Luận văn thạc sĩ kỹ thuật hóa học nghiên cứu trích ly hoạt chất từ lá hoàn ngọc bằng kỹ thuật co2 siêu tới hạn và thử nghiệm hoạt tính sinh học

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật nghiên cứu kỹ thuật hóa học nghiên cứu trích ly hoạt chất từ lá hoàn ngọc bằng kỹ thuật co2 siêu tới hạn và, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân,

• Tác giả: Nguyễn Phan Hồng Mai
• Người hướng dẫn: PGS. TS Nguyễn Hữu Hiếu
• Trường học: Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM
• Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học
• Đề tài: Nghiên Cứu Trích Ly Hoạt Chất Từ Lá Hoàn Ngọc Bằng Kỹ Thuật CO2 Siêu Tới Hạn Và Thử Nghiệm Hoạt Tính Sinh Học
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về Hoàn Ngọc
• 1.1.1. Giới thiệu chung
• 1.1.2. Đặc điểm hình thái
• 1.1.3. Thành phần hóa học
• 1.2. Hoạt tính sinh học của lá Hoàn Ngọc
• 1.2.1. Kháng oxy hóa
• 1.2.2. Kháng ung thư
• 1.2.3. Kháng khuẩn
• 1.3. Phương pháp trích ly
• 1.4. Kỹ thuật lưu chất siêu tới hạn
• 1.4.1. Nguyên lý hoạt động và sự biến đổi trạng thái của CO2 trong quá trình trích ly
• 1.4.2. Hệ thống trích ly bằng CO2 siêu tới hạn
• 1.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 1.6. Mục tiêu, nội dung, phương pháp nghiên cứu, tính mới và đóng góp của luận văn
• 1.6.1. Nội dung nghiên cứu
• 1.6.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Nguyên liệu, hoá chất, dụng cụ, thiết bị và địa điểm thực hiện
• 2.1.1. Thiết bị, dụng cụ
• 2.1.2. Địa điểm thực hiện
• 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng polyphenol
• 2.3. Phương pháp phân tích cấu trúc nguyên liệu trước và sau khi trích ly
• 2.4. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng polyphenol
• 3.1.1. Ảnh hưởng của từng yếu tố
• 3.1.2. Khảo sát sự ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố đến hàm lượng polyphenol
• 3.2. Bề mặt nguyên liệu trước và sau khi trích ly
• 3.3. Hoạt tính sinh học của cao trích
• 3.3.1. Hoạt tính kháng oxy hoá
• 3.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn
• 3.3.3. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về Hoàn Ngọc

Cây Hoàn Ngọc (Pseuderanthemum palatiferum) thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) là một loại cây thuốc quý tại Việt Nam. Hoàn Ngọc được biết đến với nhiều hoạt chất có lợi cho sức khỏe, đặc biệt là nhóm polyphenol. Các nghiên cứu cho thấy, lá Hoàn Ngọc chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như kháng viêm, kháng khuẩn và chống oxy hóa. Đặc điểm hình thái của cây này bao gồm chiều cao từ 1-2m, với lá có hình lưỡi mác, dài từ 12-17 cm. Thành phần hóa học của lá Hoàn Ngọc rất đa dạng, bao gồm các hợp chất phenolic, saponin, và lipit, góp phần tạo nên các hoạt tính sinh học đáng chú ý. Theo nghiên cứu, hàm lượng polyphenol trong lá Hoàn Ngọc có thể đạt đến 40,94 mg/g khi sử dụng phương pháp trích ly thích hợp. Điều này mở ra cơ hội cho việc nghiên cứu sâu hơn về ứng dụng của cây Hoàn Ngọc trong y học và thực phẩm.

1.1 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của lá Hoàn Ngọc bao gồm nhiều hợp chất như phenolic, phytosterol, và lipit. Các hợp chất này có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý khác nhau. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng polyphenol trong lá Hoàn Ngọc có mối liên hệ chặt chẽ với khả năng kháng oxy hóa, kháng khuẩn và kháng viêm. Đặc biệt, các axit gallic và axit chlorogenic trong lá Hoàn Ngọc được cho là có khả năng trung hòa gốc tự do, từ đó bảo vệ sức khỏe con người. Việc phân lập và nghiên cứu các hoạt chất này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về giá trị dược liệu của Hoàn Ngọc mà còn mở ra hướng đi mới cho các sản phẩm từ thiên nhiên trong điều trị bệnh.

II. Phương pháp trích ly bằng CO2 siêu tới hạn

Phương pháp trích ly bằng CO2 siêu tới hạn là một kỹ thuật hiện đại, cho phép thu nhận các hoạt chất từ thực vật mà không để lại dư lượng độc hại. Kỹ thuật này sử dụng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn, giúp tối ưu hóa quá trình trích ly mà vẫn giữ nguyên được cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất. Quá trình này không chỉ an toàn cho môi trường mà còn giảm thiểu sự biến tính của các hoạt chất nhạy cảm với nhiệt. Nghiên cứu cho thấy rằng việc điều chỉnh các yếu tố như áp suất, nhiệt độ và thời gian trích ly có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng polyphenol thu được. Kết quả từ các thí nghiệm cho thấy, điều kiện tối ưu để trích ly polyphenol từ lá Hoàn Ngọc là rất quan trọng để đạt được hiệu suất cao nhất, điều này được thực hiện thông qua mô hình Box-Behnken trong thiết kế thí nghiệm.

