Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong lĩnh vực hóa học các hợp chất tự nhiên, các chất chuyển hóa thứ cấp từ thực vật đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu phát triển dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng. Tại Việt Nam, cây cà phê là một trong những cây trồng công nghiệp chủ lực, mang lại giá trị kinh tế xuất khẩu cao. Tuy nhiên, chuỗi giá trị hiện nay hầu như chỉ tập trung khai thác hạt cà phê thương phẩm. Khi vườn cây bước vào giai đoạn già cỗi, năng suất suy giảm, thân cây cà phê thường bị chặt bỏ, sử dụng làm chất đốt hoặc củi than với hiệu quả kinh tế thấp. Các nghiên cứu hóa thực vật trước đây trong nước và quốc tế chủ yếu tập trung vào hạt, lá hoặc vỏ quả cà phê; dữ liệu về thành phần hóa học của phần thân gỗ cây cà phê hầu như chưa được khảo sát có hệ thống. Nhằm mục đích tận dụng nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp này, gia tăng giá trị kinh tế cho chuỗi sản xuất cà phê và đóng góp dữ liệu cho ngành hóa học các hợp chất tự nhiên, đề tài "Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn H4 của cao hexane điều chế từ thân cây cà phê Robusta" đã được thực hiện.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể theo 7 nội dung đánh số trong văn bản:

  1. Tìm hiểu các thông tin về cây cà phê: Mô tả thực vật, công dụng, hoạt tính sinh học và thành phần hóa học;
  2. Thu hái và xử lý nguyên liệu;
  3. Điều chế cao tổng methanol bằng phương pháp ngâm dầm và phương pháp trích nóng;
  4. Điều chế các cao thành phần: Cao hexane, cao ethyl acetate và cao methanol;
  5. Phân tách các phân đoạn cao hexane;
  6. Phân lập hợp chất từ phân đoạn H4 cao hexane;
  7. Xác định cấu trúc hợp chất cô lập được bằng các phương pháp phổ nghiệm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Thân cây cà phê Robusta (Coffea robusta, tên khoa học tương đương Coffea canephora).
  • Không gian thu mẫu: Mẫu thân cây cà phê được thu hái tại huyện Di Linh, tỉnh Lâm Đồng, từ những cây có độ tuổi khoảng 20 năm, nguồn gốc cây giống canh tác rõ ràng.
  • Thời gian nghiên cứu: Mẫu nguyên liệu được thu thập vào tháng 8 năm 2018. Khóa luận được giao thực hiện từ ngày 01/03/2019 và hoàn thành ngày 22/07/2019 tại Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh.
  • Phạm vi chuyên môn: Đề tài giới hạn việc phân tách sâu trên phân đoạn ký hiệu H4 (khối lượng 8,8822 g), được chia tách từ cao hexane của dịch chiết ngâm dầm methanol thân cây cà phê Robusta.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết của đề tài dựa trên phân loại thực vật học họ Cà phê (Rubiaceae) và hóa thực vật học các hợp chất triterpenoid. Cơ sở lý thuyết về cấu trúc phân tử tập trung vào khung triterpene 5 vòng (pentacyclic triterpenoids), đặc biệt là khung oleanane (olean-12-ene). Tác giả đối chiếu các thông số cộng hưởng từ hạt nhân với cơ sở dữ liệu phổ 13C-NMR của pentacyclic triterpenoids từ công trình của Mahato và Kundu (1994), dữ liệu triterpenes của Sheppark và Chan (1992), cùng các tài liệu phương pháp luận cô lập hợp chất hữu cơ và giải đoán phổ NMR của Nguyễn Kim Phi Phụng (2005, 2007).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

