Khám Phá Hoạt Tính Sinh Học Của Cây Khổ Sâm Bắc Bộ

Tài liệu nghiên cứu Đề tài công nghệ nghiên cứu một số phản ứng chuyển hóa với hợp chất ent kauran diterpenoid phân lập, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Trường học: Trường Đại Học
• Chuyên ngành: Hóa Học
• Đề tài: Khám Phá Hoạt Tính Sinh Học Của Cây Khổ Sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis)
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep.)
• 1.2. Vài nét về terpen và diterpen

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Cây Khổ Sâm Bắc Bộ Croton tonkinensis

Cây khổ sâm Bắc Bộ, hay còn gọi là Croton tonkinensis, là một loài thực vật thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Loài cây này có chiều cao từ 0,7 đến 1 mét, với lá hình mũi mác và cụm hoa mọc ở kẽ lá. Cây khổ sâm Bắc Bộ không chỉ có giá trị về mặt thực vật học mà còn nổi bật với hoạt tính sinh học phong phú, được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị nhiều bệnh lý khác nhau.

1.1. Đặc Điểm Sinh Thái Của Cây Khổ Sâm Bắc Bộ

Cây khổ sâm Bắc Bộ thường mọc hoang và được trồng ở nhiều tỉnh phía Bắc Việt Nam. Cây có thể được trồng bằng hạt hoặc cành vào mùa xuân. Thời điểm thu hái tốt nhất là khi cây đang ra hoa, sau đó được phơi khô hoặc sấy khô để bảo quản.

1.2. Thành Phần Hóa Học Của Cây Khổ Sâm

Cây khổ sâm Bắc Bộ chứa nhiều hợp chất hữu ích, đặc biệt là các ent-kauran diterpenoid. Những hợp chất này đã được nghiên cứu và chứng minh có hoạt tính kháng sinh và kháng viêm, góp phần vào việc điều trị nhiều bệnh lý.

II. Vấn Đề Và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Hoạt Tính Sinh Học

Mặc dù cây khổ sâm Bắc Bộ có nhiều tiềm năng, nhưng việc nghiên cứu hoạt tính sinh học của nó vẫn gặp nhiều thách thức. Các nghiên cứu hiện tại chủ yếu tập trung vào việc chiết xuất và phân lập các hợp chất từ cây, nhưng chưa đủ để hiểu rõ cơ chế hoạt động của chúng.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Chiết Xuất Hợp Chất

Quá trình chiết xuất các hợp chất từ cây khổ sâm Bắc Bộ thường gặp khó khăn do sự đa dạng của các hợp chất có trong cây. Việc lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo thu được các hợp chất có hoạt tính cao.

2.2. Thiếu Thông Tin Về Cơ Chế Hoạt Động

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng của cây khổ sâm, nhưng thông tin về cơ chế hoạt động của các hợp chất vẫn còn hạn chế. Điều này gây khó khăn trong việc phát triển các sản phẩm từ cây khổ sâm cho y học.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hoạt Tính Sinh Học Của Cây Khổ Sâm

Để nghiên cứu hoạt tính sinh học của cây khổ sâm Bắc Bộ, các nhà khoa học đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau. Các phương pháp này không chỉ giúp phân lập các hợp chất mà còn đánh giá hoạt tính của chúng trên các mô hình sinh học.

3.1. Phương Pháp Chiết Xuất Hợp Chất

Phương pháp chiết xuất thường sử dụng dung môi hữu cơ như methanol hoặc ethanol để thu được các hợp chất từ lá cây. Sau đó, các hợp chất này được phân tích bằng các kỹ thuật sắc ký để xác định cấu trúc và hoạt tính.

3.2. Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học

Hoạt tính sinh học của các hợp chất được đánh giá thông qua các thử nghiệm in vitro và in vivo. Các thử nghiệm này giúp xác định khả năng kháng vi sinh vật và tác dụng chống viêm của các hợp chất từ cây khổ sâm.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Cây Khổ Sâm Bắc Bộ

Cây khổ sâm Bắc Bộ đã được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị nhiều bệnh lý như viêm loét dạ dày, đau bụng và các bệnh ngoài da. Nghiên cứu gần đây cho thấy nước sắc từ lá cây có tác dụng kháng nấm và kháng vi khuẩn, mở ra hướng đi mới cho việc phát triển thuốc từ thiên nhiên.

4.1. Tác Dụng Chữa Bệnh Của Cây Khổ Sâm

Cây khổ sâm Bắc Bộ được sử dụng để điều trị mụn nhọt, lở ngứa và viêm mũi. Nước sắc từ lá cây có thể được dùng để rửa vết thương, giúp làm sạch và giảm viêm.

4.2. Nghiên Cứu Về Tác Dụng Kháng Sinh

Nghiên cứu cho thấy các hợp chất từ cây khổ sâm có khả năng kháng sinh đối với một số vi khuẩn gây bệnh. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các loại thuốc kháng sinh mới từ thiên nhiên.

