Đặt vấn đề Họ Na (Annonaceae) là một trong những họ lớn của ngành Mộc lan (Magnoliophyta) [1]. Họ Na hiện nay có 135 chi với khoảng 2500 loài phân ố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong khi chỉ một ít loài phát hiện có ở vùng ôn đới [2]. Nhiều loài trong họ Na đƣợc sử dụng làm gỗ, làm thực phẩm hay làm cây cảnh. Ngoài ra, giá trị về tài nguyên cây thuốc của họ Na cũng rất lớn, đã đƣợc sử dụng nhiều trong y học cổ truyền để chữa các ệnh ngoài da, cảm cúm, xƣơng khớp hay các ệnh về gan… [3].
Ở Việt Nam, theo quyển “Cây cỏ Việt Nam” xuất ản năm 2000, Giáo sƣ Phạm Hoàng Hộ đã ghi nhận họ Na có 155 loài thuộc 28 chi [4]. Từ năm 2000 đến nay, nhiều nhà thực vật học đã phát hiện và công ố thêm nhiều loài mới cho khoa học cũng nhƣ ghi nhận thêm một số loài mới cho hệ thực vật Việt Nam, do đó đã nâng tổng số loài thuộc họ Na hiện có ở Việt Nam là 183 loài thuộc 29 chi, 2 phân loài và 21 thứ [2, 5-10]. Đến thời điểm hiện tại, trên thế giới, nhiều loài thuộc họ Na đã đƣợc nghiên cứu về đa dạng di truyền, thành phần hóa học cũng nhƣ hoạt tính sinh học [11-16]. Tuy nhiên, ở Việt Nam, ngoài các nghiên cứu điều tra về thành phần loài thì các nghiên cứu khác về họ Na chủ yếu tập trung vào khảo sát thành phần hóa học của tinh dầu ly trích từ một số loài có tinh dầu của họ này [17-19].
Vì những lí do trên nên chúng tôi chọn đề tài “Khảo sát tính đa dạng di truyền các loài thuộc họ Na (Annonaceae) ở khu ảo tồn thiên nhiên Bình Châu-Phƣớc Bửu ằng marker phân tử” nhằm nghiên cứu đặc điểm di truyền của các loài họ Na phân ố ở khu ảo tồn này thông qua hai vùng trình tự thuộc hệ gen lục lạp là matK và trnL-F. Ngoài ra, nghiên cứu này cũng lần đầu cho thấy thành phần hóa học, khả năng kháng khuẩn, kháng oxi hóa và kháng tế ào ung thƣ của cao chiết acetone ly 1 trích từ lá của các loài họ Na thu thập ở Khu ảo tồn thiên nhiên Bình Châu-Phƣớc Bửu. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát tính đa dạng di truyền các loài thuộc họ Na, nghiên cứu về thành phần và hoạt tính sinh học của cao chiết acetone ly trích từ lá các loài thuộc họ Na ở KBTTN Bình Châu-Phƣớc Bửu, nội dung cụ thể nhƣ sau: - Xác định đặc điểm di truyền cho các loài họ Na thông qua vùng chỉ thị phân tử matK và trnL-F. - Xác định thành phần hóa học của cao chiết acetone ly trích từ lá của các loài nghiên cứu.
- Xác định khả năng kháng vi sinh vật của cao chiết acetone ly trích từ lá của các loài nghiên cứu. - Xác định khả năng kháng oxi hóa của cao chiết acetone ly trích từ lá của các loài nghiên cứu. - Xác định khả năng kháng dòng tế ào ung thƣ gan HepG2 của cao chiết acetone ly trích từ lá của các loài nghiên cứu. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu Trong đề tài này, chúng tôi thực hiện các thí nghiệm trên mƣời loài thuộc họ Na thu thập ở KBTTN Bình Châu - Phƣớc Bửu.
- Thời gian: từ tháng 04/2021 đến 03/2022. - Địa điểm nghiên cứu: Nhà F, Viện Công nghệ Sinh Học và Thực Phẩm, Trƣờng Đại học Công Nghiệp TP. HCM, 12 Nguyễn Văn Bảo, Phƣờng 4, Gò Vấp, Tp. Hồ Chí Minh.