2.1 Quy trình và hiệu suất trích ly

Quy trình trích ly bằng CO2 siêu tới hạn bao gồm nhiều bước từ chuẩn bị nguyên liệu đến thu nhận sản phẩm cuối cùng. Các yếu tố như áp suất và nhiệt độ được điều chỉnh để tìm ra điều kiện tối ưu, nhằm tối đa hóa hàm lượng polyphenol trong cao trích. Thí nghiệm cho thấy rằng áp suất cao và nhiệt độ thấp thường dẫn đến hiệu suất trích ly tốt hơn. Việc sử dụng phần mềm Design Expert 11.0 để phân tích dữ liệu và tối ưu hóa điều kiện trích ly là một điểm mạnh trong nghiên cứu này. Kết quả thu được không chỉ có giá trị trong lĩnh vực khoa học mà còn có thể ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng.

III. Thử nghiệm hoạt tính sinh học

Hoạt tính sinh học của cao trích từ lá Hoàn Ngọc được đánh giá thông qua các phương pháp thử nghiệm kháng oxy hóa, kháng khuẩn và ức chế tế bào ung thư. Các nghiên cứu cho thấy cao trích từ lá Hoàn Ngọc có khả năng kháng oxy hóa mạnh mẽ, điều này được xác nhận qua phương pháp bắt gốc tự do DPPH. Bên cạnh đó, hoạt tính kháng khuẩn của cao trích cũng được thử nghiệm trên các vi khuẩn như Escherichia coli và Staphylococcus aureus, cho thấy hiệu quả rõ rệt trong việc ức chế sự phát triển của các vi khuẩn này. Hơn nữa, khả năng ức chế tế bào ung thư của cao trích cũng được nghiên cứu trên hai dòng tế bào ung thư A549 và MCF-7, cho thấy tiềm năng lớn trong việc hỗ trợ điều trị ung thư.

3.1 Khả năng kháng oxy hóa

Khả năng kháng oxy hóa của cao trích từ lá Hoàn Ngọc được đánh giá qua phương pháp DPPH, cho thấy cao trích có khả năng bắt gốc tự do hiệu quả. Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng hoạt tính kháng oxy hóa của cao trích có thể so sánh với một số chất chống oxy hóa tiêu chuẩn như axit ascorbic. Điều này cho thấy tiềm năng của các hợp chất trong lá Hoàn Ngọc trong việc bảo vệ tế bào khỏi sự tổn thương do oxy hóa, từ đó ngăn ngừa các bệnh lý liên quan đến stress oxy hóa. Việc nghiên cứu sâu hơn về các cơ chế hoạt động của các hợp chất này sẽ góp phần làm rõ hơn giá trị dược liệu của Hoàn Ngọc trong y học hiện đại.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, mỗi năm toàn cầu ghi nhận khoảng 700.000 ca tử vong do các chủng vi khuẩn kháng thuốc gây ra, và con số này được dự báo có thể tăng lên mức 10.000.000 người vào năm 2050 nếu không có các giải pháp can thiệp hiệu quả. Bên cạnh đó, ung thư tiếp tục là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu, trong khi các phương pháp hóa trị tổng hợp hiện hành thường đi kèm nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng đối với tế bào lành. Thực trạng này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học tự nhiên từ thảo dược nhằm hỗ trợ điều trị và nâng cao sức đề kháng. Cây Hoàn Ngọc, tên khoa học là Pseuderanthemum palatiferum, là một loài dược liệu bản địa quý của Việt Nam chứa hàm lượng hợp chất phenolic và flavonoid dồi dào với nhiều tiềm năng dược lý.

Tuy nhiên, các phương pháp trích ly truyền thống như ngâm dầm hay chiết Soxhlet thường tiêu tốn từ 12 giờ đến 7 ngày, hiệu suất thu hồi chưa cao, dễ làm biến tính các liên kết nhạy cảm với nhiệt và để lại dư lượng dung môi hữu cơ độc hại trong sản phẩm. Nhằm khắc phục triệt để các hạn chế trên, đề tài tập trung nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật trích ly bằng lưu chất CO2 siêu tới hạn kết hợp đồng dung môi ethanol để thu nhận hoạt chất polyphenol từ lá Hoàn Ngọc, đồng thời tiến hành đánh giá toàn diện các hoạt tính sinh học gồm kháng oxy hóa, kháng khuẩn và ức chế tế bào ung thư. Toàn bộ công trình được triển khai thực nghiệm trong giai đoạn từ tháng 09/2022 đến tháng 12/2022 tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Công nghệ Hóa học và Dầu khí. Nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc khi tối ưu hóa được điều kiện công nghệ xanh, nâng hàm lượng polyphenol thu nhận lên mức 13,165 mg GAE/g, mở ra tiền đề cho việc sản xuất các chế phẩm dược liệu sạch phục vụ chăm sóc sức khỏe.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết về lưu chất siêu tới hạn, trong đó trạng thái siêu tới hạn của carbon dioxide đạt được khi vượt qua điểm tới hạn với nhiệt độ 31,1 °C và áp suất 73,8 bar. Ở trạng thái này, CO2 mang đặc tính trung gian giữa chất lỏng và chất khí với tỷ trọng cao giúp hòa tan tốt các hợp chất hữu cơ, độ nhớt thấp và hệ số khuếch tán lớn cho phép thẩm thấu nhanh vào cấu trúc tế bào thực vật mà không để lại tồn dư độc hại sau khi xả áp. Để trích ly các hợp chất polyphenol có tính phân cực chứa nhiều nhóm hydroxyl, dung môi ethanol được bổ sung như một chất biến tính nhằm gia tăng độ phân cực cho pha lưu chất.