  • Xử lý nguyên liệu: Thân cây được loại bỏ tạp chất, sâu bệnh, rửa sạch, chặt nhỏ, phơi khô, sấy ở nhiệt độ 60–80 °C đến khối lượng không đổi và xay thành bột mịn.
  • Phương pháp chiết xuất: Áp dụng song song hai phương pháp chiết để so sánh hiệu suất thu cao tổng methanol: phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng và phương pháp đun hồi lưu (trích nóng) ở nhiệt độ sôi của dung môi.
  • Phương pháp chiết phân bố lỏng – rắn: Tách cao thô tổng thành các cao phân đoạn có độ phân cực tăng dần bằng cách hòa tan lần lượt trong n-hexane, ethyl acetate và methanol.
  • Phương pháp sắc ký:
    • Sắc ký lớp mỏng (SKLM): Sử dụng bản mỏng silica gel pha thường TLC Silica gel 60 F254 (độ dày 250 μm, Merck) và bản mỏng pha đảo TLC Silica gel 60 RP18 F254 S (độ dày 200 μm, Merck) để thăm dò hệ dung môi giải ly và kiểm tra độ tinh khiết.
    • Sắc ký cột (SKC): Sử dụng hạt silica gel pha thường cỡ 0,040–0,063 mm (HiMedia), chất hấp phụ pha đảo LiChroprep RP18 cỡ 0,040–0,063 mm (Merck), và chất rây phân tử Sephadex LH-20 (GE Healthcare).
    • Thuốc thử hiện vết: Bản mỏng sau khi triển khai được soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, sau đó nhúng dung dịch hiện vết gồm vanillin 1% và H2SO4 20% trong ethanol, rồi sấy nóng để phát hiện màu sắc đặc trưng của các vết chất.
  • Phương pháp phổ nghiệm: Cấu trúc phân tử được xác định thông qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều (1D và 2D-NMR), bao gồm 1H-NMR, 13C-NMR, 1H–1H COSY, HSQC và HMBC. Phổ được đo trên máy Bruker Avance tại tần số 500 MHz (đối với proton) và 125 MHz (đối với carbon-13), sử dụng dung môi deuterochloroform (CDCl3), chuẩn nội tín hiệu dung môi dư tại δH 7,26 ppm và δC 77,2 ppm tại Phòng Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM. Cấu trúc hóa học mới được tra cứu đối chiếu trên hệ thống cơ sở dữ liệu SciFinder tại Đại học Chulalongkorn (Thái Lan).

Hóa chất và thiết bị sử dụng:

  • Hóa chất dung môi tinh khiết: n-Hexane (C6H14, 99%), chloroform (CHCl3, 99%), ethyl acetate (CH3COOC2H5, 99,5%), acetone (CH3COCH3, 99,7%), methanol (CH3OH, 99,7%) của hãng Chemsol; nước cất 100%.
  • Thiết bị phòng thí nghiệm: Cân kỹ thuật và cân phân tích Precisa, tủ sấy Memmert, máy cô quay thu hồi dung môi áp suất giảm Heidolph và Yamato, bếp cách thủy Memmert, hệ thống đun hoàn lưu Greentecco, buồng soi tia tử ngoại bước sóng 254 nm và 365 nm.

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học về cây cà phê từ lịch sử, đặc điểm thực vật học đến thành phần hóa học:

  • Nguồn gốc và phân bố: Cây cà phê khởi nguồn từ Ethiopia, du nhập sang Ả Rập, châu Âu và được đưa vào Việt Nam từ năm 1888 tại Kẻ Sở (Bắc Kỳ). Cà phê được canh tác tại miền Bắc (Tuyên Quang, Lạng Sơn, Ninh Bình), miền Trung (Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị) và tập trung diện tích lớn nhất tại vùng Tây Nguyên. Thế giới có hai loài mang ý nghĩa kinh tế chủ yếu: Coffea arabica (cà phê chè, chiếm 61% sản lượng) và Coffea canephora / Coffea robusta (cà phê vối, chiếm gần 39% sản lượng); các loài Coffea liberica, Coffea excelsa (cà phê mít) chiếm tỷ trọng không đáng kể.
  • Hình thái cây cà phê Robusta: Hệ rễ gồm rễ cọc, rễ trụ (ăn sâu 1,0–2,5 m giúp cây đứng vững và hút nước tầng sâu), rễ ngang và rễ tơ (tập trung ở tầng đất 0–30 cm để hút dinh dưỡng). Thân cây tự nhiên cao 6–8 m nhưng khi trồng trọt được hãm ngọn ở mức 2–3 m; thân già có nhiều u nần sần sùi. Lá hình bầu dục, dài 10–15 cm, rộng 6–8 cm. Hoa màu trắng, 5 cánh, nở chùm đôi hoặc ba, có hương thơm nhẹ. Quả hình bầu dục chứa 2 nhân hạt phẳng úp vào nhau; cấu trúc quả gồm 68% vỏ quả và thịt quả, 6% màng vỏ lụa và 26% hạt nhân.
  • Thành phần hóa học đã công bố: Vỏ quả tươi chứa 2,61% N, 0,81% P2O5, 2,38% K và 0,57% Ca. Hạt chứa caffeine (1), chlorogenic acid (3) (chiếm 4,5–11,1% ở hạt chưa rang và giảm khoảng 30% khi rang), caffeic acid (4), flavonoid, trigonelline, protein và lipid. Các nghiên cứu định danh mùi hương của Blank và Grosch (1991) chỉ ra cà phê Robusta đặc trưng bởi 2,3-diethyl-5-methylpyrazine (51), 4-ethylguaiacol (52), 3-methyl-2-buten-1-thiol (53). Trong nước, nghiên cứu của Nguyễn Quốc Nam Hải (2009) trên lá cà phê Arabica đã cô lập được 6 hợp chất gồm hexantriacontanol, β-sitosterol, stigmast-5,22-dien-24R-3β-ol, 3β-sitosteryl-1-O-β-D-glucopyranoside, acid lup-3β-hydroxy-12-en-28-oic và caffeine. Tổng quan chỉ ra chưa có công trình nghiên cứu nào đi sâu khảo sát thành phần hóa học từ thân cây cà phê Robusta.

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết toàn bộ các bước thao tác thực nghiệm từ chuẩn bị mẫu, chiết tách phân đoạn đến quy trình sắc ký phân lập hợp chất:

