Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong hệ thống thực vật học và y học cổ truyền, các loài thực vật thuộc chi Phyllanthus (họ Thầu dầu - Euphorbiaceae) giữ một vị trí quan trọng với hơn 700 loài trên thế giới và khoảng 44 loài được ghi nhận tại Việt Nam. Nhiều loài trong chi này đã được chứng minh có giá trị dược liệu cao, tiêu biểu như Phyllanthus amarus Schum. et Thonn. (Diệp hạ châu đắng/ngọt) hay Phyllanthus reticulatus Poir. (Phèn đen), thường được ứng dụng trong điều trị các bệnh lý về gan, thận và đái tháo đường. Cùng thuộc chi này, cây Me rừng (Phyllanthus emblica L., tên gọi khác: chùm ruột núi, du cam tử, ngưu cam tử) là loài cây mọc hoang phổ biến tại các vùng khí hậu nhiệt đới như Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc. Tại Việt Nam, me rừng phân bố tập trung ở các vùng rừng thưa, đồi trọc, bãi hoang, đặc biệt là khu vực vùng núi Tây Bắc và Việt Bắc.

Theo kinh nghiệm y học dân gian, các bộ phận của cây me rừng được sử dụng trong nhiều bài thuốc chữa cảm mạo, phát sốt, ho, đau cổ họng, khô khát miệng, viêm ruột, tiêu chảy và cao huyết áp. Tại Ấn Độ, quả, rễ, thân và lá me rừng được khai thác rộng rãi để hỗ trợ chức năng gan, hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, hệ bài tiết và tăng cường miễn dịch. Tuy nhiên, qua tổng quan tài liệu khoa học, phần lớn các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước trước đây chủ yếu tập trung vào các bộ phận quả, rễ và thân cây. Các nghiên cứu chuyên sâu về thành phần hóa học của lá me rừng còn rất hạn chế, và tại thời điểm thực hiện đề tài, lá cây me rừng sinh trưởng tại Việt Nam chưa từng được khảo sát thành phần hóa học.

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Ngô Hồng Hoài Nam, dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh (tháng 5/2016), được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu này.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu:

  1. Điều chế các phân đoạn cao chiết hữu cơ (cao thô ethanol, cao phân đoạn hexane, cao phân đoạn ethyl acetate) từ mẫu lá cây me rừng (Phyllanthus emblica L.).
  2. Sử dụng các kỹ thuật sắc ký cột cổ điển và sắc ký pha đảo để cô lập các hợp chất tinh khiết từ các phân đoạn cao chiết.
  3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được thông qua các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR: $^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$) và hai chiều (2D-NMR: HSQC, HMBC), kết hợp so sánh với các tài liệu tham khảo đã công bố.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Thành phần hóa học trong lá cây me rừng (Phyllanthus emblica L., họ Euphorbiaceae).
  • Phạm vi không gian và thời gian: Mẫu lá me rừng được thu hái tại tỉnh Bình Thuận vào tháng 5 năm 2014, được giám định và xác nhận tên khoa học bởi TS. Phạm Văn Ngọt. Quá trình thực nghiệm chiết tách và phân lập được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh. Các dữ liệu phổ nghiệm NMR được đo đạc tại Phòng Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TP. Hồ Chí Minh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và tổng quan hóa thực vật

Khóa luận tổng hợp các tài liệu khoa học về đặc điểm thực vật học, tác dụng dược lý và thành phần hóa học đã được công bố trên thế giới của loài Phyllanthus emblica L.:

