đặt vấn đề thời vụ thu hái để đảm bảo hoạt chất mong muốn có hàm lượng cao nhất.2 Các kỹ thuật chiết xuất Có rất nhiều kỹ thuật và thiết bị chiết khác nhau được áp dụng cho hai phương pháp chiết như: chiết ở nhiệt độ thường (ngâm lạnh, ngấm kiệt ở nhiệt độ thường) hay nhiệt độ cao (chiết nóng, hãm, sắc, ngấm kiệt nóng), chiết với các thiết bị như soxhlet, kumagawa,…tùy yêu cầu, điều kiện mà lựa chọn kỹ thuật chiết thích hợp. Các phương pháp chiết gồm có ngâm và ngấm kiệt. Trong phương pháp ngâm dược liệu được ngâm trong một lượng thừa dung môi trong một thời gian nhất định để các chất tan trong dược liệu hòa tan vào dung môi. Dịch chiết sau đó được rút hết ra và dung môi mới được thêm vào và quá trình ngâm chiết được lặp lại cho tới khi lấy hết các chất khỏi dược liệu.
Trong phương pháp ngấm kiệt, dung môi được dịch chuyển trong khối dược liệu theo một chiều xác định với một tốc độ nhất định. Trong quá trình dịch chuyển, các chất tan trong dược liệu tan vào dung môi và nồng độ dung dịch tăng dần cho tới khi bão hoà ở đầu kia của khối dược liệu. Như vậy, ngấm kiệt là 1 quá trình chiết ngược dòng với nồng độ dịch chiết tăng dần từ đầu tới cuối khối dược liệu. Dung môi mới tiếp xúc với dược liệu có lượng hoạt chất thấp nhất do vậy quá trình chiết được thực hiện hoàn toàn hơn.
Dung môi chiết cũng tùy theo từng loại hoạt chất mà chọn cho thích hợp. Về nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycosid, các muối của alcaloid, các hợp chất polyphenol.) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và steroid tự do,…) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực. Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên ra, các kỹ thuật chiết mới như chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng, chiết chất lỏng quá tới hạn, chiết dưới áp suất cao…đã được phát triển để nâng cao hiệu quả cũng như chất lượng chiết xuất [14].
Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm Trong quá trình chiết xuất, đôi khi sóng siêu âm cũng được áp dụng để tăng hiệu quả chiết. Sóng siêu âm với tần số trên 20 kHz thường được sử dụng. Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng sự hoà tan của chất tan vào dung môi và 8 Luan van tăng quá trình khuếch tán chất tan. Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể tăng quá trình khuyếch tán chất tan.
Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình chiết [14]. Ưu điểm: chiết xuất với sự trợ giúp của siêu âm thể hiện sự hiệu quả, đơn giản và ít tốn kém so với các kỹ thuật chiết xuất thông thường. Ưu điểm chính của phương pháp này là làm tăng khối lượng chiết xuất và động học của quá trình chiết xuất cũng nhanh hơn nên rút ngắn được thời gian chiết xuất. Siêu âm cũng có thể làm giảm nhiệt độ chiết xuất, cho phép chiết xuất các hợp chất kém bền với nhiệt.
So với chiết xuất bằng vi sóng và siêu tới hạn thì thiết bị chiết siêu âm rẻ hơn và tiến hành dễ dàng hơn. Hơn nữa, trong chiết xuất siêu âm có thể sử dụng nhiều loại dung môi để chiết xuất một khoảng rộng các hoạt chất [15]. Nhược điểm: siêu âm trong chiết xuất có thể làm biến đổi các chất chiết do nhiệt độ tăng cao và sự hình thành hydroqeroxyl, nhất là dung môi có nước. Một số hoạt chất trong dược liệu khi sử dụng siêu âm dễ bị phân hủy.
Vì vậy phải cẩn thận khi chọn điều kiện chiết xuất cũng như phương pháp phát hiện sản phẩm phân hủy [15]. Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng Khi chiếu bức xạ điện từ ở tần số 2450 MHz (bức xạ trong vùng vi sóng của dải sóng điện từ) vào môi trường các chất phân cực, các phân tử sẽ chịu đồng thời 2 tác động: sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác dụng của điện trường. Cả hai tác động này làm sinh ra nhiệt trong lòng khối vật chất làm cho việc gia nhiệt nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều so với phương pháp dẫn nhiệt truyền thống. Trong chiết xuất, khi chiếu xạ vi sóng vào môi trường có chứa các tiểu phân dược liệu và dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hoà tan các chất vào dung môi.
Thêm vào đó, vi sóng cũng làm phá huỷ cấu trúc vách tế bào thực vật làm các chất tan giải phóng trực tiếp vào dung môi chiết làm cho quá trình chiết chuyển thành hoà tan đơn giản. Điều này làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng cũng làm cho dịch chiết nhiều tạp chất hơn [14]. 9 Luan van Chiết bằng chất lỏng quá tới hạn Những năm gần đây phương pháp chiết xuất bằng chất lỏng quá giới hạn hoặc chất lỏng siêu tới hạn (Super-critical fluid extraction, SFE) cũng được áp dụng để chiết xuất trong định tính cũng như công nghiệp các hợp chất tự nhiên. Nguyên tắc của phương pháp này như sau: trong điều kiện áp suất bình thường, khi nâng nhiệt độ một chất lỏng tới điểm sôi của nó, chất lỏng sẽ hóa hơi.
Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nồng độ và đồng thời tăng áp suất của hệ lên quá một nhiệt độ và một áp suất nhất định nào đó, người ta sẽ thu được một “chất lỏng” đặc biệt gọi là chất lỏng quá tới hạn. Chất lỏng này không giống với trạng thái lỏng thông thường mà mang cả đặc tính của cả chất khí và chất lỏng. Trong phòng thí nghiệm, SFE được dùng để chiết mẫu cho phân tích dư lượng thuốc trừ sâu, các chất hữu cơ độc hại trong môi trường,…[14] Chiết dưới áp suất cao Một kỹ thuật chiết hiện cũng được sử dụng trong chiết xuất hiện đại là chiết dưới áp suất cao (pressurized liquid extraction, PLE). Khả năng hòa tan của các chất trong dung môi phụ thuộc nhiều và nhiệt độ.
Khi nhiệt độ tăng khả năng hòa tan các chất tăng. Vì thế trong chiết xuất, người ta có xu hướng tăng nhiệt độ để giảm lượng dung môi sử dụng và giảm thời gian chiết. Tuy nhiên, trong điều kiện bình thường, việc tăng nhiệt độ chiết có giới hạn của nó là nhiệt độ sôi của dung môi. Khi hóa hơi, dung môi không còn khả năng hòa tan các chất nữa.
Để khắc phục điều này, người ta tiến hành chiết các chất dưới áp suất cao dựa vào nguyên tắc: nhiệt độ sôi của chất lỏng tăng khi áp suất tăng. Khi đó ta có phương pháp chiết chất lỏng sưới áp suất [14].3 Tổng quan về oxy hóa 1.1 Gốc tự do Gốc tự do là trạng thái cấu trúc của phân tử có 1 điện tử lẻ ở quỹ đạo điện tử ngoài cùng [16], trong khi các phân tử của hệ sinh học đều có số điện tử chẵn ở lớp ngoài cùng [17, 18]. Vì vậy gốc tự do có đặc điểm là rất kém ổn định, chúng sẵn sàng phản ứng với phân tử hoặc nguyên tử lân cận, cho đi hoặc nhận thêm một điện tử để hoàn chỉnh quỹ đạo điện tử ngoài cùng của mình [18]. Đây là lý do, tại sao các gốc tự do có khả năng phản ứng cao và có thể 10 Luan van phản ứng với protein, lipid, carbohydrate và DNA.
Những gốc tự do này tấn công các phân tử ổn định gần nhất để “đánh cắp” electron để trở thành trạng thái bền vững. Khi phân tử bị tấn công mất điện tử, nó sẽ trở thành một gốc tự do mới, bắt đầu phản ứng dây chuyền, cuối cùng dẫn đến phá hủy tế bào [16]. Cấu tạo gốc tự do [19] Các gốc tự do hay nói chính xác là các chất hoạt động chứa oxy (Reactive Oxygen Species - ROS ) và các chất hoạt động chứa nito (Reactive Nitrogen Species - RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nito phân tử. Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất không phải là gốc tự do (tiền thân của các gốc tự do).
Các chất hoạt động chứa oxy và nito chính [20] O2. OH Hydroxyl Gốc tự do NO. Nitric Oxide NO2. Nitrogen dioxid H2O2 Hydrogen peroxid Các dẫn xuất không Hypochlorous acid HOCl phải là các gốc tự do ONOO- Peroxy nitrit 11 Luan van ROS được coi là một trong những nguyên nhân chính gây tổn thương mô.
Tuy nhiên, sự cân bằng giữa sự sản sinh ROS và hoạt động của hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể sống giúp duy trì sự phá hủy của quá trình oxy hóa ở mức độ thấp. Khi sự mất cân bằng xảy ra nghiêm trọng, sản sinh nhiều ROS sẽ gây ra stress oxy hóa. ROS là nguyên nhân gây ra các bệnh tim mạch, tiểu đường, viêm khớp dạng thấp, ung thư và rối loạn thần kinh …[21]. Tương tự như ROS, RNS có vai trò kép, vừa cho tác dụng có lợi vừa có thể gây hại cho hệ thống sống.
Nitric oxid là chất được biết sớm nhất với vai trò là phân tử làm giãn nở mạch máu, kiểm soát lượng máu lưu thông đến các bộ phận của cơ thể. Đồng thời, nó có thể là trung gian gây độc tế bào do phá hủy các enzym chuyển hóa bằng phản ứng với superoxid, peroxynitrit [20]. Các ROS và RNS được tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động xấu, tốt đến cơ thể [20, 22]. Ở nồng độ thấp, các ROS và các RNS là các tín hiệu làm nhiệm vụ [22]: + Điều hòa phân ly tế bào + Kích hoạt các yếu tố phiên mã (NFkB, p38-MAP kinase,.) cho các gen tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm.
+ Điều hòa biểu hiện các gen mã hóa cho các enzym chống oxy hóa. Ở nồng độ cao, các ROS và RNS oxy hóa các đại phân tử sinh học gây nên [22]: + Đột biến ở DNA + Biến tính protein + Oxy hóa lipid 1.2 Hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể Chất chống oxy hóa là những phân tử ổn định đủ để nhận hoặc nhường electron cho các gốc tự do và trung hòa chúng, do đó làm giảm hoặc mất khả năng gây hại tới tế bào của ROS [23].