  • Chiết xuất cao tổng: Tổng khối lượng bột thân cây khô là 30 kg được chia thành hai phần:
    • Phần A (16 kg): Chiết bằng phương pháp ngâm dầm với methanol ở nhiệt độ phòng, chia mẻ 2 kg/bình, ngâm 2 ngày/lần, lặp lại 10 lần. Sau khi cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được 804,91 g cao thô methanol (ký hiệu MA).
    • Phần B (14 kg): Chiết bằng phương pháp trích nóng với methanol trong hệ thống đun hồi lưu (tỷ lệ 3 kg bột trong 20 lít dung môi/lần, thực hiện 3 lần). Dịch trích cô quay thu hồi dung môi, thu được 662,54 g cao thô methanol (ký hiệu MB).
  • Điều chế các cao phân đoạn từ cao MA (804,91 g): Cao thô MA được khuấy hòa tan liên tục với n-hexane; phần dịch hòa tan được cô quay thu được 349,41 g cao hexane. Phần bã không tan tiếp tục được hòa tan với ethyl acetate, cô quay thu được 277,44 g cao ethyl acetate. Bã còn lại được hòa tan hoàn toàn trong methanol, thu được 178,06 g cao methanol.
  • Phân tách cao hexane (349,41 g): Thực hiện sắc ký cột silica gel pha thường (sử dụng 1 kg silica gel nhồi cột, đường kính cột d = 7 cm, chiều dài cột L = 30 cm; 500 g silica gel để phối trộn mẫu khô; thể tích mỗi phân đoạn hứng là 250 mL). Hệ dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần: n-hexane:EtOAc (85:15), (8:2), (7:3), (5:5), EtOAc 100% và xả cột bằng MeOH 100%. Quá trình gom phân đoạn qua theo dõi SKLM cho kết quả 7 phân đoạn chính từ H1 đến H7.
Phân đoạn Phân đoạn hứng Khối lượng (g) Vết quan tâm trên SKLM (hệ giải ly)
H1 1–4 78,55 Rf = 0,65 (vết màu hồng đỏ, H:EtOAc 7:3)
H2 5–11 18,87 Rf = 0,48 (vết màu hồng, H:EtOAc 7:3)
H3 12–20 4,728 Rf = 0,31 và 0,37 (vết màu tím, H:EtOAc 7:3)
H4 21–40 8,8822 Nhiều vết, tách rõ khi giải ly H:EtOAc (9:1)
H5 41–48 3,5529 Rf = 0,26 (hồng) và 0,16 (tím) (H:EtOAc 6:4)
H6 49–61 5,6696 Rf = 0,29 (hồng tím) và 0,53 (tím) (H:EtOAc 4:6)
H7 62–90 14,5177 Nhiều vết, gộp chung vào cao EtOAc
  • Phân lập các chất từ phân đoạn H4 (8,8822 g):
    • Cột 1: Phân đoạn H4 (8,8822 g) được chạy SKC silica gel pha thường (160 g silica gel, 9 g silica gel trộn mẫu, d = 3,6 cm, L = 30 cm, bình hứng 50 mL), giải ly bằng hệ n-hexane:EtOAc (8:2 → 7:3 → 5:5 → 100% EtOAc → 100% MeOH), thu được 13 phân đoạn phụ; trong đó phân đoạn H4.4 (0,707 g) có các vết tách rõ rệt nhất.
    • Cột 2: Phân đoạn H4.4 (0,707 g) chạy SKC silica gel pha thường (20 g silica gel, 0,8 g nạp mẫu khô, d = 1,7 cm, L = 20 cm, bình hứng 5 mL) với hệ CHCl3:MeOH (98:2), thu được phân đoạn H4.1 (0,043 g) và H4.3 (0,1408 g).
    • Nhánh tinh chế hợp chất HN1 từ H4.1: Chạy SKC silica gel pha thường với CHCl3:EtOAc (9:1) thu được phân đoạn 0,04 g; tiếp tục qua cột Sephadex LH-20 với CHCl3:MeOH (1:4) thu được phân đoạn 0,03 g; sau đó tinh chế tiếp bằng SKC silica gel với CHCl3:EtOAc (7:3), thu được hợp chất HN1 tinh khiết (0,01 g; Rf = 0,5 trên SKLM).
    • Nhánh tinh chế hợp chất HN2 từ H4.3: Phân đoạn H4.3 (0,1408 g) chạy SKC silica gel pha thường với CHCl3:EtOAc (9:1) thu được 0,0326 g; cho qua cột Sephadex LH-20 thu được 0,024 g; cuối cùng chạy SKC pha đảo RP-18 (20 g chất hấp phụ, d = 1,7 cm, L = 20 cm, bình hứng 2 mL) với hệ dung môi acetone:nước (8:2), thu được hợp chất HN2 tinh khiết (0,081 g).

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chương 3 tập trung phân tích dữ liệu phổ nghiệm nhằm xác định cấu trúc phân tử của hai hợp chất phân lập được:

  • Biện giải cấu trúc hợp chất HN2 (oleanoic acid):