  • Dược tính và hoạt tính sinh học: Tổng quan các thử nghiệm in vitro và in vivo chứng minh cây me rừng có hoạt tính gây độc tế bào ung thư (dòng tế bào ung thư vú MCF-7, ung thư phổi HELF của geraniin và isocorilagin với giá trị $\text{IC}{50}$ thấp); khả năng kháng oxy hóa cao ($\text{IC}{50}$ DPPH của geraniin đạt $4{,}7\ \mu\text{M}$); khả năng ức chế virus Herpes simplex loại 1 và loại 2 (HSV-1, HSV-2) của hợp chất $1,2,4,6\text{-tetra-}O\text{-galloyl-}\beta\text{-D-glucose}$; tác dụng phục hồi chức năng và hạ men gan ở chuột với liều $75\ \text{mg/kg/ngày}$; cùng tác dụng phục hồi tổn thương tinh hoàn do acid valproic gây ra.
  • Thành phần hóa học đã biết: Văn bản hệ thống hóa 74 hợp chất tiêu biểu đã từng được phân lập từ các bộ phận khác nhau của cây me rừng trên thế giới, bao gồm các dẫn xuất cytokinin (zeatin, zeatin riboside), acid phenolic và tannin thủy phân (chebulic acid, chebulinic acid, corilagin, gallic acid, ethyl gallate, ellagic acid, phyllaemblicin A-D, phyllanemblinin A-F), flavonoid (rutin, quercetin, kaempferol và các dẫn xuất glycoside), sesquiterpenoid, triterpenoid và phytosterol ($\beta\text{-sitosterol}$, daucosterol, $5\alpha,6\beta,7\alpha\text{-trihydroxysitosterol}$, $7\alpha\text{-acetoxysitosterol}$).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quá trình nghiên cứu thực nghiệm hóa học được triển khai theo quy trình chuẩn của hóa học các hợp chất thiên nhiên:

  1. Phương pháp chiết xuất:

    • Sử dụng phương pháp ngâm dầm bột dược liệu khô trong dung môi ethanol $96^\circ$ ở nhiệt độ phòng.
    • Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không để thu cao tổng ethanol.
    • Chiết phân bố lỏng - lỏng phân đoạn giữa dịch chiết phân tán trong nước với các dung môi có độ phân cực tăng dần: $n\text{-hexane}$ và ethyl acetate, thu về các cao phân đoạn tương ứng.

  2. Phương pháp phân lập và tinh chế:

    • Sắc ký cột cổ điển (CC): Sử dụng chất hấp phụ silica gel pha thường (Merck cỡ hạt $0{,}06\ \text{mm}$ và Ấn Độ cỡ hạt $0{,}063\ \text{mm}$) và sắc ký cột pha đảo RP-18 (Merck).
    • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel $60\ \text{F}{254}$ và pha đảo $\text{RP-18}\ \text{F}{254}$ (Merck) nhằm theo dõi sự phân tách của các phân đoạn.
    • Hệ dung môi rửa giải: Sử dụng các hệ đơn hoặc đa cấu tử với độ phân cực tăng dần gồm $n\text{-hexane}\ (\text{H})$, dichloromethane $(\text{DCM})$, chloroform $(\text{C})$, ethyl acetate $(\text{EA})$, acetone $(\text{Ac})$, methanol $(\text{Me})$ và nước cất.
    • Phương pháp phát hiện vết sắc ký: Soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại ở bước sóng $\lambda = 254\ \text{nm}$ và hiện màu bằng dung dịch thuốc thử acid sulfuric $(\text{H}_2\text{SO}_4)\ 20%$ trong nước, sau đó gia nhiệt nhẹ.

  3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:

    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ($^{1}\text{H-NMR}$) đo ở tần số $500\ \text{MHz}$.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 ($^{13}\text{C-NMR}$) đo ở tần số $125\ \text{MHz}$.
    • Các phổ tương tác hai chiều gồm phổ tương quan dị hạt nhân qua một liên kết ($\text{HSQC}$) và phổ tương quan dị hạt nhân qua nhiều liên kết ($\text{HMBC}$).
    • Dung môi đo phổ: acetone-$d_6$, $\text{DMSO-}d_6$, và $\text{CDCl}_3$ trên thiết bị Bruker Avance.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương này tập trung trình bày hệ thống lý thuyết nền tảng và lịch sử nghiên cứu về cây me rừng (Phyllanthus emblica L.):

