Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ hóa học của nghiên cứu sinh Trần Thu Hường với đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) và cây Nhó đông (Morinda longissima Y. Ruan)" được thực hiện tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Mạnh Cường và PGS. Đỗ Thị Thảo (bảo vệ năm 2020). Luận án thuộc chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên (mã số: 9 44 01 17).

Về tính cấp thiết, cây Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.), họ Cam chanh Rutaceae) phân bố tại Khánh Hòa và Ninh Thuận, được người dân địa phương sử dụng trong điều trị các bệnh lý về gan như xơ gan cổ trướng. Cây Nhó đông (Morinda longissima Y. Ruan, họ Cà phê Rubiaceae) phân bố tại Sơn La, Thừa Thiên Huế và Quảng Nam, được đồng bào Thái tại Sơn La dùng để giải độc gan, chữa vàng da, viêm gan và xơ gan. Trước thời điểm năm 2013, tại Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu đầy đủ về thành phần hóa học kết hợp tác dụng sinh học của Xáo tam phân; các nghiên cứu trên cây Nhó đông mới dừng lại ở bước khảo sát sơ bộ tác dụng thực nghiệm của cao chiết. Do đó, việc nghiên cứu có hệ thống về cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học theo định hướng bảo vệ gan, kháng virus viêm gan B của hai loài dược liệu này là yêu cầu thực tiễn nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho tri thức sử dụng thuốc dân gian.

Mục tiêu nghiên cứu tổng quát của luận án là đánh giá tác dụng bảo vệ gan và xác định thành phần hóa học chính nhằm làm sáng tỏ tác dụng chữa bệnh gan của thân rễ hai loài cây Paramignya trimera và Morinda longissima.

Nội dung nghiên cứu được triển khai theo 3 nội dung cụ thể:

  1. Sàng lọc tác dụng kháng virus viêm gan B trên in vitro và tác dụng bảo vệ gan trên mô hình chuột gây độc gan bằng paracetamol của các cao chiết và phân đoạn từ thân rễ loài Xáo tam phân (Paramignya trimera) và thân rễ loài Nhó đông (Morinda longissima).
  2. Nghiên cứu thành phần hóa học của các cao chiết và phân đoạn có hoạt tính từ thân rễ hai loài cây nghiên cứu.
  3. Sàng lọc hoạt tính kháng virus viêm gan B trên in vitro và tác dụng bảo vệ gan trên mô hình chuột gây độc gan bằng paracetamol của một số hợp chất sạch phân lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng thực vật: Mẫu thân và rễ loài Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum., tiêu bản C-499) thu hái vào tháng 02/2013 tại xã Ninh Vân, thị xã Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa. Mẫu thân rễ loài Nhó đông (Morinda longissima Y. Ruan, tiêu bản C-547) thu hái vào tháng 04/2013 tại tỉnh Sơn La. Cả hai mẫu thực vật được TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam) giám định tên khoa học và lưu giữ tại Phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
  • Phạm vi nghiên cứu: Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học các chất tinh khiết; khảo sát hoạt tính kháng virus viêm gan B in vitro trên dòng tế bào HepG2.15 thông qua mức độ ức chế kháng nguyên bề mặt HBsAg; đánh giá hoạt tính bảo vệ gan in vivo trên mô hình chuột BALB/c bị gây độc gan cấp bằng paracetamol qua các chỉ số men gan AST, ALT, cholesterol toàn phần và mô bệnh học gan.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến hai chi thực vật Paramignya và Morinda, cùng các phương pháp thử hoạt tính sinh học tương ứng.

Đối với chi Paramignya (họ Rutaceae):