    • Hợp chất HN2 thu được dưới dạng chất rắn màu trắng đục, khối lượng 0,081 g. Trên bản mỏng sắc ký hiện vết màu nâu dưới đèn tử ngoại và có màu hồng cánh sen khi phản ứng với thuốc thử vanillin/H2SO4.
    • Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): Xuất hiện 7 mũi đơn (singlet) ứng với 7 nhóm methyl (-CH3) bậc ba tại δH 0,75; 0,77; 0,90; 0,91; 0,93; 0,99 và 1,13 ppm (mỗi mũi tích phân 3H). Một mũi ba (triplet) đặc trưng cho proton olefinic =CH- tại δH 5,28 ppm (1H, J = 3,4 Hz). Một mũi đôi đôi (doublet of doublets) của proton oxymethine >CH-OH tại δH 3,22 ppm (1H, J = 11,3; 4,2 Hz) và một mũi đôi đôi tại δH 2,82 ppm (1H, J = 13,7; 4,1 Hz) đặc trưng cho proton H-18.
    • Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): Thể hiện tín hiệu của 30 nguyên tử carbon. Trong đó có carbon của nhóm carboxyl -COOH tại δC 183,5 ppm (C-28); hai carbon olefinic tại δC 143,7 ppm (>C=, C-13) và 122,8 ppm (=CH-, C-12); một carbon mang nhóm hydroxyl >CH-OH tại δC 79,2 ppm (C-3); cùng 26 carbon thuộc vùng aliphatic từ 15,5 đến 53,4 ppm. Các tín hiệu này chỉ ra cấu trúc khung triterpene dạng oleanane.
    • Phổ 2D-NMR: Phổ HSQC xác định trực tiếp các cặp tương quan C-H qua một liên kết đơn. Phổ HMBC xác định: Proton oxymethine tại δH 3,23 ppm tương quan với C-23 (δC 28,3 ppm) và C-24 (δC 15,7 ppm), chứng minh nhóm -OH nằm ở vị trí C-3; proton olefinic tại δH 5,28 ppm tương quan với C-11 (δC 23,1 ppm), C-14 (δC 41,8 ppm), C-18 (δC 41,2 ppm) và nhóm methyl H-27 (δH 1,13 ppm) tương quan với C-13 (δC 143,7 ppm), xác định liên kết đôi tại C-12 và C-13; các proton H-18 (δH 2,82 ppm), H-16 (δH 1,97 ppm) và H-22 (δH 1,75 ppm) tương quan với carbon carboxyl δC 183,5 ppm, khẳng định nhóm -COOH ở vị trí C-28. Từ các dữ liệu này và so sánh với tài liệu tham khảo [10] của Mahato và Kundu (1994), hợp chất HN2 được xác định là oleanoic acid.

  • Biện giải cấu trúc hợp chất HN1 (3β-acetoxy-6β-hydroxy-olean-12-en-28-oic acid):

    • Hợp chất HN1 thu được dưới dạng chất rắn màu trắng đục, khối lượng 0,01 g. Trên bản mỏng sắc ký hiện vết màu nâu dưới đèn tử ngoại và vết màu tím đậm với thuốc thử vanillin/H2SO4.
    • Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): Thể hiện 7 nhóm methyl của khung triterpenoid tại δH 0,85; 0,90; 0,92; 0,95; 1,06; 1,09; 1,25; 1,32 ppm; một mũi đơn sắc nét của nhóm acetoxy -CO-CH3 tại δH 2,06 ppm (3H); một proton olefinic tại δH 5,31 ppm (t, 1H, J = 3,4 Hz); một proton oxymethine >CH-OH tại δH 4,53 ppm (s, 1H); một proton >CH-OAc tại δH 4,44 ppm (dd, 1H, J = 11,7; 4,2 Hz); và proton H-18 tại δH 2,82 ppm (dd, 1H, J = 13,8; 4,0 Hz).
    • Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): Xuất hiện 32 tín hiệu carbon gồm một nhóm acid carboxyl tại δC 183,7 ppm (C-28); một nhóm carbonyl ester >C=O tại δC 171,2 ppm kèm nhóm methyl ester tại δC 21,5 ppm (-CO-CH3); hai carbon nối đôi tại δC 142,7 ppm (>C=, C-13) và 122,6 ppm (=CH-, C-12); một carbon mang nhóm acetoxy >CH-OAc tại δC 80,8 ppm (C-3); một carbon mang nhóm hydroxyl >CH-OH tại δC 68,6 ppm (C-6); cùng 26 carbon bộ khung oleanane nằm trong khoảng δC 17,2 đến 55,9 ppm.
    • Phổ 2D-NMR: HMBC thể hiện tương quan giữa proton nhóm methyl acetoxy tại δH 2,06 ppm với carbon carbonyl δC 171,2 ppm và proton H-3 tại δH 4,44 ppm với C-3 (δC 80,8 ppm), chứng minh nhóm -OAc gắn ở C-3; proton tại δH 4,53 ppm tương quan với C-5 (δC 55,6 ppm) và C-7 (δC 40,6 ppm), xác định nhóm -OH gắn tại vị trí C-6; proton H-12 (δH 5,31 ppm) tương quan với C-11 và C-18 định vị nối đôi C-12=C-13; các proton H-18 (δH 2,82 ppm), H-16 (δH 2,01 ppm), H-22 (δH 1,75 ppm) tương quan với C-28 (δC 183,7 ppm) xác định nhóm -COOH ở vị trí C-28. Số liệu phổ tương thích với dẫn liệu của Sheppark và Chan (1992) [11]. Tra cứu qua SciFinder vào ngày 03/07/2019 khẳng định hợp chất 3β-acetoxy-6β-hydroxy-olean-12-en-28-oic acid được phân lập lần đầu tiên trong tự nhiên.