  • Đặc điểm thực vật học: Mô tả hình thái học chi tiết (cây thân gỗ nhỏ cao khoảng $3\ \text{m}$, cành non mềm dài $20\ \text{cm}$ có lông; lá kép lông chim với lá chét nhỏ xếp hai dãy; cụm hoa xim co đơn tính cùng gốc ở nách lá; quả thịt hình cầu mọng, hạt 3 cạnh màu hồng nhạt) và vùng phân bố sinh thái.
  • Dược tính học: Phân tích giá trị sử dụng trong y học dân gian (hàm lượng vitamin C trong quả cao gấp 20 lần quả cam) và tổng kết các kết quả thử nghiệm dược lý hiện đại (kháng tế bào ung thư, kháng oxy hóa, kháng virus HSV-1/2, hạ men gan và phục hồi chức năng tinh hoàn).
  • Thành phần hóa học: Trình bày chi tiết công thức cấu tạo, tên gọi và nguồn gốc phân lập của 74 hợp chất từ rễ, thân, vỏ quả và cành lá cây me rừng theo các tài liệu công bố từ trước năm 1998 đến năm 2013.

Chương 2: Thực nghiệm

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình xử lý mẫu, điều chế các phân đoạn cao và các bước phân tách sắc ký để cô lập hợp chất:

  • Xử lý nguyên liệu và chiết cao: $7{,}2\ \text{kg}$ bột lá me rừng khô được ngâm dầm với ethanol $96^\circ$, cô quay thu được $285{,}5\ \text{g}$ cao ethanol thô. Tiến hành chiết phân bố lỏng - lỏng thu được $22{,}1\ \text{g}$ cao hexane, $143{,}1\ \text{g}$ cao ethyl acetate và $77{,}6\ \text{g}$ phần cao còn lại.
Bột lá me rừng khô (7,2 kg)
Cao ethanol thô (285,5 g)
Cao hexane (22,1 g)         Cao ethyl acetate (143,1 g)       Cao còn lại (77,6 g)

  • Cô lập hợp chất từ cao hexane:

    • $22{,}1\ \text{g}$ cao hexane được sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi $\text{H:EA}$ ($0 \rightarrow 100%\ \text{EA}$) và $\text{EA:Me}$ ($0 \rightarrow 100%\ \text{Me}$), thu được 6 phân đoạn chính ($\text{H1} \rightarrow \text{H6}$).
    • Phân đoạn $\text{H5}$ ($0{,}94\ \text{g}$) được tách tiếp bằng sắc ký cột với hệ $\text{DCM:Me}$ ($4 \rightarrow 100%\ \text{Me}$), thu được 3 phân đoạn phụ ($\text{H5.1} \rightarrow \text{H5.3}$). Phân đoạn $\text{H5.2}$ ($78{,}9\ \text{mg}$) sắc ký lặp lại nhiều lần bằng hệ dung môi $\text{C:EA:Ac:Me}$ ($8:0{,}8:0{,}2:0{,}2$) cô lập được hợp chất PEA-N3 ($7\ \text{mg}$, chất vô định hình không màu).
    • Phân đoạn $\text{H6}$ ($1{,}83\ \text{g}$) được sắc ký cột bằng hệ $\text{H:DCM}$ ($50 \rightarrow 100%\ \text{DCM}$) và $\text{DCM:Me}$ ($0 \rightarrow 100%\ \text{Me}$), thu được 4 phân đoạn phụ ($\text{H6.1} \rightarrow \text{H6.4}$). Phân đoạn $\text{H6.2}$ ($104{,}1\ \text{mg}$) sắc ký cột lặp lại với hệ dung môi $\text{H:DCM}$ ($1:1$) cô lập được hợp chất PEHC ($6\ \text{mg}$, bột màu trắng).

