khớp với dữ liệu phổ chuẩn của acid betulinic.

5. Đóng góp phát hiện mới của khóa luận đối với đối tượng cây Trai lá hoa là gì? Khóa luận là công trình đầu tiên công bố việc phân lập và nhận diện thành công 3 hợp chất nonadecan-1-ol, β-sitosterol và acid betulinic từ lá của cây Trai lá hoa (Murdannia bracteata J.Hong), bổ sung dữ liệu hóa thực vật mới cho loài này tại Việt Nam.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Khúc Thị Thúy Hạnh đã thực hiện thành công quy trình chiết xuất phân đoạn và phân tách sắc ký từ phân đoạn ethyl acetat của lá cây Trai lá hoa (Murdannia bracteata J.Hong) thu hái tại Nam Định. Công trình đã phân lập và xác định chính xác cấu trúc hóa học của 3 hợp chất tinh khiết gồm nonadecan-1-ol (35 mg), β-sitosterol (25 mg) và acid betulinic (16 mg) dựa trên dữ liệu nhiệt độ nóng chảy, khối phổ ESI-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D-NMR. Đây là lần đầu tiên cả 3 hợp chất này được ghi nhận hiện diện trong lá cây Trai lá hoa, cung cấp cơ sở khoa học thực nghiệm có giá trị cho việc tiếp tục nghiên cứu dược lý và phát triển các sản phẩm dược liệu từ nguồn tài nguyên thực vật bản địa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về chi Murdannia 1. Vị trí phân loại của chi Murdannia Vị trí phân loại của chi Murdannia theo hệ thống phân loại thực vật có hoa APG IV (Hệ thống phân loại thực vật hạt kín - Angiosperm Phylogeny Group) [3] như sau: Giới Thực vật (Plantae) Thực vật hạt kín (Angiospermae) Thực vật một lá mầm (Monocots) Bộ Thài Lài (Commelinales) Họ Thài Lài (Commelinaceae) Chi Murdannia 1. Số lượng loài và sự phân bố các loài thuộc chi Murdannia Chi Murdannia thuộc họ Commelinaceae, là một trong những chi lớn nhất gồm khoảng 60 loài được phân bố rộng khắp thế giới, tập trung chủ yếu ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới ấm thuộc Châu Á, Châu Phi, Trung và Nam Mỹ, đặc biệt là Châu Á với hơn 50% số lượng loài [1,4].

Châu Phi có 11 loài [5], Ấn Độ có 29 loài [6], Trung và Nam Mỹ có 6 loài [1]. Ở Việt Nam, chi Murdannia gồm 16 loài, trong đó, 7 loài được sử dụng làm thuốc là: M. Phân bố các loài thuộc chi Murdannia ở nước ta được thể hiện trong Bảng 1. Phân bố các loài thuộc chi Murdannia ở Việt Nam Loài Phân bố Các tỉnh phía Bắc (Ninh Bình, Nam Murdannia bracteata J.Morton ex Định,…) đến Thừa Thiên - Huế, D.

Hong Quảng Nam, Đà Nẵng. Murdannia medica (Lour.) Thừa Thiên - Huế, Khánh Hòa, Lâm D.Hong Đồng, Đồng Nai. Murdannia semiteres (Dalz.) Phan Rang Santapau Murdannia triquetra (Wall.) Bà Rịa - Vũng Tàu, TP. Hồ Chí Bruckner Minh.

Murdannia japonica (Thurnb.) Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình, Faden Đồng Nai. Lâm Đồng, Phú Yên, Ninh Thuận, Murdannia edulis (Stokes) Faden Bình Phước, TP. Hồ Chí Minh. Murdannia gigantea (Vahl.

Bruckner Murdannia divergens (C.Clarke) Từ Lâm Đồng đến các tỉnh Nam Bộ. Bruckner Murdannia keisak (Hassk.) Handel- Hoàng Liên Sơn, Phú Yên, Khánh Mazz Hòa. Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Hà Nội, Hà Nam, Nghệ An, Quảng Murdannia nudiflora (L.) Brenan Trị, Thừa Thiên- Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Lâm Đồng, Khánh Hòa, TP. Hồ Chí Minh.

Khánh Hòa, Ninh Thuận, Lâm Murdannia simplex (Vahl. Murdannia spectabilis (Kurz) Faden Từ Huế đến Đà Lạt, Đồng Nai.) Bruckner Quảng Nam, Thừa Thiên - Huế. Thảo nguyên trên vùng cát: Huế, Đà Murdannia vaginata (L.) Bruckner Nẵng, Nha Trang, Biên Hòa, Vũng Tàu, Phú Quốc. Murdannia vescicolor (Dalz.) Ruộng, dựa lộ, bình nguyên.

Đặc điểm thực vật chi Murdannia Chi Murdannia, họ Thài lài (Commelinaceae): Cây thân thảo mọc đứng hoặc mọc bò. Rễ thường phình lên ở giữa. Lá mọc cách hoặc mọc vòng ở gốc. Cụm hoa hình chùm xim, mọc ở ngọn hoặc nách lá, có cuống rõ và được bao bọc trong các lá bắc.

Ở mỗi lá bắc có 2 - 5 xim hoa. Hoa lưỡng tính, thường có vòi nhụy lệch về 1 phía so với trục hoa. Cánh hoa rời, màu tím, xanh dương, hồng, vàng hoặc hơi trắng, hình tròn hoặc hình trứng. 3 nhị sinh sản đối diện các lá đài, 3 nhị lép đối diện các cánh hoa.

Quả hình trứng, hình nang hoặc hình cầu, mở thành 3 ô. Mỗi ô có 1 hoặc 2 hạt, rốn hạt tròn. Dưới đây là hình ảnh một số loài Murdannia tìm thấy ở Việt Nam 5 Hình 1.1 Đặc điểm thực vật một số loài thuộc chi Murdannia ở Việt Nam 6 Các loài thuộc chi Murdannia có đặc điểm thực vật tương đối giống nhau. Vì vậy, khi phân tích cần chọn cây có cơ bản đầy đủ các bộ phận, đặc biệt là hoa - bộ phận ít bị thay đổi bởi điều kiện tự nhiên và khá đặc trưng cho loài.

Hoa của các loài thuộc chi Murdannia có thể khác nhau về màu sắc, hình dạng tràng hoa, kích thước nhị, nhụy hoa (Hình 1.2 Hoa của một số loài thuộc chi Murdannia 1. Tổng quan về loài Murdannia bracteata - Tên khoa học: Murdannia bracteata J.Hong, họ Thài lài (Commelinaceae).