Dưới đây là bảng đối chiếu chi tiết dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR và 1H-NMR của hai hợp chất cô lập được so với các tài liệu tham khảo được trích dẫn trong văn bản:

Vị trí carbon Hợp chất HN2 (oleanoic acid) Tài liệu [10] Hợp chất HN1 (dẫn xuất triterpene) Tài liệu [11]
δC (ppm) δH (ppm, J theo Hz) δC (ppm) δC (ppm) δH (ppm, J theo Hz) δC (ppm)
1 38,6 1,60 (m) 38,5 40,2 1,65 (m) 40,2
2 27,4 1,62 (m) 27,4 23,7 1,61 (m) 23,7
3 79,2 3,23 (dd, J = 11,3; 4,2) 78,1 80,8 4,44 (dd, J = 11,7; 4,2) 80,8
4 38,9 - 38,7 38,5 - 38,4
5 55,4 0,72 (m) 55,2 55,6 0,85 (s) 55,6
6 18,5 1,36 (m) 18,3 68,6 4,53 (s) 68,5
7 32,8 1,55 (m) 32,6 40,6 1,49 (m) 40,8
8 39,4 - 39,3 38,5 - 38,6
9 47,8 1,53 (m) 47,6 48,0 1,62 (m) 47,8
10 37,3 - 37,0 36,4 - 36,5
11 23,1 1,61 (m) 23,1 23,4 1,92 (m) 23,3
12 122,8 5,28 (t, J = 3,4) 122,1 122,6 5,31 (t, J = 3,4) 122,6
13 143,7 - 143,4 142,7 - 142,9
14 41,8 - 41,6 42,4 - 42,2
15 27,8 1,58 (m) 27,7 28,0 1,73 (m) 27,6
16 23,6 1,97 (m) 23,4 23,2 2,01 (m) 23,0
17 46,7 - 46,6 46,7 - 46,7
18 41,2 2,82 (dd, J = 13,7; 4,1) 41,3 41,4 2,82 (dd, J = 13,8; 4,0) 41,3
19 46,0 1,18 (m) 45,8 46,0 1,17 (m) 45,8
20 30,8 - 30,6 30,8 - 30,7
21 34,0 1,30 (m) 33,8 34,0 1,35 (m) 33,9
22 32,6 1,75 (m) 32,3 32,4 1,75 (m) 32,4
23 28,3 0,99 (s) 28,1 27,8 0,95 (s) 25,9
24 15,7 0,75 (s) 15,6 18,5 1,25 (s) 18,3
25 15,5 0,91 (s) 15,3 17,2 1,32 (s) 16,9
26 17,3 0,77 (s) 16,8 18,4 1,06 (s) 18,2
27 26,1 1,13 (s) 26,0 26,1 1,09 (s) 25,9
28 183,5 - 181,0 183,7 - 178,2
29 33,2 0,90 (s) 33,1 33,2 0,90 (s) 33,1
30 23,7 0,93 (s) 23,6 23,7 0,92 (s) 23,6
-CO-CH3 - - - 21,5 2,06 (s) 21,3
>C=O - - - 171,2 - 171,0