  • Cô lập hợp chất từ cao ethyl acetate:

    • $143{,}1\ \text{g}$ cao ethyl acetate được sắc ký cột silica gel với hệ $\text{H:EA}$ ($80 \rightarrow 100%\ \text{EA}$) và $\text{EA:Me}$ ($5 \rightarrow 100%\ \text{Me}$), thu được 5 phân đoạn ($\text{EA1} \rightarrow \text{EA5}$).
    • Phân đoạn $\text{EA4}$ ($33{,}4\ \text{g}$) được sắc ký cột với hệ $\text{H:EA}$ ($75 \rightarrow 100%\ \text{EA}$) và $\text{EA:Me}$ ($5 \rightarrow 100%\ \text{Me}$), thu được 8 phân đoạn phụ ($\text{EA4.1} \rightarrow \text{EA4.8}$).
    • Phân đoạn $\text{EA4.1}$ ($0{,}67\ \text{g}$) được sắc ký cột với hệ $\text{DCM:Me}$ ($0 \rightarrow 100%\ \text{Me}$), thu được 7 phân đoạn nhỏ ($\text{EA4.1.1} \rightarrow \text{EA4.1.7}$). Phân đoạn $\text{EA4.1.2}$ ($55{,}0\ \text{mg}$) được tinh chế qua cột sắc ký pha đảo $\text{RP-18}$ rửa giải bằng hệ $\text{Ac:H}_2\text{O}$ ($2:3$), kết tinh trong acetone thu được hợp chất PEA-N2 ($10\ \text{mg}$, tinh thể màu trắng).

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày chi tiết quá trình giải đoán và biện luận cấu trúc hóa học của 3 hợp chất tinh khiết dựa trên các số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân:

1. Khảo sát cấu trúc hợp chất PEA-N2 (Ethyl gallate)

Hợp chất PEA-N2 ($10\ \text{mg}$) có dạng tinh thể màu trắng, cho 1 vết duy nhất trên TLC ($\text{hexane:acetone:acetic acid} = 3:2:0{,}02$, hiện màu tím dưới UV $254\ \text{nm}$, màu hồng với thuốc thử $\text{H}_2\text{SO}_4\ 20%$).

  • Phổ $^{1}\text{H-NMR}$ ($\text{acetone-}d_6$): Tín hiệu mũi đơn tích phân $2\text{H}$ của proton vòng thơm đối xứng ở $\delta_{\text{H}}\ 7{,}052\ (\text{s}, \text{H-2,6})$; tín hiệu nhóm ethyl gồm nhóm methylene $-\text{CH}2-$ ở $\delta{\text{H}}\ 4{,}256\ (2\text{H}, \text{q}, J = 7{,}0\ \text{Hz})$ và nhóm methyl $-\text{CH}3$ ở $\delta{\text{H}}\ 1{,}314\ (3\text{H}, \text{t}, J = 7{,}0\ \text{Hz})$.
  • Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ ($\text{acetone-}d_6$): Tín hiệu carbon carbonyl ester $>\text{C=O}$ tại $\delta_{\text{C}}\ 166{,}7\ (\text{C-7})$; các carbon vòng thơm đối xứng tại $\delta_{\text{C}}\ 146{,}0\ (\text{C-3,5})$, $\delta_{\text{C}}\ 138{,}8\ (\text{C-4})$, $\delta_{\text{C}}\ 122{,}2\ (\text{C-1})$, $\delta_{\text{C}}\ 109{,}8\ (\text{C-2,6})$; tín hiệu nhóm ethyl tại $\delta_{\text{C}}\ 60{,}8\ (\text{C-8}, -\text{CH}2-)$ và $\delta{\text{C}}\ 14{,}6\ (\text{C-9}, -\text{CH}_3)$.
  • Kết luận: Dữ liệu phổ hoàn toàn trùng khớp với ethyl gallate theo công bố của Zijia Zhang và cộng sự (2009). Cấu trúc của PEA-N2 được xác định là ethyl gallate (ethyl 3,4,5-trihydroxybenzoate).

2. Khảo sát cấu trúc hợp chất PEHC (Oleanolic acid)

Hợp chất PEHC ($6\ \text{mg}$) là dạng bột màu trắng, cho 1 vết trên TLC ($\text{H:DCM} = 1:1$, hiện màu tím với $\text{H}_2\text{SO}_4\ 20%$).