  • Phân loại học thực vật ghi nhận khoảng 30 loài, trong đó 2 loài đã được chấp nhận tên khoa học là P. confertifolia và P. trimera. Các hợp chất tự nhiên phân lập từ chi này tập trung ở 4 loài (P. monophylla tại Sri Lanka, P. griffithii tại Thái Lan, P. scandens và P. trimera tại Việt Nam) với khoảng 85 hợp chất thuộc các nhóm coumarin (1–18), tirucallane và saponin tirucallane (19–33), alkaloid (34–42), flavanone (43–53) và các hợp chất phenolic/chromene (54–85).
  • Tác dụng sinh học: Cao chiết methanol của P. lobata tại Singapore thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư biểu mô KB với giá trị $\text{ED}{50} = 100\ \mu\text{g/ml}$ (nghiên cứu năm 2000). Tại Việt Nam, Nguyễn Minh Khởi và cộng sự (2013) nghiên cứu cao chiết methanol rễ P. trimera, phân đoạn hexane và ostruthin có tác dụng gây độc 5 dòng tế bào ung thư (Hep-G2, HCT-116, MDA-MB-231, OVCAR-8, HeLa), nhưng dịch chiết methanol ở liều 10 và 20 g/kg chưa thể hiện tác dụng làm giảm men gan AST, ALT hay bilirubin trên chuột Swiss sau 8 ngày gây độc bằng paracetamol (400 mg/kg). Nguyễn Văn Tặng và cộng sự (2014–2017) khảo sát độc tính tế bào trên 12 dòng ung thư, khả năng chống oxy hóa và quy trình chiết xuất của P. trimera. Phù Hoàng Đặng và cộng sự (2017) công bố hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase của dịch chiết methanol rễ P. trimera với giá trị $\text{IC}{50} = 36{,}6\ \mu\text{g/ml}$.

Đối với chi Morinda (họ Rubiaceae):

  • Trên thế giới, hơn 200 hợp chất đã được phân lập từ các loài như M. citrifolia, M. officinalis, M. lucida, M. pandurifolia, M. elliptica, M. angustifolia, M. coreia, M. morindoides. Các nhóm hoạt chất chủ đạo gồm anthraquinone (chủ yếu ở rễ, ví dụ damnacanthal, nordamnacanthal, morindone, rubiadin, soranjidiol, lucidin...), iridoid (chủ yếu ở lá và quả, dạng glycoside và spirolactone), flavonoid, lignan và naphthohydroquinone glycoside (morindaparvins H–O). Về hoạt tính sinh học, M. Wang và cs (2008) chứng minh cao nước quả M. citrifolia bảo vệ gan chuột Sprague-Dawley gây độc bởi $\text{CCl}_4$; Surendiran và cs (2011) chứng minh cao lá M. tinctoria hạ men gan GPT, GOT, bilirubin trên chuột bị gây độc bởi paracetamol; các nghiên cứu của Domekouo (2016), Jadhav (2014) ghi nhận tác dụng hạ đường huyết; Li Ye (2014), Hussain (2016), Wattanathorn (2018) chứng minh tác dụng chống loãng xương của M. officinalis và M. citrifolia.
  • Tại Việt Nam, 6 loài thuộc chi Morinda đã được nghiên cứu: M. citrifolia (Đỗ Quốc Việt, 1999; Hoàng Việt Dũng, 2012), M. officinalis (Vũ Đức Lợi, 2016), M. tomentosa, M. umbellata, M. longifolia (Ninh Khắc Bản và cs, 2013 phân lập các hợp chất mới morintoside A–B, umbellatolide A–B, longifolide A–B). Với loài Nhó đông (M. longissima), Nguyễn Duy Thuần và cs (2004) phân lập 4 chất gồm scopoletin, emodin, 1,3-dihydroxy-4-ethoxymethyl anthraquinone và $\beta$-sitosterol. Nguyễn Phi Hùng và cs (2017) phân lập 21 anthraquinone từ mẫu thân rễ thu tại Cao Bằng, phát hiện hợp chất mới modasima A có hoạt tính kích hoạt enzyme AMPK.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết:

  • Nghiên cứu sâu thành phần hóa học của thân rễ cây Xáo tam phân (P. trimera) và thân rễ cây Nhó đông (M. longissima) thu hái tại các sinh cảnh đặc trưng (Khánh Hòa và Sơn La) nhằm tìm kiếm các hợp chất mới.
  • Khảo sát có hệ thống hoạt tính kháng virus viêm gan B in vitro (trên dòng tế bào mang bộ gen virus HepG2.15) của các cao chiết, phân đoạn và các hợp chất sạch phân lập được.
  • Đánh giá định lượng tác dụng bảo vệ gan in vivo trên chuột BALB/c bị gây tổn thương bởi paracetamol của cao chiết cũng như các hợp chất coumarin tinh khiết nhằm xác thực cơ sở khoa học của dược liệu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp các nguyên lý hóa học hợp chất thiên nhiên thực nghiệm và các mô hình thử nghiệm dược lý sinh học chuẩn hóa.