Khung lý thuyết định lượng dựa trên định luật quang phổ Lambert - Beer và phản ứng tạo màu Folin - Ciocalteu tại bước sóng 750 nm với chất chuẩn axit gallic. Mô hình tối ưu hóa toán học sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng theo thiết kế Box - Behnken bậc 2 với 3 mức mã hóa gồm giá trị âm 1, 0 và dương 1 nhằm thiết lập mối tương quan giữa các biến độc lập và hàm mục tiêu. Khung lý thuyết đánh giá hoạt tính sinh học bao gồm: cơ chế trung hòa các gốc oxy hóa tự do thông qua phản ứng cho hydro đối với gốc tự do DPPH đo tại bước sóng 517 nm; cơ chế ức chế màng sinh học và tổng hợp ATP của vi khuẩn Gram âm và Gram dương; cùng cơ chế cảm ứng quá trình tự chết theo chương trình apoptosis của tế bào ung thư thông qua thử nghiệm độc tính tế bào MTT đo độ hấp thụ tại bước sóng 540 nm.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu là lá Hoàn Ngọc khô được cung cấp bởi Doanh nghiệp tư nhân Hoàn Ngọc 7 Nga tại tỉnh Tây Ninh, được xay thành bột đồng nhất và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Cỡ mẫu cho mỗi mẻ trích ly thực nghiệm được cố định chính xác ở mức 3,0 g nguyên liệu nạp vào ống trích dung tích 50 mL của hệ thống thiết bị Spe-ed SFE Model 7070. Quá trình chọn mẫu và bố trí thí nghiệm được thực hiện qua hai giai đoạn: giai đoạn khảo sát luân phiên từng biến đơn lẻ với 4 thông số gồm áp suất từ 200 đến 450 bar, thời gian từ 0,5 đến 3,0 giờ, thể tích ethanol từ 0 đến 25 mL và nhiệt độ từ 40 đến 90 °C, lặp lại 3 lần cho mỗi mức; giai đoạn tối ưu hóa đồng thời gồm 29 thí nghiệm theo thiết kế ma trận Box - Behnken 4 yếu tố. Lý do lựa chọn thiết kế Box - Behnken là nhằm giảm thiểu số lượng thí nghiệm cần thiết so với quy hoạch toàn phần, tránh các điểm thí nghiệm ở điều kiện biên khắc nghiệt gây quá tải thiết bị và đảm bảo tính độc lập giữa các hệ số hồi quy bậc hai.

Phương pháp hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE-SEM với độ phân giải từ 10 đến 100 nm được lựa chọn để phân tích trực tiếp sự thay đổi hình thái vi cấu trúc bề mặt mô lá trước và sau trích ly. Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá qua phương pháp khuếch tán đĩa giấy đường kính 6 mm trên môi trường thạch dinh dưỡng đối với hai chủng vi khuẩn chuẩn ATCC là Escherichia coli và Staphylococcus aureus. Độc tính tế bào ung thư được thử nghiệm trên hai dòng tế bào ung thư phổi A549 và ung thư biểu mô MCF-7 ở mật độ 3 nhân 10 mũ 4 tế bào/mL trong môi trường RPMI 1640, ủ liên tục 72 giờ ở điều kiện 37 °C và 5% CO2 trước khi phản ứng với dung dịch MTT. Toàn bộ chuỗi quy trình từ thu thập mẫu, phân tích quang phổ đến kiểm định vi sinh được thực hiện nghiêm ngặt theo tiến độ từ tháng 09/2022 đến tháng 12/2022.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình khảo sát đơn biến cho thấy áp suất vận hành đóng vai trò quyết định đến khả năng trích ly; khi nâng áp suất từ 200 bar lên 350 bar ở 40 °C, hàm lượng polyphenol tăng mạnh từ 0,882 mg/g lên 1,998 mg/g, tương đương mức tăng trưởng 126,5%. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng áp suất lên mức 400 bar, hàm lượng polyphenol có xu hướng giảm do hiệu ứng nén chặt bột nguyên liệu làm cản trở quá trình khuếch tán. Thời gian trích ly cho hiệu suất tối ưu ở mốc 2,0 giờ; việc kéo dài thời gian lên 3,0 giờ khiến hàm lượng hoạt chất suy giảm do tiếp xúc lâu với nhiệt và áp suất cao. Việc bổ sung đồng dung môi ethanol từ 0 đến 15 mL đã làm gia tăng hàm lượng polyphenol gấp hơn 3 lần nhờ tạo liên kết hòa tan các cấu tử phân cực, trong khi nhiệt độ trích ly đơn biến đạt điểm cực đại tại 60 °C.