  • Phổ $^{1}\text{H-NMR}$ ($\text{DMSO-}d_6$): Xuất hiện proton liên kết đôi olefin ở $\delta_{\text{H}}\ 5{,}16\ (1\text{H}, \text{t}, J = 3{,}5\ \text{Hz}, \text{H-12})$; proton gắn carbon mang nhóm hydroxyl ở $\delta_{\text{H}}\ 2{,}99\ (1\text{H}, \text{m}, \text{H-3})$; 7 tín hiệu mũi đơn của 7 nhóm methyl trên carbon tứ cấp ở vùng từ trường cao ($\delta_{\text{H}}\ 0{,}67\text{--}1{,}10$).
  • Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ ($\text{DMSO-}d_6$): Thể hiện khung triterpenoid gồm 30 carbon, bao gồm nhóm carboxyl $-\text{COOH}$ tại $\delta_{\text{C}}\ 178{,}6\ (\text{C-28})$; 2 carbon olefin tại $\delta_{\text{C}}\ 122{,}0\ (\text{C-12})$ và $\delta_{\text{C}}\ 143{,}6\ (\text{C-13})$; một carbon mang oxy tại $\delta_{\text{C}}\ 76{,}8\ (\text{C-3})$; các carbon methyl, methylene, methine và carbon bậc bốn cộng hưởng ở vùng $\delta_{\text{C}}\ 15{,}0\text{--}54{,}8$.
  • Kết luận: So sánh với số liệu phổ chuẩn của oleanolic acid trong tài liệu tham khảo cho thấy sự tương đồng cao. Cấu trúc của PEHC được xác định là oleanolic acid ($3\beta\text{-hydroxyolean-12-en-28-oic acid}$).

3. Khảo sát cấu trúc hợp chất PEA-N3 (Dẫn xuất của $\beta$-sitosterol)

Hợp chất PEA-N3 ($7\ \text{mg}$) có dạng bột vô định hình, không màu, 1 vết trên TLC ($\text{C:EA:Ac:Me} = 8:0{,}8:0{,}2:0{,}2$, hiện màu đỏ tím với $\text{H}_2\text{SO}_4\ 20%$).

  • Phổ $^{1}\text{H-NMR}$ ($\text{CDCl}3$): Tín hiệu proton olefin ở $\delta{\text{H}}\ 5{,}36\ (\text{m})$; proton trên carbon mang oxy ở $\delta_{\text{H}}\ 4{,}4$; các nhóm methyl, methylene, methine ở $\delta_{\text{H}}\ 0{,}67\text{--}2{,}4$.
  • Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ ($\text{CDCl}3$): Carbon carbonyl ester ở $\delta{\text{C}}\ 174{,}8$; hai carbon olefin ở $\delta_{\text{C}}\ 140{,}4$ và $122{,}0$; carbon anomer của phần đường ở $\delta_{\text{C}}\ 101{,}4$; carbon mang oxy ở $\delta_{\text{C}}\ 79{,}4$; các carbon mạch béo và khung steroid ở $\delta_{\text{C}}\ 12{,}0\text{--}56{,}8$. Tín hiệu carbon olefin ở $\delta_{\text{C}}\ 128$ và $130$ cùng nhóm methyl cuối mạch ($\delta_{\text{C}}\ 14{,}1$; $\delta_{\text{H}}\ 0{,}87, \text{t}$) chỉ ra sự hiện diện của chuỗi acyl không no (alkenoyl: $\text{CH}_3(\text{CH}_2)_m\text{CH=CH-}(\text{CH}_2)_n\text{-CO-}$).
  • Phổ tương quan $\text{HSQC}$ và $\text{HMBC}$: Tương quan HMBC từ $\text{H-1}$ ($\delta_{\text{H}}\ 1{,}85$) đến $\text{C-3}$ ($\delta_{\text{C}}\ 79{,}4$). Giá trị $\delta_{\text{C}}$ của $\text{C-3}$ chuyển dịch về phía trường yếu hơn so với $\text{C-3}$ mang nhóm $-\text{OH}$ tự do, chứng tỏ liên kết glycoside tại vị trí $\text{C-3}$.
  • Kết luận: Cấu trúc của PEA-N3 được đề nghị tạm thời là dẫn xuất của $\beta$-sitosterol mang phân tử đường tại vị trí C-3 và vị trí C-6' của phân tử đường có gắn hợp phần alkenoyl.