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Lý thuyết phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất thiên nhiên dựa trên phương pháp sắc ký và phân tích phổ cấu trúc phân tử.
  • Cơ chế tổn thương gan thực nghiệm bằng paracetamol: Paracetamol liều cao (400 mg/kg) chuyển hóa qua cytochrome P450 tạo chất trung gian $N$-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI), làm cạn kiệt glutathione (hệ thiol), gây peroxy hóa lipid màng tế bào gan, dẫn đến hoại tử tế bào, giải phóng các enzyme aminotransferase (AST, ALT) vào huyết thanh và thay đổi mô bệnh học gan.
  • Cơ chế nhiễm HBV: Kháng nguyên bề mặt HBsAg giữ vai trò then chốt giúp virus vượt qua miễn dịch và xâm nhập tế bào gan; việc ức chế mức độ biểu hiện HBsAg trên dòng tế bào HepG2.15 được sử dụng làm chỉ tiêu đánh giá tác dụng kháng virus.

Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học

  • Phân lập và tinh chế:
    • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Bản mỏng tráng sẵn Silica gel $60\text{ F}{254}$ và $\text{RP}{18}\text{ F}_{254\text{s}}$ (Merck), phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 365 nm hoặc phun dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4\ 10%$ rồi sấy nóng.
    • Sắc ký cột (CC): Pha thường sử dụng Silica gel cỡ hạt 0,040–0,063 mm (240–430 mesh); pha đảo sử dụng YMC $\text{RP}-18$ (30–50 $\mu\text{m}$, Fuji Silysia Chemical Ltd.); chất hấp phụ rây phân tử và trao đổi ion gồm Sephadex LH-20 và Diaion HP-20 (Sigma-Aldrich).
  • Xác định cấu trúc vật lý và hóa học:
    • Đo điểm nóng chảy trên máy Boetius; đo góc quay cực trên máy Polartronic-D (chiều dài cuvet 10 cm, phối hợp đo tại Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc).
    • Phổ khối lượng: ESI-MS ghi trên máy Agilent 6310 Ion Trap; phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS ghi trên máy Agilent 6510 Q-TOF LC/MS hoặc Bruker Daltonics MicroQ-TOF III.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz ($^1\text{H}$-NMR tại 500 MHz, $^{13}\text{C}$-NMR tại 125 MHz, kết hợp DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY, ROESY) với các dung môi $\text{DMSO-}d_6$, $\text{CD}_3\text{OD}$, $\text{CDCl}_3$.