Khi tiến hành quy hoạch thực nghiệm đồng thời 4 yếu tố với 29 nghiệm thức theo mô hình Box - Behnken, kết quả ghi nhận hàm lượng polyphenol dao động từ 10,180 mg/g đến 13,165 mg GAE/g. Nghiệm thức đạt giá trị cao nhất là 13,165 mg GAE/g tại điều kiện áp suất 350 bar, thời gian 2,5 giờ, thể tích ethanol 20 mL và nhiệt độ 60 °C, tăng hơn 550% so với quá trình trích ly đơn biến ban đầu không có đồng dung môi. Phân tích phương sai ANOVA cho thấy mô hình hồi quy bậc hai có độ tin cậy rất cao với giá trị F bằng 475,52 và mức ý nghĩa p nhỏ hơn 0,0001.

Hình ảnh hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE-SEM chứng minh rõ rệt sự phá hủy cấu trúc mô thực vật: mẫu lá Hoàn Ngọc ban đầu có bề mặt phẳng mịn và màng tế bào nguyên vẹn, trong khi mẫu sau khi trích ly bằng CO2 siêu tới hạn xuất hiện vô số vết rỗ xốp, vách tế bào bị xé rách hoàn toàn giúp hoạt chất thoát ra ngoài triệt để. Về hoạt tính sinh học, cao trích ở điều kiện tối ưu thể hiện khả năng quét gốc tự do DPPH mạnh mẽ tăng dần theo nồng độ; tạo vòng ức chế kháng khuẩn rõ rệt trên cả hai chủng vi khuẩn E. coli và S. aureus; đồng thời thể hiện hiệu lực gây độc tế bào phụ thuộc nồng độ trên cả hai dòng tế bào ung thư A549 và MCF-7 trong dải nồng độ thử nghiệm từ 0,5 đến 128 µg/mL.

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân chính dẫn đến sự gia tăng vượt bậc của hàm lượng polyphenol là do sự kết hợp đồng thời giữa tính chất vật lý của lưu chất siêu tới hạn và tương tác phân cực của đồng dung môi. Khi áp suất tăng đến 350 bar, tỷ trọng của CO2 tăng lên đáng kể, làm tăng mật độ phân tử và khả năng solvat hóa đối với các hợp chất hữu cơ. Sự hiện diện của 20 mL ethanol làm biến tính dung môi không phân cực CO2, giúp phá vỡ các liên kết hydro nội phân tử của polyphenol và kéo các chất này vào pha lỏng. Nhiệt độ 60 °C cung cấp đủ nhiệt năng để tăng áp suất hơi bão hòa của chất tan mà không gây phân hủy nhiệt cấu trúc vòng benzen nhạy cảm.

So với các công trình nghiên cứu sử dụng phương pháp ngâm dầm truyền thống trong ethanol 80% cần tới 7 ngày hoặc chiết Soxhlet ở nhiệt độ sôi kéo dài, kỹ thuật CO2 siêu tới hạn rút ngắn thời gian chỉ còn 2,0 đến 2,5 giờ nhưng mang lại hàm lượng hoạt chất cao hơn và hoàn toàn sạch dung môi hữu cơ. Dữ liệu thực nghiệm của nghiên cứu được minh họa trực quan qua các mô hình bề mặt đáp ứng 3 chiều và biểu đồ đường mức đồng mức trong không gian đa chiều từ phần mềm Design-Expert 11.0. Các biểu đồ này thể hiện rõ tương tác có ý nghĩa thống kê giữa áp suất và nhiệt độ với giá trị F bằng 247,42, cũng như tương tác giữa áp suất và thời gian với giá trị F bằng 52,00. Sự kết hợp giữa các bảng phân tích phương sai ANOVA chi tiết và chuỗi ảnh chụp FE-SEM độ phóng đại cao cung cấp bằng chứng thực nghiệm vững chắc về hiệu quả vượt trội của quy trình công nghệ xanh này.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm phát triển và ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất, bốn nhóm giải pháp trọng tâm được đề xuất thực hiện:

Thứ nhất, mở rộng quy mô hệ thống trích ly CO2 siêu tới hạn từ buồng chiết phòng thí nghiệm 50 mL lên quy mô pilot dung tích từ 10 đến 50 lít trong lộ trình 12 đến 18 tháng tới. Mục tiêu của giải pháp là đạt tỷ lệ thu hồi hoạt chất trên 95% và thiết lập hệ thống tuần hoàn khép kín khí CO2 nhằm cắt giảm 30% chi phí vận hành năng lượng, do các trung tâm công nghệ sinh học phối hợp cùng các viện nghiên cứu chuyên ngành chủ trì triển khai.

Thứ hai, chuẩn hóa quy trình trồng trọt, thu hái và sơ chế nguyên liệu lá Hoàn Ngọc tại các vùng nguyên liệu trọng điểm ở tỉnh Tây Ninh và miền Đông Nam Bộ theo tiêu chuẩn Thực hành tốt trồng trọt và thu hái dược liệu GACP-WHO. Đảm bảo kiểm soát độ ẩm nguyên liệu sau sấy dưới 10% và kích thước hạt nghiền đồng đều trong khoảng 0,25 đến 0,5 mm, do Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn phối hợp với các hợp tác xã dược liệu hoàn thiện trong giai đoạn 2024 - 2025.