Chương 4: Kết luận và đề xuất

  • Kết luận: Đã xử lý thành công nguyên liệu lá me rừng và cô lập được 3 hợp chất hữu cơ sạch; xác định được cấu trúc hóa học của ethyl gallate (PEA-N2), oleanolic acid (PEHC) và đề nghị cấu trúc dẫn xuất steroid glycoside acylated (PEA-N3).
  • Đề xuất: Tiếp tục khảo sát các phân đoạn sắc ký còn lại của cao hexane, cao ethyl acetate và phân đoạn cao butanol/nước; đồng thời đo thêm các phổ cộng hưởng từ bổ sung để xác định chính xác cấu trúc chi tiết (xác định chiều dài chuỗi acid béo $m, n$) của hợp chất PEA-N3.

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng và phân lập thực nghiệm

Quá trình chiết xuất và phân lập từ $7{,}2\ \text{kg}$ nguyên liệu bột lá me rừng khô đã thu được các phân đoạn cao và hợp chất tinh khiết với các thông số cụ thể:

Tên phân đoạn / Hợp chất Khối lượng thu nhận Trạng thái cảm quan Phân đoạn nguồn Cấu trúc hóa học xác định
Cao ethanol thô $285{,}5\ \text{g}$ Cao đặc Bột lá khô ban đầu Hỗn hợp cao tổng
Cao phân đoạn hexane $22{,}1\ \text{g}$ Cao đặc Chiết lỏng - lỏng Phân đoạn kém phân cực
Cao phân đoạn ethyl acetate $143{,}1\ \text{g}$ Cao đặc Chiết lỏng - lỏng Phân đoạn phân cực trung bình
Cao phân đoạn còn lại $77{,}6\ \text{g}$ Cao đặc Chiết lỏng - lỏng Phân đoạn phân cực cao
PEA-N2 $10\ \text{mg}$ Tinh thể màu trắng Cao ethyl acetate ($\text{EA4.1.2}$) Ethyl gallate
PEHC $6\ \text{mg}$ Dạng bột màu trắng Cao hexane ($\text{H6.2}$) Oleanolic acid
PEA-N3 $7\ \text{mg}$ Bột vô định hình, không màu Cao hexane ($\text{H5.2}$) Dẫn xuất của $\beta\text{-sitosterol}$

Bảng đối chiếu số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^{1}\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$)

Dữ liệu phổ nghiệm của các hợp chất cô lập được đối chiếu chi tiết với tài liệu tham khảo để chứng minh cấu trúc:

Hợp chất Vị trí carbon $\delta_{\text{H}}\ \text{(ppm),}\ J\ \text{(Hz)}$ thực nghiệm $\delta_{\text{C}}\ \text{(ppm)}$ thực nghiệm $\delta_{\text{C}}\ \text{(ppm)}$ tài liệu tham khảo
PEA-N2 (Ethyl gallate) C-1 - 122,2 121,6
C-2,6 7,052 (s, 2H) 109,8 109,5
C-3,5 - 146,0 146,2
C-4 - 138,8 139,1
C-7 (>C=O) - 166,7 166,5
C-8 (-CH2-) 4,256 (q, $J=7{,}0$) 60,8 60,8
C-9 (-CH3) 1,314 (t, $J=7{,}0$) 14,6 14,8
PEHC (Oleanolic acid) C-3 2,99 (m, 1H) 76,8 77,2
C-12 5,16 (t, $J=3{,}5$, 1H) 122,0 121,5
C-13 - 143,6 143,8
C-28 (-COOH) - 178,6 178,5
PEA-N3 (Dẫn xuất steroid) C-3 - 79,4 -
C-5 - 140,4 -
C-6 5,36 (m, 1H) 122,0 -
C-1' (đường) - 101,4 -
Carbonyl ester - 174,8 -