Phương pháp đánh giá tác dụng sinh học

  • Đánh giá hoạt tính kháng virus viêm gan B in vitro:
    • Dòng tế bào: Dòng tế bào ung thư gan người mang bộ gen HBV (HepG2.15), nuôi cấy ở mật độ $4 \times 10^4\ \text{tế bào/ml}$ trong đĩa 96 giếng ở $37^\circ\text{C}$, $5%\ \text{CO}_2$.
    • Độc tính tế bào: Sử dụng bộ kit Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies), ủ 30 phút, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 450 nm ($\text{Abs}_{450}$), xác định tỷ lệ sống sót tế bào so với đối chứng DMSO ($100%$). Các mẫu thử đạt tỷ lệ sống sót tế bào trên $80%$ được chọn để thử nghiệm ức chế HBsAg.
    • Mức độ biểu hiện HBsAg: Xác định bằng bộ kit Genedia HBsAg ELISA 3.0. Ủ mẫu thử (cao: $60\ \mu\text{g/ml}$, chất sạch: $20\ \mu\text{M}$) trong 4 ngày (2 lần/ngày), bổ sung enzyme conjugate, cơ chất HRP và chất chỉ thị màu TMB, đo độ hấp thụ $\text{Abs}{450}$. Khảo sát giá trị $\text{IC}{50}$ tại 4 nồng độ (5, 10, 15, 20 $\mu\text{M}$).
  • Đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo:
    • Động vật thực nghiệm: Chuột nhắt trắng dòng BALB/c (khối lượng $26 \pm 2\ \text{g}$), chia 6 lô ($n=6\ \text{con/lô}$):
      • Lô 1 (Sinh lý): Uống $\text{NaCl}\ 0{,}9%$ ($0{,}2\ \text{ml/con/ngày}$).
      • Lô 2 (Bệnh lý): Uống $\text{NaCl}\ 0{,}9%$ + gây độc paracetamol.
      • Lô 3: Uống mẫu thử liều 1 + gây độc paracetamol.
      • Lô 4: Uống mẫu thử liều 2 + gây độc paracetamol.
      • Lô 5 (Chứng dương): Uống Silymarin liều $50\ \text{mg/kgP/ngày}$ + gây độc paracetamol.
    • Phác đồ: Cho uống mẫu thử liên tục 7 ngày trước và 2 ngày sau khi gây độc. Ngày thứ 7 (sau uống mẫu 1 giờ, nhịn đói 14–16 giờ), gây độc gan bằng một liều paracetamol duy nhất $400\ \text{mg/kgP}$ (nồng độ pha $50\ \text{mg/ml}$).
    • Chỉ tiêu đánh giá: Sau 48 giờ gây độc, lấy máu ly tâm ($10000\ \text{vòng/phút}$ trong 10 phút) tách huyết thanh; định lượng AST, ALT, cholesterol toàn phần và protein toàn phần trên hệ thống máy sinh hóa tự động AU680 (Beckman Coulter). Mổ chuột kiểm tra đại thể gan, lấy mô gan cố định trong Formalin $10%$, đúc khối paraffin, cắt lát $4\ \mu\text{m}$, nhuộm Hematoxylin & Eosin (H&E) và đọc tiêu bản vi thể tại Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Quân y 103.
  • Xử lý số liệu: Số liệu được phân tích bằng phần mềm Microsoft Excel, kiểm định Student's t-test, F-test, phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (One-way ANOVA) và kiểm định LSD (least-significant difference); mức ý nghĩa thống kê được xác định ở ngưỡng $p < 0{,}05$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng hợp các cơ sở dữ liệu thực vật học, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hai chi Paramignya và Morinda; phân tích chi tiết các lớp chất coumarin, tirucallane, alkaloid, flavonoid, anthraquinone, iridoid và phenylpropanoid. Chương này cũng phân tích tổng quan các mô hình thực nghiệm bảo vệ gan (sử dụng các tác nhân $\text{CCl}_4$, thioacetamide, D-galactosamine, paracetamol, ethanol) và mô hình kháng virus viêm gan B in vitro (tế bào gan nguyên phát, dòng tế bào chuyển gen HepG2.15, HepAD38), từ đó thiết lập cơ sở lý thuyết cho việc lựa chọn mô hình paracetamol và HepG2.15 trong luận án.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết về xuất xứ địa lý, tiêu bản thực vật, phương pháp thu hái và xử lý mẫu của hai loài Paramignya trimera (Ninh Vân, Khánh Hòa) và Morinda longissima (Sơn La). Đồng thời, chương này mô tả quy chuẩn các hóa chất, dung môi, thiết bị phân tích phổ (Boetius, Polartronic-D, Agilent ESI-MS, Bruker 500 MHz NMR), quy trình nuôi cấy dòng tế bào HepG2.15, quy trình kỹ thuật ELISA HBsAg, quy trình thử nghiệm trên chuột BALB/c và các công thức toán học thống kê ứng dụng trong xử lý dữ liệu sinh học.

Chương 3: Thực nghiệm và kết quả

Chương 3 trình bày các quy trình chiết xuất và phân lập hóa học cụ thể:

  • Từ thân rễ Xáo tam phân (P. trimera): Chiết phân đoạn với methanol và nước, qua các hệ cột sắc ký Silica gel, YMC RP-18, Diaion HP-20 và Sephadex LH-20, phân lập được 10 hợp chất tinh khiết ký hiệu từ PT-1 đến PT-10.
  • Từ thân rễ Nhó đông (M. longissima): Chiết phân đoạn với ethanol và nước, phân lập được 22 hợp chất tinh khiết ký hiệu từ ML-1 đến ML-22.
  • Thực nghiệm sinh học: Thu nhận số liệu kiểm tra độc tính tế bào, mức độ biểu hiện HBsAg của các phân đoạn và chất sạch; thu nhận số liệu nồng độ enzyme AST, ALT, hàm lượng cholesterol, khối lượng gan và hình ảnh giải phẫu bệnh vi thể gan chuột ở các lô thí nghiệm.

Chương 4: Thảo luận kết quả

Sàng lọc tác dụng sinh học của cao chiết và phân đoạn

  • Tác dụng kháng HBV in vitro: Các cao chiết và phân đoạn của Xáo tam phân và Nhó đông được sàng lọc ở nồng độ $60\ \mu\text{g/ml}$ trên tế bào HepG2.15 (độ sống sót tế bào $> 80%$). Kết quả cho thấy các phân đoạn cao chiết thể hiện khả năng ức chế mức độ biểu hiện HBsAg ở các mức độ khác nhau.
  • Tác dụng bảo vệ gan in vivo của cao chiết thân rễ Xáo tam phân: Trên mô hình chuột BALB/c bị gây độc bởi paracetamol ($400\ \text{mg/kgP}$), lô mô hình bệnh lý có nồng độ AST và ALT tăng cao so với lô sinh lý bình thường. Lô chuột uống cao methanol và cao nước của thân rễ Xáo tam phân có sự suy giảm nồng độ men gan AST, ALT và cholesterol toàn phần trong huyết thanh so với lô đối chứng bệnh lý ($p < 0{,}05$), tương đương với tác dụng của thuốc đối chứng Silymarin ($50\ \text{mg/kgP}$). Khối lượng gan và quan sát đại thể cho thấy cao chiết giúp giảm hiện tượng sưng phù và tổn thương hoại tử gan.

Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ Xáo tam phân (Paramignya trimera)

Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 10 hợp chất từ thân rễ Xáo tam phân, trong đó có 5 hợp chất mới:

Ký hiệu Tên hợp chất Phân loại hóa học Tình trạng cấu trúc
PT-1 Ostruthin Coumarin Đã biết
PT-2 Ninhvanin Coumarin Hợp chất mới
PT-3 6-(2-hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran Chromene Đã biết
PT-4 Citrusinine-I Alkaloid (Acridone) Đã biết
PT-5 Paramitrimerol Diterpenoid Hợp chất mới
PT-6 6-(6-hydroxy-3,7-dimethylocta-2,7-dienyl)-7-hydroxycoumarin Coumarin Đã biết
PT-7 Ninhvanin B Coumarin Hợp chất mới
PT-8 Paratrimerin A Coumarin dimer Hợp chất mới
PT-9 Paratrimerin B Coumarin dimer Hợp chất mới
PT-10 Parabacunoic acid Limonoid Đã biết

Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ Nhó đông (Morinda longissima)

Từ thân rễ cây Nhó đông, luận án phân lập và xác định cấu trúc 22 hợp chất, trong đó có 3 hợp chất mới:

Ký hiệu Tên hợp chất Phân loại hóa học Tình trạng cấu trúc
ML-1 Damnacanthal Anthraquinone Đã biết
ML-2 Lucidin-$\omega$-methyl ether Anthraquinone Đã biết
ML-3 Soranjidiol Anthraquinone Đã biết
ML-4 Morindone-5-methyl ether Anthraquinone Đã biết
ML-5 Rubiadin Anthraquinone Đã biết
ML-6 Rubiadin-3-methyl ether Anthraquinone Đã biết
ML-7 Damnacanthol Anthraquinone Đã biết
ML-8 Morindone Anthraquinone Đã biết
ML-9 1-hydroxy-2-methyl-6-methoxy anthraquinone Anthraquinone Đã biết
ML-10 Morindone-6-methyl ether Anthraquinone Đã biết
ML-11 Morindone-6-$O$-$\beta$-gentiobioside Anthraquinone glycoside Đã biết
ML-12 Lucidin-3-$O$-$\beta$-primeveroside Anthraquinone glycoside Đã biết
ML-13 Morinlongoside A Iridoid glycoside Hợp chất mới
ML-14 Morinlongoside B Iridoid glycoside Hợp chất mới
ML-15 Morinlongoside C Iridoid glycoside Hợp chất mới
ML-16 Geniposidic acid Iridoid Đã biết
ML-17 3-$O$-$\beta$-D-xylopyranosyl-(1$\rightarrow$6)-$\beta$-D-glucopyranosyl-1-octen-3-ol Alkyl glycoside Đã biết
ML-18 Acteoside Phenylpropanoid glycoside Đã biết
ML-19 Cistanoside-E Phenylpropanoid glycoside Đã biết
ML-20 Ethyl-$\beta$-D-galactopyranoside Glycoside Đã biết
ML-21 Isoacteoside Phenylpropanoid glycoside Đã biết
ML-22 Quercetin Flavonoid Đã biết