V. Kết Luận Và Tương Lai Của Nghiên Cứu Cây Khổ Sâm

Nghiên cứu về cây khổ sâm Bắc Bộ đang ngày càng được chú trọng. Với hoạt tính sinh học phong phú và tiềm năng ứng dụng cao, cây khổ sâm có thể trở thành nguồn dược liệu quý giá trong tương lai. Cần tiếp tục nghiên cứu để khai thác triệt để giá trị của loài cây này.

5.1. Triển Vọng Nghiên Cứu Trong Tương Lai

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc làm rõ cơ chế hoạt động của các hợp chất từ cây khổ sâm. Điều này sẽ giúp phát triển các sản phẩm dược phẩm hiệu quả hơn.

5.2. Khuyến Khích Sử Dụng Cây Khổ Sâm Trong Y Học

Việc khuyến khích sử dụng cây khổ sâm Bắc Bộ trong y học cổ truyền và hiện đại có thể giúp nâng cao sức khỏe cộng đồng. Cần có các chương trình giáo dục để nâng cao nhận thức về giá trị của loài cây này.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Việt Nam sở hữu hệ thực vật nhiệt đới gió mùa vô cùng đa dạng với hơn 12.000 loài thuộc hơn 300 họ thực vật khác nhau, tạo ra nguồn dược liệu tự nhiên phong phú phục vụ y học cổ truyền và hiện đại. Trong số các loài cây thuốc quý, cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep.), thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), là loại cây bụi nhỏ cao từ 0,7 đến 1,0 m, lá dài 5 đến 10 cm, từ lâu đã được nhân dân sử dụng theo kinh nghiệm dân gian với liều lượng 15 đến 20 lá mỗi ngày nhằm điều trị viêm loét dạ dày tá tràng, kiết lỵ và mụn nhọt. Tuy nhiên, việc khai thác giá trị dược lý của loài cây này vẫn chủ yếu dừng lại ở dạng kinh nghiệm truyền thống mà chưa có nhiều nghiên cứu toàn diện về quy trình chiết tách chuẩn hóa và chuyển hóa hóa học bán tổng hợp để tạo ra các phân tử có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm vượt trội.

Vấn đề nghiên cứu trọng tâm của luận văn là tối ưu hóa quy trình phân lập các hợp chất tự nhiên nhóm ent-kauran diterpenoid từ lá khổ sâm Bắc Bộ, đồng thời thực hiện các phản ứng chuyển hóa hóa học có định hướng trên các nhóm chức của khung phân tử nhằm tạo ra các dẫn xuất mới có tiềm năng dược lý cao. Mục tiêu cụ thể bao gồm việc phân lập sạch các ent-kauran diterpenoid tự nhiên từ 1,0 kg bột lá khô, thực hiện chuỗi 7 phản ứng chuyển hóa hóa học (bao gồm epoxi hóa, mở vòng epoxit, thủy phân kiềm, axetyl hóa và oxy hóa), sau đó xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên 8 chủng vi khuẩn và nấm chuẩn. Phạm vi nghiên cứu thực nghiệm được triển khai từ nguồn mẫu thu hái tại khu vực Hà Nội vào tháng 9 năm 2004 và tiến hành phân tích tại phòng thí nghiệm chuyên sâu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình thể hiện qua việc phát hiện các dẫn xuất bán tổng hợp có khả năng ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus với nồng độ ức chế tối thiểu đạt 12,5 µg/ml, mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các hoạt chất kháng sinh và kháng nấm nguồn gốc thiên nhiên.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên Terpenoid và lý thuyết hóa học lập thể của khung sườn cacbon hữu cơ. Quá trình sinh tổng hợp các diterpenoid C20 bắt nguồn từ tiền chất geranylgeranyl pyrophosphat (GGPP) dưới sự xúc tác tuần tự của 2 enzyme chính là ent-kaurene synthase A (đóng vòng tạo ent-copalyl diphosphat) và ent-kaurene synthase B (phân bố lại hệ vòng để tạo khung ent-kauran). Cấu trúc của diterpenoid bao gồm hơn 170 dạng khung cacbon khác nhau, trong đó 7 dạng khung chính (labdan, clerodan, kauran, pimaran, abietan, cembran, gibberellan) chiếm khoảng 50% tổng số diterpenoid đã biết trên thế giới.