Thứ ba, ứng dụng cao trích Hoàn Ngọc siêu tới hạn giàu polyphenol để nghiên cứu phát triển các dòng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe và mỹ phẩm chống oxy hóa. Đặt mục tiêu hoàn thiện công thức bào chế viên nang mềm hoặc serum dưỡng da đạt chỉ số ổn định hoạt tính sinh học trên 90% sau 12 tháng bảo quản, do các phòng nghiên cứu và phát triển của các doanh nghiệp dược phẩm thực hiện.

Thứ tư, đẩy mạnh nghiên cứu chuyên sâu về cơ chế phân tử và thử nghiệm tiền lâm sàng in vivo trên mô hình động vật đối với hoạt tính kháng ung thư phổi và ung thư vú trong vòng 24 tháng. Cần xác định cụ thể các phân đoạn hoạt chất chủ đạo trong dịch chiết nhằm làm rõ con đường truyền tín hiệu kích hoạt caspase và ức chế protein gây ung thư, do các nhóm nghiên cứu liên ngành Hóa - Dược - Y sinh phụ trách.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả của luận văn mang lại giá trị thực tiễn và học thuật cho bốn nhóm đối tượng chính:

Nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Kỹ thuật Hóa học, Công nghệ Thực phẩm và Hóa Dược có thể sử dụng tài liệu này như một nguồn tham khảo chuẩn mực về việc ứng dụng phương pháp bề mặt đáp ứng Box - Behnken trong tối ưu hóa các quá trình công nghệ trích ly cao áp và đánh giá động học truyền khối.

Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng có thể khai thác các thông số công nghệ tối ưu gồm áp suất 350 bar, nhiệt độ 60 °C và tỷ lệ ethanol thích hợp để chuyển giao công nghệ, thiết kế dây chuyền sản xuất cao dược liệu sạch không tồn dư hóa chất độc hại, đáp ứng các tiêu chuẩn xuất khẩu quốc tế nghiêm ngặt.

Kỹ sư công nghệ hóa chất và chuyên viên vận hành thiết bị trích ly áp suất cao có thể tham khảo chi tiết quy trình vận hành hệ thống lưu chất siêu tới hạn, phương pháp kiểm soát sự biến đổi trạng thái pha của khí CO2 và các giải pháp an toàn kỹ thuật trong quá trình chiết xuất áp suất từ 200 đến 450 bar.

Học viên cao học và sinh viên đại học thuộc các khối ngành kỹ thuật, sinh học và dược học có thể sử dụng công trình như một tài liệu hướng dẫn hoàn chỉnh về phương pháp kết hợp giữa kỹ thuật phân tích hóa lý hiện đại như quang phổ UV-Vis, kính hiển vi điện tử FE-SEM và các quy trình thử nghiệm hoạt tính sinh học chuẩn vi sinh và nuôi cấy tế bào.

Câu hỏi thường gặp

Kỹ thuật trích ly bằng CO2 siêu tới hạn mang lại những ưu điểm vượt trội nào so với phương pháp truyền thống? Phương pháp CO2 siêu tới hạn vận hành ở nhiệt độ ôn hòa trên 31,1 °C và áp suất 73,8 bar, giúp bảo toàn nguyên vẹn các hợp chất polyphenol nhạy cảm với nhiệt. Khí CO2 là dung môi trơ, không độc, không bắt lửa và tự bay hơi hoàn toàn sau khi giảm áp, giúp thu được cao chiết tinh khiết tuyệt đối mà không để lại dư lượng dung môi độc hại như khi dùng n-hexan hay methanol.

Tại sao cần phải bổ sung đồng dung môi ethanol trong quá trình trích ly lá Hoàn Ngọc? Bản chất của CO2 siêu tới hạn là một dung môi không phân cực, chỉ hòa tan tốt các hợp chất kỵ nước. Các hợp chất polyphenol trong lá Hoàn Ngọc chứa nhiều nhóm hydroxyl phân cực, do đó việc bổ sung một lượng ethanol từ 15 đến 20 mL đóng vai trò chất biến tính, giúp gia tăng mạnh mẽ độ phân cực của pha lưu chất và nâng cao hiệu suất trích ly polyphenol lên hơn 550%.

Bộ thông số công nghệ tối ưu nhất để thu nhận hàm lượng polyphenol cao nhất là bao nhiêu? Dựa trên mô hình tối ưu hóa Box - Behnken và phân tích phương sai ANOVA, điều kiện công nghệ tối ưu đạt được tại áp suất 350 bar, thời gian trích ly 2,5 giờ, thể tích đồng dung môi ethanol 20 mL và nhiệt độ 60 °C. Tại điều kiện này, hàm lượng polyphenol thực nghiệm đạt giá trị cực đại là 13,165 mg GAE/g chất khô.

Cao trích lá Hoàn Ngọc bằng CO2 siêu tới hạn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi sinh vật nào? Cao chiết tối ưu thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt trên cả hai chủng vi khuẩn chuẩn ATCC là vi khuẩn Gram âm Escherichia coli và vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus. Khả năng kháng khuẩn được chứng minh thông qua sự hình thành đường kính vòng ức chế rõ ràng xung quanh khoanh giấy thử nghiệm kích thước 6 mm trên môi trường thạch tổng hợp.