Đóng góp khoa học của đề tài

  1. Đây là công trình thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam tiến hành khảo sát và công bố thành phần hóa học của bộ phận lá cây me rừng (Phyllanthus emblica L.).
  2. Thiết lập quy trình chiết phân đoạn và các hệ dung môi sắc ký cột (cả pha thường và pha đảo) tối ưu cho việc tách chiết các nhóm polyphenol, triterpene và phytosterol từ nguồn dược liệu này.
  3. Đóng góp các dữ liệu phổ nghiệm cộng hưởng từ hạt nhân ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, $\text{HSQC}$, $\text{HMBC}$) xác thực cho kho dữ liệu thực vật dược học Việt Nam, tạo cơ sở khoa học giải thích các hoạt tính sinh học dân gian của chiết xuất lá me rừng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Phạm vi khảo sát phân đoạn: Do giới hạn về thời gian và dung lượng khóa luận tốt nghiệp, tác giả mới chỉ tập trung phân lập trên một số phân đoạn có trọng lượng lớn và vết sắc ký rõ của cao hexane ($\text{H5}$, $\text{H6}$) và cao ethyl acetate ($\text{EA4.1}$); các phân đoạn khác ($\text{H1}\text{--}\text{H4}$, $\text{EA1}\text{--}\text{EA3}$, $\text{EA5}$) và phần cao còn lại ($77{,}6\ \text{g}$) chưa được khảo sát triệt để.
  • Xác định cấu trúc hợp chất PEA-N3: Cấu trúc của hợp chất PEA-N3 mới dừng lại ở mức đề nghị sơ bộ khung sườn. Trên phổ $\text{HMBC}$ chưa quan sát thấy tín hiệu tương quan trực tiếp từ proton $\text{H-3}$ đến carbon trong gốc acyl $\text{R}$, đồng thời chưa xác định chính xác số lượng nhóm methylene ($m, n$) trong chuỗi alkenoyl do giới hạn về mặt phổ nghiệm.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Tiếp tục triển khai sắc ký cột trên các phân đoạn còn lại của cao hexane, cao ethyl acetate và phân đoạn cao butanol/nước nhằm tìm kiếm thêm các hợp chất mới.
  • Bổ sung các phương pháp phân tích hiện đại như phổ khối lượng phân giải cao ($\text{HR-ESI-MS}$) và phổ $\text{NOESY/COSY}$ để xác định hoàn chỉnh công thức phân tử và cấu hình lập thể của hợp chất PEA-N3.
  • Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro (kháng oxy hóa, kháng khuẩn, ức chế enzyme hoặc độc tế bào) của các hợp chất tinh khiết đã cô lập được.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên ngành cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các lĩnh vực:

  • Ngành Hóa học (chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên): Cung cấp tài liệu thực hành chi tiết về phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng, kỹ thuật triển khai sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo $\text{RP-18}$, cách lựa chọn hệ dung môi giải ly phân cực đa cấu tử và quy trình hiện hình bản mỏng.
  • Ngành Dược học và Hóa dược: Cung cấp quy trình cô lập các hoạt chất có hoạt tính sinh học cao như ethyl gallate và oleanolic acid; hỗ trợ tư liệu đối chiếu dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, $\text{HSQC}$, $\text{HMBC}$) cho các khung phân tử triterpenoid dạng oleanane và dẫn xuất phenolic ester.

Câu hỏi thường gặp

1. Nguồn nguyên liệu lá cây me rừng dùng trong khóa luận được thu thập ở đâu và định danh bởi ai?

Mẫu lá me rừng được thu hái tại tỉnh Bình Thuận vào tháng 5 năm 2014. Mẫu thực vật này đã được TS. Phạm Văn Ngọt giám định và xác nhận tên khoa học chính xác là Phyllanthus emblica L., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).