Khung lý thuyết thứ hai được áp dụng là lý thuyết mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học (Structure-Activity Relationship - SAR). Khung ent-kauran chứa hệ 4 vòng perhydrophenanthren ngưng tụ với vòng 5 cạnh cyclopentan, trong đó trung tâm phản ứng tạo hoạt tính thường tập trung ở nhóm exomethylen liên hợp carbonyl C-16/C-17 và vị trí oxy hóa C-15. Bên cạnh đó, nghiên cứu vận dụng 4 khái niệm cốt lõi: khái niệm về diterpenoid thiên nhiên, cơ chế phản ứng chuyển hóa bán tổng hợp hữu cơ, phương pháp giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (1D và 2D NMR), và khái niệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trong đánh giá hoạt tính sinh học kháng khuẩn, kháng nấm.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ 1,0 kg mẫu bột lá cây khổ sâm Bắc Bộ thu hái đúng thời kỳ ra hoa vào tháng 9 năm 2004 tại Hà Nội. Phương pháp chọn mẫu là chọn mẫu có chủ đích kết hợp phân tầng theo chu kỳ sinh trưởng của thực vật nhằm đảm bảo hàm lượng hoạt chất diterpenoid đạt mức cao nhất. Bột lá khô được sấy ổn định ở 40 đến 50 °C, ngâm chiết hồi lưu 2 lần với 3 đến 4 lít metanol khan ở nhiệt độ phòng, cô đuổi dung môi còn 650 ml dịch chiết đậm đặc rồi phân bố lỏng - lỏng với 1,0 lít n-hexan và 1,0 lít diclometan.

Quy trình phân tách 15 gam cặn chiết diclometan được thực hiện bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển (CC) sử dụng 10 gam chất hấp phụ silica gel cỡ hạt 0,063 đến 0,100 mm với hệ dung môi rửa giải n-hexan - axeton tỷ lệ tăng dần độ phân cực, thu được 80 phân đoạn (150 ml mỗi phân đoạn). Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập và dẫn xuất bán tổng hợp được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại bao gồm phổ hồng ngoại FT-IR ghi trên máy Nicolet Impact 410, phổ khối lượng EI-MS, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), DEPT trên thiết bị Bruker Avance 500. Hoạt tính kháng sinh được đánh giá thông qua phương pháp vi pha loãng trên phiến vi lượng 96 giếng đối với 8 chủng vi sinh vật chuẩn (bao gồm 2 chủng Gram âm, 2 chủng Gram dương, 2 chủng nấm mốc và 2 chủng nấm men) theo quy chuẩn quốc tế. Toàn bộ quá trình thực nghiệm, tổng hợp và đo đạc sinh học được triển khai đồng bộ theo timeline nghiên cứu kéo dài 12 tháng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân lập từ 15 gam cặn chiết diclometan đã thu được 3 hợp chất ent-kauran diterpenoid tự nhiên tinh khiết gồm: hợp chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (chất 1 kết tinh hình kim trắng, điểm nóng chảy 176 đến 178 °C) và hỗn hợp đồng kết tinh của hai chất ent-1α,14α-diacetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-one (chất 7) và ent-1α,7β-diacetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-one (chất 8).

Thực hiện thành công chuỗi 7 phản ứng chuyển hóa hóa học trên các hợp chất tự nhiên phân lập được, tạo ra 10 dẫn xuất bán tổng hợp mới với hiệu suất chuyển hóa cao:

1. Phản ứng epoxi hóa chất 1 và hỗn hợp chất 7 và chất 8 bằng axit m-cloroperbenzoic (MCPBA) ở -10 °C trong 3 ngày tạo thành dẫn xuất epoxit 159 (Rf = 0,35) và hỗn hợp epoxit 160, 161.
2. Phản ứng mở vòng epoxit bằng dung dịch NaOH 2,5% trong metanol đun hồi lưu trong 2 giờ tạo thành dẫn xuất diol 162 (Rf = 0,65).
3. Phản ứng thủy phân bằng phức BF3.Et2O trong 5 phút tạo dẫn xuất 163 (Rf = 0,32).
4. Phản ứng thủy phân toàn phần nhóm axetat bằng dung dịch KOH 15% ở 70 đến 80 °C trong 12 giờ tạo các dẫn xuất polyhydroxy 164 và 165 (Rf = 0,53).
5. Phản ứng axetyl hóa và oxy hóa chọn lọc tạo ra dẫn xuất axetat 166 và các dẫn xuất diketone 167, 168 (Rf = 0,41).

Về hoạt tính sinh học kháng vi sinh vật kiểm định, dẫn xuất oxy hóa 167 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus mạnh nhất với giá trị MIC đạt 12,5 µg/ml, tăng hiệu lực ức chế lên gấp 4 lần (tương đương mức cải thiện hoạt tính 300%) so với hợp chất tự nhiên ban đầu (chất 1 có MIC = 50 µg/ml). Dẫn xuất 168 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chọn lọc trên cả chủng vi khuẩn Gram âm Escherichia coli với MIC = 25 µg/ml và Staphylococcus aureus với MIC = 50 µg/ml. Dẫn xuất axetyl hóa 166 cho hoạt tính kháng nấm mốc Aspergillus niger vượt trội với MIC = 25 µg/ml, giảm 50% nồng độ ức chế so với chất 1 tự nhiên (MIC = 50 µg/ml).