Khả năng ức chế tế bào ung thư của cao trích được đánh giá trên các dòng tế bào nào và theo cơ chế gì? Hoạt tính kháng ung thư của cao trích được thử nghiệm thông qua phương pháp MTT trên hai dòng tế bào ung thư ở người là ung thư phổi A549 và ung thư biểu mô MCF-7. Trong dải nồng độ từ 0,5 đến 128 µg/mL sau 72 giờ ủ, dịch chiết thể hiện khả năng ức chế tăng trưởng tế bào ác tính mạnh mẽ nhờ tác động kích hoạt quá trình tự chết theo chương trình apoptosis và phân rã cấu trúc ty thể tế bào khối u.

Kết luận

Công trình nghiên cứu đã đạt được những kết quả và đóng góp khoa học nổi bật:

• Thiết lập thành công quy trình công nghệ xanh trích ly hoạt chất polyphenol từ lá Hoàn Ngọc bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn kết hợp đồng dung môi ethanol, khắc phục nhược điểm của các phương pháp chiết xuất truyền thống.
• Xây dựng hoàn chỉnh mô hình tối ưu hóa Box - Behnken với độ tương thích cao có giá trị F bằng 475,52 và p nhỏ hơn 0,0001, xác định chính xác điều kiện tối ưu tại 350 bar, 60 °C, 2,5 giờ và 20 mL ethanol để thu nhận hàm lượng polyphenol đạt 13,165 mg GAE/g.
• Cung cấp bằng chứng thực nghiệm qua ảnh FE-SEM chứng minh sự phá vỡ cấu trúc mô tế bào lá dưới tác động của lưu chất siêu tới hạn, giải thích rõ cơ chế truyền khối và khuếch tán hoạt chất.
• Khẳng định giá trị dược lý toàn diện của cao trích lá Hoàn Ngọc thông qua khả năng trung hòa gốc tự do DPPH, kháng khuẩn trên cả hai chủng vi khuẩn E. coli, S. aureus và ức chế mạnh mẽ hai dòng tế bào ung thư A549, MCF-7.
• Hoàn thành toàn bộ mục tiêu nghiên cứu đúng tiến độ đề ra, mở ra định hướng phát triển quy mô pilot 10 đến 50 lít và thử nghiệm tiền lâm sàng trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tới nhằm thương mại hóa nguồn dược liệu tự nhiên của Việt Nam.

Độc giả và các đơn vị nghiên cứu quan tâm đến quy trình công nghệ trích ly xanh cũng như các ứng dụng dược liệu của cây Hoàn Ngọc có thể liên hệ trực tiếp với nhóm tác giả tại Trường Đại học Bách Khoa - Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh để thảo luận hợp tác học thuật và chuyển giao công nghệ.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về Hoàn Ngọc Giới thiệu chung Hoàn Ngọc có tên khoa học (Pseuderanthemum palatiferum (Nees)., Ralk) thuộc họ Ô rô (Acanthaceae). Cây Hoàn Ngọc có tên gọi khác là Xuân Hoa, Nhật Nguyệt và Trạc mã Thần tượng linh [1]. Cây Hoàn Ngọc là cây thuốc bản địa của Việt Nam và được phát hiện lần đầu tiên trong rừng Cúc Phương, miền Bắc Việt Nam vào cuối những năm 1990.

Cây Hoàn Ngọc được định danh như sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Thực vật có hoa (Angiospermae) Lớp: Hai lá mầm thực sự (Eudicots) Bộ: Hoa môi (Lamiales) Họ: Ô rô (Acanthaceae) Chi: Xuân hoa (Pseuderanthemum) Loài: Xuân hoa vòm (Pseuderanthemum palatiferum) Đặc điểm hình thái Cây Hoàn Ngọc là dạng cây bụi, cao từ 1 – 2 m, phần gốc hoá gỗ màu nâu, thân non màu xanh lục, chia nhiều cành mảnh như thể hiện ở hình 1. Hoa lưỡng tính, 5 lá đài rời tồn tại đến khi tràng hợp, màu trắng, ống tràng hẹp và dài khoảng 2,5 cm như thể hiện ở hình 1. Quả nang, hai ô, mỗi ô chứa hai hạt. Cây ra hoa từ tháng 4–5.

Lá có phiến thon, lá mọc đối, có cuống, phiến lá hình lưỡi mác, hai đầu nhọn, dài 12–17 cm, rộng 3,5–5 cm như thể hiện hình 1.1: (a) Cây, (b) hoa và (c) lá Hoàn Ngọc Thành phần hóa học Thành phần hóa học của Hoàn Ngọc gồm nhiều hợp chất như phenolic, phytosterol, lipit, saponin có thể góp phần tạo nên các hoạt tính sinh học như ức chế tăng trưởng tế bào ung thư, hỗ trợ điều trị tiểu đường, hạ huyết áp, chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa. Hàm lượng một số hoạt chất được trích ly bằng các phương pháp khác nhau được trình bày ở bảng 1.1: Thành phần hóa học của cây Hoàn Ngọc Hợp chất Hàm lượng Phương pháp trích ly Tài liệu tham (mg/g) khảo Phenolic tổng 40,94 ± 0,52 Trích ly chất lỏng có áp suất [3] 32,25 ± 0,46 Trích ly chất lỏng có áp Flavonoid tổng suất 20,21 ± 0,42 Nước siêu tới hạn [4] Saponin tổng 2,23 ± 0,14 Enzyme [5] Protein 104,66 ± 7,63 Nước siêu tới hạn [3] Kaempferol 0,63 ± 0,02 Soxhlet 4 1. Polyphenol Lá Hoàn Ngọc chứa nhiều các hoạt chất có hoạt tính sinh học thuộc nhóm polyphenol [6, 7]. Polyphenol là các hợp chất mà phân tử chứa nhiều vòng benzen, trong đó có một, hai hoặc nhiều nhóm hydroxyl.