2 Phạm vi nghiên cứu - Giải trình tự hai chiều, xây dựng cây phát sinh loài của các loài nghiên cứu. - Xác định đƣợc thành phần, hoạt tính sinh học, giá trị dƣợc liệu của cao chiết từ lá các loài nghiên cứu. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Thông qua việc khảo sát tính đa dạng di truyền ằng xác định mã vạch DNA, giải trình tự hai chiều, xây dựng cây phát sinh loài của các loài nghiên cứu nhằm ảo tồn đa dạng sinh học, nhất là các loài hiếm thuộc họ này ở KBTTN Bình Châu-Phƣớc Bửu. Xác định đƣợc thành phần và hoạt tính sinh học, cũng nhƣ khả năng kháng vi sinh vật, kháng tế ào ung thƣ của cao chiết acetone từ lá các mẫu nghiên cứu để đề xuất các chất kháng khuẩn, kháng oxi hóa và kháng ung thƣ mới có nguồn gốc từ họ Na.
3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan về khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu-Phƣớc Bửu Khu ảo tồn thiên nhiên Bình Châu-Phƣớc Bửu là khu rừng nguyên sinh ven iển duy nhất tƣơng đối nguyên vẹn của Việt Nam còn giữ đƣợc thảm rừng tự nhiên. Nơi đây ghi nhận đƣợc 732 loài thực vật và 205 loài động vật có xƣơng sống, trong đó có những loài đang đƣợc xếp trong sách đỏ Việt Nam. Khu BTTN này có tổng diện tích là 10.537 ha với phía Bắc giáp với rừng cao su, phía Đông giáp với huyện Hàm Tân, tỉnh Bình Thuận, phía Tây giáp với tỉnh lộ 328 và phía Nam giáp với tuyến đƣờng ven iển. Khu BTTN này có tọa độ địa lý 10°28‟ đến 10°38‟N và từ 107°25‟ đến 107°36‟E.
Nơi đây đƣợc chia làm 3 phân khu: Phân khu ảo vệ nghiêm ngặt (5.017 ha), phân khu phục hồi sinh thái (5.286 ha) và phân khu dịch vụ hành chính (63 ha) [20]. Khu BTTN Bình Châu – Phƣớc Bửu đƣợc chia thành 4 dạng chính: (1) Phần lớn diện tích của khu ảo tồn có địa hình thấp từ 3-5m so với mực nƣớc iển; (2) Đồi núi trong khu ảo tồn có 3 cụm đồi thấp gồm Cụm Hồng Nhung (118 m) ở phía Bắc, cụm Hồ Linh (162 m) ở phía Nam, và cụm Mộ Ông (120 m) ở về phía Tây; (3) Lòng chảo trũng chủ yếu ở phía Bắc và các ƣng, hồ rải rác có nƣớc quanh năm hoặc cạn vào mùa khô; (4) Cồn cát ven iển: chạy dài 12 km dọc theo ờ iển phía Nam khu ảo tồn. Nhìn chung, khí hậu ở đây mang đặc điểm của dải khí hậu ven iển Nam Trung ộ và có rất ít sông suối trong khu ảo tồn, nhƣng lại có một số àu nƣớc, nhƣ Bàu Nhám, Bàu Tròn, Hồ Cốc, Hồ Linh và Suối nƣớc nóng Bình Châu [21].2 Tổng quan về họ Na (Annonaceae) Phân loại khoa học: Giới Plantae (Thực vật) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) 4 Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Ngọc lan (Magnoliidae) Bộ Ngọc lan (Magnoliales) Họ Na (Annonaceae) Họ Na (Annonaceae) – là họ lớn nhất của ộ Magnoliales [22]. Trên thế giới, thành phần loài họ Na đã công ố khoảng 135 chi với khoảng 2.500 loài phân ố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chỉ một ít loài phát hiện có ở vùng ôn đới, trong đó khoảng 900 loài ở châu Mỹ, 42 chi với 450 loài ở châu Phi, 51 chi với 950 loài ở châu Á và châu Úc [2].
Ngƣời đầu tiên nghiên cứu về họ Na ở Việt Nam là Loureiro trong quyển “Thực vật chí Nam Bộ” xuất ản năm 1793. Trong công trình này, tác giả đã ghi nhận họ Na có 4 chi và 8 loài phân ố ở Nam Bộ [23]. Tài liệu “Thực vật rừng Nam Bộ” của Pierre xuất ản năm 1880 cũng đã giới thiệu thêm nhiều loài họ này có ở Nam Bộ [24]. Tƣơng tự, Ast (1940) đã công ố nhiều loài mới của họ này ở Đông Dƣơng, trong đó có Việt Nam [25].