Thảo luận kết quả

Sự gia tăng hoạt tính sinh học của các dẫn xuất bán tổng hợp được giải thích dựa trên sự thay đổi điện tích và độ phân cực không gian của phân tử. Khi chuyển hóa nhóm hydroxyl bậc hai ở vị trí C-7 thành nhóm carbonyl ở dẫn xuất 167 và 168, phân tử hình thành hệ thống diketone liên hợp và làm tăng độ ưa mỡ cục bộ, tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt chất thâm nhập qua lớp màng kép phospholipid của vi khuẩn Staphylococcus aureus và Escherichia coli. Ngược lại, việc mở vòng epoxit hoặc thủy phân hoàn toàn các nhóm axetat thành polyol (ở các hợp chất 164, 165) làm tăng độ phân cực quá mức, dẫn đến suy giảm khả năng tương tác với đích sinh học nội bào.

So sánh với các công bố quốc tế về diterpenoid từ các loài thuộc chi Isodon và Croton, các hợp chất tự nhiên từ khổ sâm Bắc Bộ thể hiện dải hoạt tính tương đồng với các ent-kauranoid ức chế nhân tố phiên mã NF-κB ở dải IC50 từ 0,07 đến 0,42 µg/ml và gây độc tế bào ung thư K562 ở IC50 từ 0,09 đến 8,2 µg/ml. Toàn bộ dữ liệu về độ dịch chuyển hóa học trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR và các giá trị nồng độ ức chế MIC có thể được trực quan hóa sinh động thông qua bảng ma trận cấu trúc - phổ đối chiếu 20 đỉnh cacbon của khung diterpenoid, kết hợp cùng biểu đồ cột thể hiện sự chênh lệch phần trăm hiệu lực kháng khuẩn giữa các dẫn xuất bán tổng hợp so với hợp chất tự nhiên.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp và khuyến nghị ứng dụng thực tiễn mang tính hành động cao:

1. Chuẩn hóa quy trình chiết tách xanh quy mô pilot: Các viện nghiên cứu hóa dược cần tiến hành tối ưu hóa dung môi chiết xuất, áp dụng phương pháp chiết hỗ trợ siêu âm hoặc vi sóng nhằm giảm thiểu 30% lượng dung môi hữu cơ metanol và rút ngắn 50% thời gian ngâm chiết, hoàn thiện quy trình trong thời gian 12 tháng do Viện Hóa học chủ trì.
2. Mở rộng thử nghiệm dược lý chuyên sâu in vivo: Nhóm nghiên cứu Dược học cần phối hợp với các trung tâm kiểm nghiệm để thử nghiệm hoạt tính chống ung thư trên 3 dòng tế bào biểu mô (Hep-G2, Hela, K562) và đánh giá độc tính cấp LD50 trên mô hình động vật chuột nhắt trắng, đặt mục tiêu xác định giá trị IC50 dưới 5,0 µg/ml trong lộ trình 18 tháng.
3. Quy hoạch và xây dựng vùng trồng dược liệu đạt chuẩn GACP-WHO: Bộ Y tế kết hợp với chính quyền địa phương tại các tỉnh phía Bắc (như Phú Thọ, Bắc Giang, Vĩnh Phúc) quy hoạch vùng trồng khổ sâm Bắc Bộ tập trung với diện tích 15 đến 20 hecta, kiểm soát chặt chẽ thời điểm thu hái vào tháng 8 đến tháng 9 hàng năm nhằm nâng hàm lượng diterpenoid trong lá lên trên 1,5% trong khung thời gian 24 tháng.
4. Phát triển danh mục dẫn xuất kauranoid thế hệ mới: Các trường đại học khối Hóa - Dược cần tiếp tục thiết kế và bán tổng hợp thêm 15 đến 20 dẫn xuất cấu trúc mới tập trung vào các phản ứng gắn cầu thế dị vòng hoặc este hóa định hướng, phấn đấu tạo ra ít nhất 2 ứng viên tiền lâm sàng có MIC kháng khuẩn dưới 5,0 µg/ml trong giai đoạn 36 tháng tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu cung cấp khối lượng dữ liệu thực nghiệm và lý thuyết chuyên sâu, phù hợp với 4 nhóm đối tượng người đọc:

1. Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa hợp chất thiên nhiên: Luận văn là tài liệu tham khảo mẫu mực về kỹ thuật chạy sắc ký cột phân đoạn, quy trình phân lập tinh thể, cũng như phương pháp phân tích, quy kết chi tiết các tín hiệu phổ 1D và 2D NMR trên khung cacbon phức tạp.
2. Chuyên viên nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các doanh nghiệp dược phẩm: Cung cấp quy trình bán tổng hợp tối ưu hóa cấu trúc phân tử từ nguồn nguyên liệu thực vật sẵn có, giúp định hướng tạo ra các hoạt chất kháng sinh tự nhiên thay thế các kháng sinh tổng hợp đang bị kháng thuốc.
3. Giảng viên và nhà khoa học giảng dạy ngành Dược học, Hóa dược: Sử dụng luận văn làm học liệu thực hành giảng dạy về mối quan hệ giữa biến đổi cấu trúc hóa học (SAR) và hoạt tính sinh học trên các chủng vi khuẩn, nấm kiểm định.
4. Các bác sĩ y học cổ truyền và kỹ sư nông nghiệp dược liệu: Nắm bắt cơ sở khoa học hiện đại chứng minh cho các bài thuốc dân gian từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ, từ đó áp dụng đúng thời điểm thu hái và liều lượng chuẩn xác trong điều trị bệnh đường tiêu hóa và nhiễm trùng ngoài da.