Là hợp chất chuyển hóa thứ cấp có mặt trong hầu hết các loài thực vật, polyphenol đa dạng về cấu trúc từ các hợp chất có cấu trúc đơn giản như vanilin, axit gallic và axit chlorogenic đến các polyphenol như stibene, flavonoid và lignan [8]. Chỉ riêng nhóm flavonoid đã phát hiện được hơn 8000 cấu trúc phân tử và danh sách này vẫn liên tục được bổ sung. Điều đó đã cho thấy sự đa dạng và phân bố rộng lớn của hợp chất polyphenol trong cấu trúc thực vật. Dựa vào đặc trưng của cấu trúc hóa học mà hợp chất polyphenol được chia thành ba nhóm chính như ở hình 1.2: Phân loại polyphenol Nhóm phenolic được chú ý bởi khả năng chống oxy hóa, khả năng chuyển electron trong chuỗi hô hấp bình thường trong ty thể vì phenolic có khả năng tạo phức bền với các kim loại, do đó làm mất hoạt tính của các gốc tự do đồng thời nhóm phenolic còn có khả năng trung hoà các gốc tự do làm ngừng các quá trình tạo gốc tự do.

Ngoài ra, các axit gallic và axit chlorogenic góp phần vào khả năng kháng khuẩn, hấp thụ tia cực tím, phòng tránh các bệnh về tim mạch và xơ vữa động mạch (nghiên cứu trên chuột), khả năng ngăn ngừa ung thư, ngăn ngừa những ảnh hưởng bất lợi của độc tố 5 nấm đến sức khỏe con người. Công thức hoá học của axit gallic và axit chlorogenic được thể hiện như hình 1.3: Công thức hóa học của axit gallic Hình 1.4: Công thức hóa học của axit chlorogenic 1. Các thành phần khác Các nguyên tố đa lượng và vi lượng trong lá cây Hoàn Ngọc khá cao so với các loại cây khác. Không phát hiện các nguyên tố kim loại nặng như Cd, Pd, As, Cr.

Đáng chú ý là hàm lượng Vanadi khá cao (3,75 mg/100 g lá tươi). Ngoài ra, lá Hoàn Ngọc còn chứa đầy đủ các axit amin thiết yếu với hàm lượng tổng số khá cao (751 đến 1365 mg). Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá Hoàn Ngọc có chứa β-Sitosterol, Phytol, 3- O-(β-D glucopyranosyl)-Sitosterol, hỗn hợp hai đồng phân epime stigmasterol và poriferasterol, n-pentacosan-1-ol và hỗn hợp của kaumpferol 3-methyl ether 7-O- β- glucoside, apigenin 7-O-β-glucoside, 1-triacontanol, glycerol 1-hexdecanoate, axit palmitic và acid salicylic [10]. Nguyễn Văn Hùng và cộng sự (2004) [4], đã phân lập được tiếp theo là 1-triacontanol, glycerol 1-hexdecanoate, axit palmitic và axit salicylic.

Công dụng Theo kinh nghiệm dân gian, lá Hoàn Ngọc chữa được nhiều loại bệnh như:  Rối loạn tiêu hóa, viêm loét dạ dày, tá tràng: Mỗi lần 7 lá, ngày 2 lần, dùng trong 3 ‒ 5 ngày; 6  Điều trị các bệnh về gan như xơ gan, viêm gan, bằng cách lấy khoảng 10 lá Hoàn Ngọc tươi rửa sạch rồi nhai kỹ, hoặc ăn sống khi bụng đói mỗi ngày 3 lần. Đối với lá khô thì nên nghiền thành bột rồi hòa với bột tam thất theo tỷ lệ 1:1. Mỗi lần người bệnh uống 1 muỗng cà phê với nước ấm. Uống với liều 3 lần/ngày;  Ngoài các tác dụng chữa trị trên người, lá Hoàn Ngọc còn được dùng để trị nhiễm khuẩn đường tiêu hóa như tiêu chảy, lỵ trực khuẩn, viêm đại tràng mãn tính, chữa bệnh cho gia súc như tiêu chảy ở lợn và ở gia cầm, làm tăng hồng cầu, tăng hàm lượng hemoglobin và tăng trọng lượng của lợn con sau cai sữa và giảm tỷ lệ còi cọc.