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng và phân lập thực nghiệm:

  • Thu nhận 804,91 g cao methanol ngâm dầm (từ 16 kg bột) và 662,54 g cao methanol trích nóng (từ 14 kg bột). Phân bố lỏng – rắn cao MA thu được 349,41 g cao hexane, 277,44 g cao ethyl acetate và 178,06 g cao methanol.
  • Tách phân đoạn cao hexane thu được 7 phân đoạn H1 đến H7; từ 8,8822 g phân đoạn H4 đã phân lập thành công hai hợp chất triterpenoid tinh khiết:
    • Hợp chất HN2: Thu được 0,081 g, được xác định là oleanoic acid.
    • Hợp chất HN1: Thu được 0,01 g, được xác định là 3β-acetoxy-6β-hydroxy-olean-12-en-28-oic acid.

Đóng góp khoa học và giải pháp đề xuất:

  • Khóa luận lần đầu tiên công bố việc cô lập oleanoic acid từ thân cây cà phê Robusta.
  • Đóng góp phát hiện hợp chất 3β-acetoxy-6β-hydroxy-olean-12-en-28-oic acid là một chất mới lần đầu tiên được tìm thấy trong tự nhiên, đã được tra cứu xác nhận qua hệ thống SciFinder.
  • Tác giả đề xuất định hướng ứng dụng khai thác nguồn phụ phẩm thân cây cà phê già cỗi sau thu hoạch để chiết xuất các hợp chất triterpenoid có giá trị sinh học phục vụ ngành dược phẩm, mỹ phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

  • Đề tài chỉ tập trung khảo sát thành phần hóa học trên duy nhất một phân đoạn H4 (8,8822 g) trong tổng số 7 phân đoạn thu được từ cao hexane; 6 phân đoạn còn lại của cao hexane cũng như toàn bộ lượng cao ethyl acetate (277,44 g) và cao methanol (178,06 g) chưa được tiến hành phân tách.
  • Chưa thực hiện các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học (như tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính chống oxy hóa hoặc độc tính tế bào) đối với hai hợp chất HN1 và HN2 do giới hạn thời gian thực hiện khóa luận.

Hướng nghiên cứu tiếp theo do tác giả kiến nghị:

  • Tiếp tục khảo sát các phân đoạn sắc ký còn lại để cô lập các hợp chất tự nhiên khác từ thân cây cà phê Robusta, tiến hành giải đoán cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính sinh học định hướng ứng dụng thực tiễn.
  • Mở rộng khảo sát so sánh hiệu quả chiết xuất bột thân cây cà phê trong các hệ dung môi khác nhau.
  • Thu thập mẫu thân cây cà phê Robusta tại các vùng sinh thái, thổ nhưỡng và điều kiện khí hậu khác nhau để đánh giá sự biến thiên về thành phần cũng như hàm lượng các hợp chất tự nhiên.

Giá trị tham khảo

Khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học, Hóa hữu cơ, Hóa học các hợp chất tự nhiên và Dược học:

  • Tham khảo phương pháp xây dựng quy trình phân tách sắc ký đa pha: Cách thức kết hợp tuần tự giữa sắc ký cột silica gel pha thường, sắc ký lọc gel Sephadex LH-20 và sắc ký phân bố pha đảo RP-18 để tinh chế triệt để các hợp chất triterpene có cấu trúc và độ phân cực tương đồng.
  • Tham khảo quy trình giải đoán cấu trúc triterpenoid: Khóa luận trình bày phương pháp biện giải chi tiết các dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR (1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC) để xác định chính xác các nhóm thế (-OH, -OAc, -COOH) và vị trí liên kết đôi trên bộ khung pentacyclic oleanane.