Câu hỏi thường gặp

1. Hợp chất ent-kauran diterpenoid trong cây khổ sâm Bắc Bộ có điểm gì khác biệt so với các diterpen thông thường? Hợp chất ent-kauran từ cây khổ sâm Bắc Bộ sở hữu khung cấu trúc 20 nguyên tử cacbon với cấu hình không gian đối triền (enantiomer), chứa nhóm chức exomethylen liên hợp carbonyl tại vị trí C-15 và C-16. Cấu trúc đặc thù này là trung tâm phản ứng alkyl hóa sinh học, tạo ra hoạt tính ức chế mạnh mẽ đối với các dòng tế bào vi khuẩn và tế bào khối u với các giá trị IC50 dưới 1,0 µg/ml.

2. Tại sao cần thực hiện các phản ứng chuyển hóa bán tổng hợp trên các chất tự nhiên phân lập được? Nhiều hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học nhưng độ tan kém hoặc độc tính cao. Việc tiến hành các phản ứng chuyển hóa hóa học có kiểm soát (như epoxi hóa, axetyl hóa, oxy hóa) giúp điều chỉnh độ phân cực, tăng tính thân dầu hoặc thân nước, từ đó nâng cao hiệu lực ức chế vi sinh vật từ 2 đến 4 lần so với tiền chất tự nhiên ban đầu.

3. Phương pháp phổ nào giữ vai trò quan trọng nhất trong việc xác định cấu trúc các dẫn xuất mới? Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C-NMR ở tần số cao 500 MHz kết hợp kỹ thuật DEPT đóng vai trò then chốt. Dựa trên độ dịch chuyển hóa học delta và hằng số tương tác spin-spin J, các nhà nghiên cứu xác định chính xác số lượng nguyên tử cacbon bậc 1, bậc 2, bậc 3, bậc 4 và vị trí không gian của các nhóm thế axetat, hydroxyl, carbonyl trong phân tử.

4. Hiệu quả kháng khuẩn của các dẫn xuất bán tổng hợp thay đổi như thế nào so với hợp chất gốc? Các dẫn xuất oxy hóa và axetyl hóa thể hiện sự vượt trội rõ rệt. Cụ thể, dẫn xuất 167 đạt giá trị MIC = 12,5 µg/ml trên vi khuẩn Staphylococcus aureus, mạnh gấp 4 lần so với chất 1 (MIC = 50 µg/ml). Đồng thời, dẫn xuất 166 đạt MIC = 25 µg/ml kháng nấm Aspergillus niger, giảm 50% liều ức chế so với hoạt chất tự nhiên.

5. Luận văn có thể ứng dụng trực tiếp vào việc sản xuất thuốc thương mại không? Kết quả của luận văn cung cấp bằng chứng khoa học tiền lâm sàng vững chắc về cấu trúc và hoạt tính kháng sinh in vitro. Để chuyển giao sang sản xuất thương phẩm, quy trình cần trải qua giai đoạn thử nghiệm độc tính in vivo, tối ưu hóa công thức bào chế và hoàn thiện quy trình kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn Dược điển trong giai đoạn tiếp theo.

Kết luận

• Luận văn đã thiết lập thành công quy trình chiết tách và phân lập 3 hợp chất ent-kauran diterpenoid tự nhiên từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ thu hái tại Hà Nội.
• Thực hiện thành công 7 phản ứng chuyển hóa hóa học trên khung ent-kauranoid, tổng hợp được 10 dẫn xuất mới và xác định đầy đủ cấu trúc hóa học bằng hệ thống phổ hiện đại (NMR 500 MHz, FT-IR, MS).
• Phát hiện các dẫn xuất bán tổng hợp tiềm năng cao với hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus đạt MIC = 12,5 µg/ml (tăng 300% hiệu lực) và kháng nấm Aspergillus niger đạt MIC = 25 µg/ml.
• Công trình đã đóng góp cơ sở dữ liệu khoa học quý giá về hóa học các hợp chất thiên nhiên Việt Nam, chứng minh giá trị dược lý hiện đại của cây thuốc cổ truyền.
• Lộ trình 24 đến 36 tháng tới cần tập trung mở rộng thử nghiệm độc tính tế bào ung thư in vivo và xây dựng quy trình tổng hợp quy mô bán công nghiệp.