Theo các nghiên cứu khoa học về dược lý của lá Hoàn Ngọc:  Hỗ trợ điều trị các chứng bệnh như gan nhiễm mỡ, u xơ, huyết áp, tiểu đường, nhiễm khuẩn và rối loạn chức năng theo nghiên cứu của Viện Nghiên cứu Quốc tế và Nông nghiệp Fuchu (Nhật Bản) phối hợp với Đại học Cần Thơ vào năm 2001.  Theo nghiên cứu của Viện Hóa học công bố trên Tạp chí Y tế Thế giới của Đức Plant Medica vào năm 2001, lá Hoàn Ngọc có tác dụng hỗ trợ ngăn ngừa, hạn chế sự phát triển của khối u ác tính. Bên cạnh đó, công trình nghiên cứu của Đại học Chiang Mai, Thái Lan đã chỉ ra dịch chiết ethanol từ lá Hoàn Ngọc tươi có khả năng ức chế tế bào ung thư vú MDA-MB-231 ở người, hỗ trợ trong điều trị ung thư và khắc phục được những tác dụng phụ do thuốc gây ra.  Các nhà khoa học thuộc khoa Y, Đại học Hồng Kông đã tiến hành nghiên cứu và cho kết quả, lupeol làm giảm số lượng tế bào ung thư, đồng thời ngăn chặn quá trình trao đổi chất xung quanh khối u, từ đó ngăn ngừa khả năng di căn mà không gây độc với các tế bào khoẻ mạnh.

Hoạt tính sinh học của lá Hoàn Ngọc Kháng oxy hóa Hiện nay ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất chống oxy hóa thứ cấp từ thực vật như là nguồn bổ sung cho các hệ thống bảo vệ chống lại sự oxy hóa có hại tồn tại sẵn có trong cơ thể. Trong quá trình hô hấp chúng đã tạo ra các hợp chất trung gian là các gốc tự do anion superoxide, hydroxyl, chất oxy hóa như H2O2 có hoạt tính phản ứng rất lớn, mà từ các chất này cũng như các sản phẩm phản ứng của gốc tự 7 do là nguyên nhân phá hủy các phân tử sinh học như axit deoxyribonucleic (ADN), lipit và protein. Mặc dù bản thân của sinh vật đã tự phát triển các hệ thống enzyme nhằm điều hòa các loại phân tử oxy hoạt tính cao này như superoxide dismutase, catalae, glutathione peroxidase là các enzyme điều hòa nhằm duy trì sự an toàn trong giới hạn cho phép của anion superoxide, H2O2. Đôi khi hệ thống bảo vệ bị quá tải, không khí bị ô nhiễm, khói thuốc lá, bức xạ tử ngoại các loại oxy hoạt tính cao này vượt quá giới hạn cho phép sẽ là nguồn gây bệnh, thúc đẩy nhanh quá trình lão hóa như thể hiện ở hình 1.

Các chất chống oxy hóa từ thực vật góp phần hỗ trợ cho hệ thống bảo vệ của cơ thể, ngăn chặn oxy hóa không mong muốn như các phenolic, carotenoid, flavonoid, vitamin C, E và các hợp chất trao đổi chất thứ cấp từ thực vật. HÌNH THÀNH Viêm Tia UV GỐC TỰ DO Tổn thương ADN Ty thể trao đổi chất Ô nhiễm Bức xạ ion không khí Thuốc lá Hình 1.5: Nguyên nhân gây ra gốc tự do Vitamin C hay axit ascorbic là một chất bắt gốc tự do phổ biến. Vitamin C có thể thay đổi thành gốc ascorbate (hình 1.6) bằng cách cho một điện tử cho gốc lipit để kết thúc chuỗi phản ứng peroxit hóa. Các cặp gốc ascorbat phản ứng nhanh chóng tạo ra một phân tử ascorbat và một phân tử dehydroascorbat.

Dehydroascorbate không có bất kỳ khả năng chống oxy hóa nào. Do đó, dehydroascorbate được chuyển đổi trở lại thành ascorbate bằng cách thêm hai điện tử. Giai đoạn cuối cùng của việc bổ sung hai electron vào dehydroascorbate được thực hiện bởi oxyoreductase (một enzym xúc tác cho quá trình chuyển điện tử từ một phân tử, chất khử, còn được 8 gọi là chất cho điện tử, sang một phân tử khác, chất oxy hóa, còn được gọi là chất nhận điện tử).6: Phản ứng trung hòa gốc tự do của axit ascorbic Kháng ung thư Khả năng ức chế tế bào ung thư của các hoạt chất có thể là do quá trình apoptosis [17]. Apoptosis là quá trình đóng vai trò thiết yếu trong sự phát triển và tồn tại bằng cách loại bỏ tế bào bị hư hỏng hoặc không mong muốn.

Một loạt các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng, hầu hết các chất hóa trị diệt khối u gây ra quá trình apoptosis ở các tế bào. Các hợp chất như triterpenoid và polyphenol đã được chứng minh là gây ra quá trình apoptosis ở một số dòng tế bào ung thư, đồng thời không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường. Tuy cơ chế phân tử mà hoạt chất gây ra quá trình apoptosis vẫn chưa được làm rõ, nhưng một số cơ chế có thể liên quan bao gồm ức chế hoạt động của DNA topoisomerase I/II, tăng mức độ oxy hoá và phá huỷ màng ty thể, điều hoà con đường truyền tín hiệu, giải phóng cytochrome C với sự kích hoạt tiếp theo 9 của caspase ‒ 9 và caspase ‒ 3, điều hòa giảm biểu hiện Bcl ‒ 2, nhưng thúc đẩy biểu hiện Bax và Bak, kích hoạt endonuclease và ức chế Mcl ‒ 1 protein [18]. Kháng khuẩn Các hợp chất có trong lá Hoàn Ngọc xâm nhập vào tế bào và màng tế bào và tác động lên protein nội bào, enzyme, ADN (hình 1.