Câu hỏi thường gặp

1. Hai phương pháp chiết xuất cao thô methanol được áp dụng trong đề tài cho hiệu suất khối lượng ra sao?

Phương pháp ngâm dầm thực hiện trên 16 kg bột thân cây khô với methanol ở nhiệt độ phòng thu được 804,91 g cao thô (đạt tỷ lệ 5,03% khối lượng nguyên liệu). Phương pháp trích nóng đun hồi lưu thực hiện trên 14 kg bột ở nhiệt độ sôi của dung môi thu được 662,54 g cao thô (đạt tỷ lệ 4,73% khối lượng nguyên liệu).

2. Tên khoa học và khối lượng của hai hợp chất phân lập được từ phân đoạn H4 là gì?

Hai hợp chất được phân lập từ phân đoạn H4 gồm: hợp chất HN2 có khối lượng 0,081 g, được xác định là oleanoic acid; hợp chất HN1 có khối lượng 0,01 g, được xác định là 3β-acetoxy-6β-hydroxy-olean-12-en-28-oic acid.

3. Căn cứ nào khẳng định hợp chất HN1 là chất mới lần đầu tiên được tìm thấy trong tự nhiên?

Cấu trúc phân tử của hợp chất HN1 được xác định đầy đủ thông qua hệ thống phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC và COSY. Sau khi xác lập cấu trúc, tác giả đã tiến hành tra cứu cấu trúc hóa học trên cơ sở dữ liệu quốc tế SciFinder tại Đại học Chulalongkorn (Thái Lan) vào ngày 03/07/2019 và nhận được kết quả hợp chất này chưa từng được công bố cô lập từ bất kỳ nguồn tự nhiên nào trước đó.

4. Quy trình sắc ký tinh chế hợp chất HN2 từ phân đoạn H4.3 đã sử dụng các loại pha tĩnh và hệ dung môi nào?

Phân đoạn H4.3 (0,1408 g) được nạp lên cột silica gel pha thường giải ly bằng chloroform:ethyl acetate (9:1) thu được 0,0326 g; phần mẫu này tiếp tục qua cột lọc gel Sephadex LH-20 thu được 0,024 g; cuối cùng mẫu được tinh chế bằng sắc ký cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi acetone:nước (8:2) để thu nhận 0,081 g hợp chất HN2 tinh khiết.

5. Dữ liệu phổ nghiệm nào xác định nhóm hydroxyl (-OH) nằm tại vị trí C-3 của oleanoic acid (HN2)?

Trên phổ 1H-NMR, tín hiệu của proton oxymethine xuất hiện tại δH 3,23 ppm (dd, 1H, J = 11,3; 4,2 Hz) tương ứng với carbon oxymethine ở δC 79,2 ppm trên phổ 13C-NMR. Trên phổ tương tác dị nhân qua nhiều liên kết HMBC, proton này cho thấy tương quan rõ rệt với hai carbon methyl C-23 (δC 28,3 ppm) và C-24 (δC 15,7 ppm), chứng minh nhóm -OH liên kết trực tiếp tại carbon C-3 của khung oleanane.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Hồ Văn Ngọc đã hoàn thành quy trình chiết xuất và phân tách thành phần hóa học từ thân cây cà phê Robusta thu hái tại Di Linh, Lâm Đồng. Bằng kỹ thuật sắc ký cột kết hợp đa pha tĩnh (silica gel pha thường, lọc gel Sephadex LH-20 và pha đảo RP-18), đề tài đã phân lập thành công hai hợp chất hữu cơ tinh khiết từ phân đoạn H4 của cao hexane gồm oleanoic acid (0,081 g) và 3β-acetoxy-6β-hydroxy-olean-12-en-28-oic acid (0,01 g). Cấu trúc của hai hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm 1D và 2D-NMR, trong đó oleanoic acid lần đầu tiên được ghi nhận hiện diện trong thân cây cà phê Robusta và dẫn xuất triterpene HN1 là hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu hóa thực vật quan trọng, mở ra tiềm năng tận dụng phế phụ phẩm thân gỗ cà phê già cỗi trong ứng dụng y dược học.