Quý độc giả, các nhà nghiên cứu và học viên quan tâm có thể tiếp tục khai thác các dữ liệu thực nghiệm trong luận văn để mở rộng hướng nghiên cứu phát triển thuốc mới từ nguồn tài nguyên dược liệu bản địa Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep.1 Thực vật học [1, 2] Cây khổ sâm Bắc Bộ có tên khoa học là Croton tonkinensis Gagnep. thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Hình 1: Cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) Khổ sâm Bắc Bộ là cây nhỏ, cao độ 0,7-1 m. Lá mọc cách hay gần như mọc đối, có khi mọc thành vòng giả gồm 3-6 lá.

Lá hình mũi mác, mép nguyên dài 5-10 cm, rộng 1-3 cm. Cả hai mặt lá đều có lông hình khiên óng ánh (kiểu lông ở lá cây nhót) nhưng mặt dưới nhiều hơn ở mặt trên. Khi phơi khô mặt lá ở dưới có màu trắng bạc, mặt trên có màu nâu đen. Cụm hoa mọc ở kẽ lá hay đầu cành, lưỡng tính hay đơn tính.

2 Hoa đực có 5 lá đài,12 nhị. Hoa cái có 5 lá đài, 3 vòi nhị. Quả gồm 3 mảnh vỏ màu hung đỏ.2 Nơi sống và thu hái [1] Cây khổ sâm Bắc Bộ mọc hoang và được trồng ở khắp nơi, trong các vườn gia đình hoặc vườn thuốc, chủ yếu ở các tỉnh phía bắc Việt Nam. Thường trồng bằng gieo hạt hay trồng bằng cành vào mùa xuân.

Thu hái khi cây đang có hoa, đem phơi hoặc sấy khô, khi dùng đem sao vàng.3 Hoạt tính và công dụng của cây khổ sâm Bắc bộ [1, 2] Cây khổ sâm Bắc Bộ được dùng trong dân gian làm thuốc chữa mụn nhọt, lở ngứa, viêm mũi, lỵ, đau bụng, viêm loét dạ dày, tá tràng, tiêu hoá kém. Ngày dùng 15-20 lá sao vàng, dạng thuốc sắc, dụng ngoài lấy nước sắc đặc để rửa. Gần đây, cây khổ sâm Bắc Bộ được chú ý nhiều do lá cây dùng trong đơn thuốc chữa bệnh đau dạ dày kết hợp với các vị thuốc khác (lá bồ công anh Lactuca indica và lá khôi Ardisia sylvestris) hoặc dùng riêng dưới dạng nước sắc. Nước sắc khổ sâm Bắc Bộ trong thực nghiệm có tác dụng kháng một số nấm ngoài da.

Khổ sâm Bắc Bộ có tác dụng kháng sinh đối với trực khuẩn lỵ đồng thời có tác dụng kháng lỵ amip, làm cho đơn bào co thành kén. Tác dụng đối với ký sinh trùng sốt rét: nước sắc của bài thuốc gồm Khổ sâm và vỏ Bưởi có tác dụng ức chế ký sinh trùng sốt rét mạnh trên động vật thí nghiệm được gây nhiễm sốt rét, nhưng tái phát trong thời gian 10 ngày theo dõi trên mô hình thực nghiệm chuột nhắt nhiễm Plasmodium berghei và gà nhiễm Plasmodium gallinaceum.4 Các ent-kauran diterpenoid của cây khổ sâm Bắc bộ Năm 2000, Phan Tống Sơn và cộng sự đã công bố quốc tế một diterpen mới từ lá cây khổ sâm. Bằng các phương pháp phổ đã xác định cấu trúc của diterpen này là ent-7β-hydroxy-15-oxo kaur-16-en-18-yl axetat (1) [5, 33]. Chất này có hoạt tính 3 kháng kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum in vitro.

Nhóm tác giả trên tiếp tục đánh giá hoạt tính của diterpen với ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum (với cả chủng nhạy và chủng kháng cloroquin) tác dụng gây độc đối với một số tế bào ung thư (Hep-G2, RD, FI, VR), tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật kiểm định [7]. CH3 CH2 H O H OH CH3COOCH2 CH3 1 Trong nghiên cứu tiếp theo của Phan Minh Giang và cộng sự [19] bốn ent- kaurane diterpen gồm hai chất đã biết, ent-7α,14β-dihydroxykaur-16-en-15-one (2) và ent-18-acetoxy-7α-hydroxykaur-16-en-5-one (3) và hai chất mới, ent-1β-acetoxy-7α, 14β-dihydroxykaur-16-en-15-one (4) và ent-18-acetoxy-7α,14β-dihydroxykaur-16-en- 15-one (5) đã được phân lập từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ. Các ent-kauranoid này ức chế nhân tố phiên mã NF-ĸB và sự sản xuất NO được hoạt hoá bằng LPS trong đại thực bào RAW264.7 của chuột ở IC50 = 0,07 - 0,42 µg/ml. R1 2 R1 =H, R2 =H, R3 =OH R3 3 R1 =H, R2 =OAc, R3 =H O OH R2 4 R1 =OAc, R2 =H, R3 =OH 5 R1 =H, R2 =OAc, R3 =OH Năm 2004, ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-ol (6) cũng đã được phân lập từ cây khổ sâm Bắc Bộ [30].