Nguyễn Tiến Bân (2000) trong “Thực vật chí Việt Nam” đã đƣa ra hệ thống phân loại và ghi nhận 21 loài, 1 phân loài và 8 thứ cho họ Na ở Việt Nam [22]. Bên cạnh đó, Phạm Hoàng Hộ xuất ản công trình khoa học “Cây cỏ Việt Nam” năm 2000 mô tả đƣợc 156 loài, 26 chi của họ này [4]. Tiếp đến, các nhà thực vật học điều tra, thống kê ở các khu vực trên cả nƣớc và phát hiện ra nhiều loài mới trong họ Na. Năm 2005, Meade nghiên cứu chi Uvaria ở Đông Nam Á đã mô tả và công ố 1 loài mới là Uvaria vietnamensis với mẫu vật thu ở Quảng Trị [26].
Weerasooriya và cộng sự tu chỉnh chi Mitrephora và đã công ố thêm 4 loài mới thuộc chi Mitrephora ở Việt Nam gồm M. Đến năm 2009, Wang và cộng sự đã phát hiện, mô tả loài mới là loài Dasymaschalon acuminatum ở Tây Nguyên [28]. Ngoài ra, từ năm 2000 đến nay, các nhà thực vật học đã phát hiện và công ố nhiều loài mới cho khoa học cũng nhƣ ghi nhận thêm một số loài mới cho Việt Nam, do đó đã 5 nâng tổng số loài thuộc họ Na hiện có ở Việt Nam là 183 loài thuộc 29 chi, 2 phân loài và 21 thứ [2, 5-10].3 Nghiên cứu họ Na (Annonaceae) trên thế giới và ở Việt Nam 1.1 Nghiên cứu trên thế giới 1.1 Về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Năm 2013, Taha và cộng sự đã xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ốn loài thuộc họ Na gồm Pseuduvaria macrophylla, P. Theo đó, nghiên cứu đã cho thấy các hợp chất đƣợc phân lập từ các loài trong chi này chủ yếu là alkaloid oxoaporphin và diterpenes thể hiện hoạt tính sinh học mạnh nhƣ gây độc tế ào, chống tăng sinh tế ào, kháng khuẩn, chữa lao và sốt rét [11].
Ở một nghiên cứu khác, một lƣợng lớn flavonoid, alkcaloid và acetogenin từ các loài Annonaceae thuộc 6 chi là Artabotrys, Fissistigma, Pseuduvaria, Mitrella, Monocarpia và Phaeanthus. Các chất chiết xuất từ lá, vỏ cây, hạt của các loài trên có hiệu quả cao trong chống nấm, kháng khuẩn, chống sốt rét, chống HIV và điều trị ung thƣ [12]. Năm 2015, Costa lần đầu xác định đƣợc thành phần hóa học của cao chiết vỏ thân cây loài Annona pickelii và đã xác định ốn hợp chất steroid (β-sitostenone, β- sitosterol, stigmasterol, campesterol), ba hợp chất lignans (eudesmin, magnolin, yangambin), mƣời hai hợp chất alkaloid (liriodenine, lysicamine, atherospermidine, anonaine, analobine, asimilobine, discretamine, stepholidine, coclaurine, orientaline, juziphine và stepharine) và một hợp chất benzenoid (axit 2- metoxybenzoic). Ngoài ra, Costa cũng cho thấy các hợp chất có trong cao chiết methanol của loài A.
pickelii nhƣ lignans (eudesmin, magnolin, yangam in) và alkaloid (discretamine) có khả năng chống nấm và chống oxy hóa rất hiệu quả [13]. Đồng thời, tác giả này năm 2017 cũng lần đầu nghiên cứu thành phần hóa học cao chiết từ lá của loài Annona vepretorum cho thấy loài A. vepretorum chứa ốn hợp chất, một triterpene (lupeol acetate), hai steroid (β sitosterol và stigmasterol) và một flavonoid glycosyl hóa (rutin). Bốn hợp chất trên có ý ngh a to lớn trong y học ứng 6 dụng kháng khuẩn, kháng viêm, an thần, điều trị khối u uồng trứng, u đại trực tràng và u nguyên ào thần kinh đệm ở ngƣời [14].