2. Từ 7,2 kg bột lá me rừng khô đã điều chế được những loại cao chiết nào và khối lượng tương ứng là bao nhiêu?

Từ $7{,}2\ \text{kg}$ nguyên liệu bột lá khô ngâm dầm trong ethanol $96^\circ$, tác giả thu được $285{,}5\ \text{g}$ cao ethanol thô. Sau khi chiết lỏng - lỏng phân đoạn, thu được 3 loại cao: cao phân đoạn hexane ($22{,}1\ \text{g}$), cao phân đoạn ethyl acetate ($143{,}1\ \text{g}$) và phần cao còn lại ($77{,}6\ \text{g}$).

3. Hợp chất PEA-N2 được cô lập từ phân đoạn nào và cấu trúc được xác định như thế nào?

Hợp chất PEA-N2 ($10\ \text{mg}$, tinh thể màu trắng) được cô lập từ phân đoạn $\text{EA4.1.2}$ của cao ethyl acetate thông qua sắc ký cột pha đảo $\text{RP-18}$ với hệ dung môi $\text{acetone:nước}$ ($2:3$). Cấu trúc được xác định là ethyl gallate nhờ tín hiệu vòng thơm đối xứng ($\delta_{\text{H}}\ 7{,}052$; $\delta_{\text{C}}\ 109{,}8\text{--}146{,}0$), nhóm carbonyl ester ($\delta_{\text{C}}\ 166{,}7$) và nhóm ethyl ($\delta_{\text{H}}\ 4{,}256, 1{,}314$; $\delta_{\text{C}}\ 60{,}8, 14{,}6$).

4. Dữ kiện phổ NMR nào khẳng định hợp chất PEHC là oleanolic acid?

Phổ NMR của PEHC ($6\ \text{mg}$, bột màu trắng) thể hiện cấu trúc triterpenoid oleanane 30 carbon gồm: một nhóm carboxyl tại $\delta_{\text{C}}\ 178{,}6\ (\text{C-28})$, một liên kết đôi olefin tại $\delta_{\text{C}}\ 122{,}0\ (\text{C-12})$ và $\delta_{\text{C}}\ 143{,}6\ (\text{C-13})$ tương ứng proton $\delta_{\text{H}}\ 5{,}16\ (\text{H-12})$, một carbon mang nhóm hydroxyl tại $\delta_{\text{C}}\ 76{,}8\ (\text{C-3})$ và 7 nhóm methyl đơn ở vùng trường cao ($\delta_{\text{H}}\ 0{,}67\text{--}1{,}10$). Các số liệu này trùng khớp với phổ chuẩn của oleanolic acid.

5. Vì sao cấu trúc của hợp chất PEA-N3 chưa được xác định tuyệt đối mà chỉ dừng lại ở mức đề nghị?

Cấu trúc của PEA-N3 ($7\ \text{mg}$) được xác định sơ bộ là dẫn xuất steroid khung stigmastane mang đường tại $\text{C-3}$ và nhóm alkenoyl tại $\text{C-6'}$. Tuy nhiên, do trên phổ $\text{HMBC}$ không quan sát thấy tương quan từ proton $\text{H-3}$ tới carbon trong gốc $\text{R}$, đồng thời dữ liệu phổ hiện tại chưa cho phép giải đoán chính xác số lượng nhóm $-\text{CH}_2-$ ($m, n$) của chuỗi acid béo không no, nên tác giả chỉ đề nghị cấu trúc tạm thời.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Ngô Hồng Hoài Nam đã thực hiện thành công việc khảo sát hóa thực vật trên đối tượng lá cây me rừng (Phyllanthus emblica L.) thu hái tại tỉnh Bình Thuận. Bằng việc kết hợp các kỹ thuật sắc ký cột pha thường, sắc ký pha đảo và các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, $\text{HSQC}$, $\text{HMBC}$), nghiên cứu đã cô lập và làm sáng tỏ cấu trúc của 3 hợp chất hữu cơ gồm ethyl gallate, oleanolic acid và một dẫn xuất của $\beta$-sitosterol. Đây là công trình thực nghiệm đầu tiên công bố thành phần hóa học của lá me rừng tại Việt Nam, đóng góp những dẫn liệu khoa học giá trị cho kho tàng dược liệu tự nhiên.