4 H O OH H HO 6 Tiếp đó, Phan Minh Giang và cộng sự đã công bố cấu trúc của 4 ent-kauran diterpen mới, ent-1α,14α-diacetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-one (7), ent-1α,7β- diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-one (8), ent-18-acetoxy-14α-hydroxykaur-16- en-15-one (9) và ent-(16S)-18-acetoxy-7β-hydroxy kauran-16-en-15-one (10) [20]. R1 R4 H H O O R3 OH H H R2 AcO R1 R2 R3 R4 10 7 OAc H OH OAc 8 OAc H OAc OH 9 H OAc H OH Năm 2005, có 6 ent-kauran diterpenoid mới được phân lập từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ đó là các chất ent-7β -acetoxy-11α-hydroxykaur-16-en-15-one (11), ent-18- acetoxy-11α-hydroxykaur-16-en-15-one (12), ent-11α-acetoxykaur-16-en-18-oic acid (13), ent-15α,18-dihydroxykaur-16-ene (14), ent-11α,18-diacetoxy-7β -hydroxykaur- 5 16-en-15-one (15), and ent-(16S)-1α,14a-diacetoxy-7β -hydroxy-17-methoxykauran- 15-one (16) [21]. R1 R2 R3 R4 R5 11 H H OAc H OH 12 H OAc H H OH 15 H OAc OH H OAc Ba diterpenoid với cấu trúc ent-kaur-16-ene, en-11α-acetoxy-7β, 14α dihydroxykaur-16-en-15-one (17), ent-18–hydroxykaur-16-ene (18) và ent-kaur-16- en- 15-oxo-18-oic acid (19) đã được phân lập từ phần chiết metanol lá khô cây khổ sâm Bắc Bộ bằng phương pháp tách sắc ký cột lần lượt trên silica gel, ODS gel, và HPLC pha đảo [18]. AcO H H OH H O O H H OH HOOC H HO 17 18 19 1.2 Vài nét về terpen và diterpen [3, 25] Khái niệm “terpen” được dùng để chỉ một lớp hợp chất thiên nhiên có cấu trúc có thể phân chia ra thành các đơn vị isopren.

Căn cứ vào số đơn vị isopren hợp thành 6 người ta phân biệt các monoterpen C 10, sesquiterpen C15, diterpen C20, sesterterpen C25, triterpen C30, tetraterpen C40 và polyterpen. Bên cạnh thuật ngữ “terpen” người ta còn dùng khái niệm “terpenoit” để bao hàm rộng rãi các sản phẩm thoái biến tự nhiên, thí dụ các ionon và các dẫn xuất tự nhiên cũng như tổng hợp của các terpen, thí dụ các terpen - ancol, -andehit, -xeton, - axit, - este, - epoxit, v.v… Tuy nhiên trong khi sử dụng thường không có sự phân chia ranh giới thật rõ rệt giữa các khái niệm “terpen” và “terpenoid” như vừa nêu. Thuật ngữ terpen nhiều khi được dùng để bao hàm các terpen – hidrocacbon lẫn các dẫn xuất của chúng. Các diterpenoid hợp thành một nhóm lớn các hợp chất C-20 được dẫn ra từ geranyl geraniol pyrophotphat.

Chúng chủ yếu xuất hiện trong các loài nấm hoặc trong thực vật và bao gồm các axít nhựa và các hocmon sinh trưởng thực vật nhóm gibberellin. Các diterpenoid có một số nét riêng đặc trưng. Sự oxi hoá thường hay xảy ra hơn ở các nhóm trong phân tử và ta thấy xuất hiện nhiều phản ứng tạo ete hoặc lacton. Các tương tác giữa các nhóm không liên kết trực tiếp với nhau thường làm cho khung cacbon bị biến dạng và dẫn tới nhiều chuyển vị lý thú.

Đa số các diterpen là hợp chất vòng. Đối với các diterpen chủ yếu kiểu đóng vòng để hình thành các dẫn xuất của perhidronaphtalen và perhidrophenantren. Có hai kiểu đóng vòng : Kiểu 1: Đóng vòng do sự proton hoá nối đôi của đơn vị isopropyliden xuất phát. Kiểu thứ nhất thuộc về cùng dãy lập thể với steroid.

Kiểu 2: Nhóm pyrophotphat rời khỏi phân tử cho một cacbacation và khai mào cho phản ứng đóng vòng. 7 Từ các tiền thân không vòng, thông qua các kiểu đóng vòng khác nhau mà dẫn đến các hệ thống khung vô cùng phong phú của các terpen cũng như diterpen. Chẳng hạn ngày nay ta đã biết đến trên 170 khung cacbon của các diterpen, trong số đó có 7 khung (hình 1) chiếm khoảng 50% các diterpen được biết, khung labdan chiếm số lượng lớn nhất. cembran labdan clerodan kauran pimaran abietan gibberellan Hình 2: Một số khung của các diterpen Các diterpen có hoạt tính sinh học vô cùng phong phú: Điển hình là các hocmon sinh trưởng thực vật dãy gibberellin.

Người ta đã phân lập và tinh chế được axít gibberellic từ nấm Gibberella fujikuroi tác dụng đặc trưng cho sự phát triển bình thường của cây. Các axít nhựa thuộc vào số các sản phẩm thiên nhiên xuất hiện với lượng lớn. Chúng có tác dụng cố kết các sợi gỗ, đặc biệt là các axít nhựa có nhóm phenolic có hoạt tính kháng sinh nhẹ và bảo vệ cho gỗ khỏi bị vi sinh vật làm mục nát (axít 8 podocarpic và axít ferruginol). Nhựa copan hình thành khi một số cây nhiệt đới mục nát có tác dụng bảo vệ cây.

Diterpen pleu-romutilin phân lập từ cây Pleurotus mutilus có hoạt tính kháng khuẩn. Ngoài ra nhiều hợp chất diterpenoid còn có tác dụng kìm hãm sự phát triển của khối u (ví dụ quinon-methin), hoặc là những hợp chất có độc tính nguy hiểm (ví dụ taxin 1 ở cây thuỷ tùng). Từ nhựa của Fabiana densa Remy var. ramulosa Wedd đã tách được hai diterpen mới: ent-beyer-15-en-18-O-succinat (20) và ent-beyer-15-en-18-O-oxalat (21).

Hai hợp chất này có hoạt tính kháng vi trùng đối với Escherichia coli (ATCC 8739), Klebsiella pneumoniae, Salmonella aviatum (ATCC 2228), Pseudomonas aerug-inosa (ATCC 14207), Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), Micrococeus flavus (ATCC 10290), Bacillus subtilis (ATCC 6633), Saccharomyces cerevisiae [16]. R O H2C CH3 Phần chiết CH2Cl2 của lá Croton zambesicus (Euphorbiaceae) gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư biểu mô tử cung. Từ phần chiết này đã tách được một trachyloban diterpen, ent-trachyloban-3β-ol (22) với hoạt tính độc tế bào dòng tế bào Hela, IC50=7,3 µg/ml [14].3 Khái quát về kauran và ent-kauran Các kauran tồn tại ở hai dạng: dạng ent và phyllocladane. Phần lớn kauran ở dạng ent, ít phổ biến hơn là phyllocladan có cầu metylen ở vị trí đối diện so với nhóm metyl ở C-10.

12 12 11 13 11 13 20 17 17 20 9 14 16 9 14 16 1 1 2 10 8 2 10 8 H 15 H 15 3 5 7 3 5 7 4 6 4 6 H H 19 18 19 18 ent-kauran phyllocladan 1.1 Sinh tổng hợp các ent-kauran Ent-kauran được hình thành từ geranylgeranyldiphosphat (GGPP) dưới tác dụng xúc tác của 2 enzym [22]. Enzym ent-kaurene synthase (A) (copalyl PP synthase) xúc tác đóng vòng tạo thành (-)-copalyl PP (ent-copalyl diphosphat). 10 OPP enzym(A) OPP H H GGPP (-)-copalyldiphosphat 2. Enzym ent-kaurene synthase (B) xúc tác để (-)-copalyl PP (ent-copalyl diphosphat) tiếp tục đóng vòng và phân bố lại.

OPP + i ii H H GGPP H H ( ) copalyl diphosphat (ent copalyl diphosphat ) + + H H H H H H H ent kaurene 1.2 Các nghiên cứu chuyển hóa các ent-kauran diterpenoid Năm 2007, Ronan Batista cùng các đồng sự đã tổng hợp thành công một ent- kauran glycosid mới bằng phản ứng Koeings-Knorr từ axit kaurenoic và 2,3,4,6-tetra- O-acetyl-glucopyranosyl bromid, theo sự thủy phân nhóm axetat [13]. 11 Hình 3: Sơ đồ tổng hợp alcol kauran 25 và 26 12 Hình 4: Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất kauran 32a/b từ alcol kauran 25 13 Hình 5: Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất kauran 33-38 từ alcol kauran 26 Năm 2008, Silvia Marquina cùng với các cộng sự đã tiến hành hydroxyl hóa các diterpen axit ent-kaur-16-en-19-oic và axit ent-beyer-15-en-19-oic bằng phương pháp vi sinh sử dụng vi nấm Aspergillus niger [29].