Đánh giá tác dụng sinh học của các hợp chất sạch

  • Tác dụng kháng HBV in vitro: Các hợp chất sạch thử nghiệm ở nồng độ $20\ \mu\text{M}$ cho thấy khả năng làm giảm mức độ biểu hiện HBsAg trên dòng tế bào HepG2.15. Các giá trị $\text{IC}_{50}$ ức chế HBsAg được xác định trong dải nồng độ từ 5 đến $20\ \mu\text{M}$.
  • Tác dụng bảo vệ gan in vivo của Ostruthin (PT-1) và Ninhvanin (PT-2):
    • Chuột BALB/c gây độc bằng paracetamol ($400\ \text{mg/kgP}$) khi được uống ostruthin và ninhvanin thể hiện sự suy giảm có ý nghĩa thống kê ($p < 0{,}05$) nồng độ men gan AST và ALT trong huyết thanh so với lô đối chứng bệnh lý.
    • Hàm lượng cholesterol toàn phần và khối lượng gan chuột ở các lô điều trị bằng PT-1 và PT-2 duy trì ở mức ổn định gần với lô đối chứng sinh lý và lô đối chứng tham khảo Silymarin.
    • Quan sát đại thể và tiêu bản mô bệnh học vi thể nhuộm H&E (độ phóng đại 200X) chứng minh cấu trúc vi thể tế bào gan chuột ở lô uống ostruthin và ninhvanin giảm rõ rệt hiện tượng hoại tử trung tâm tiểu thùy, giảm thoái hóa mỡ và bảo tồn cấu trúc bè gan so với lô mô hình bệnh lý paracetamol.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

  1. Phân lập và xác định cấu trúc của tổng cộng 32 hợp chất từ hai loài thực vật nghiên cứu.
  2. Phát hiện 08 hợp chất mới lần đầu tiên trong tự nhiên:
    • 05 hợp chất mới từ thân rễ Xáo tam phân (Paramignya trimera): ninhvanin (PT-2), paramitrimerol (PT-5), ninhvanin B (PT-7), paratrimerin A (PT-8), paratrimerin B (PT-9).
    • 03 hợp chất mới từ thân rễ Nhó đông (Morinda longissima): morinlongoside A (ML-13), morinlongoside B (ML-14), morinlongoside C (ML-15).
  3. Đóng góp dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY, ROESY) và phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) cho các phân lớp coumarin monoterpenoid, coumarin dimer, diterpenoid và iridoid glycoside.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

  1. Cung cấp bằng chứng thực nghiệm chứng minh cao chiết thân rễ Xáo tam phân, cao chiết thân rễ Nhó đông và các hợp chất sạch phân lập được có hoạt tính ức chế sự biểu hiện kháng nguyên HBsAg của virus viêm gan B trên dòng tế bào HepG2.15.
  2. Chứng minh tác dụng bảo vệ gan in vivo của cao chiết thân rễ Xáo tam phân và hai hợp chất coumarin sạch (ostruthin, ninhvanin) trên mô hình chuột nhắt BALB/c bị gây độc cấp bằng paracetamol thông qua việc hạ nồng độ enzyme AST, ALT, hạ cholesterol toàn phần và phục hồi tổn thương vi thể gan.
  3. Cung cấp luận cứ khoa học giải thích kinh nghiệm sử dụng thân rễ Xáo tam phân và Nhó đông trong y học dân gian để điều trị các bệnh lý viêm gan và bảo vệ chức năng gan.

Kiến nghị và đề xuất

  • Tiếp tục nghiên cứu độc tính bán trường diễn và trường diễn của các phân đoạn có hoạt tính và các hợp chất mới.
  • Khảo sát sâu hơn cơ chế phân tử tác động lên chu trình nhân lên của virus viêm gan B (ức chế HBV-DNA, HBeAg) và cơ chế chống oxy hóa tế bào của các hợp chất coumarin, anthraquinone và iridoid glycoside.
  • Tối ưu hóa quy trình chiết xuất nhằm định hướng tạo nguồn nguyên liệu tiêu chuẩn hóa phục vụ phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh gan.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

  • Khảo sát hoạt tính kháng virus viêm gan B mới dừng lại ở mô hình in vitro đánh giá mức độ biểu hiện của kháng nguyên bề mặt HBsAg và độc tính tế bào HepG2.15; chưa đánh giá tác động trên các chỉ tiêu sao chép HBV-DNA, kháng nguyên HBcAg, HBeAg cũng như chưa thử nghiệm mô hình động vật nhiễm HBV.
  • Thử nghiệm tác dụng bảo vệ gan in vivo trên mô hình paracetamol mới tập trung đánh giá chi tiết trên hai hợp chất coumarin chính (ostruthin và ninhvanin) của cây Xáo tam phân; các hợp chất mới khác từ Xáo tam phân và các nhóm anthraquinone, iridoid từ Nhó đông chưa được khảo sát in vivo do giới hạn về khối lượng phân lập.
  • Chưa có dữ liệu nghiên cứu về dược động học, sinh khả dụng và độ an toàn dài hạn (độc tính bán trường diễn, trường diễn) của các hợp chất mới.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng đánh giá hoạt tính kháng virus HBV trên các mô hình in vitro bổ sung và mô hình động vật chuyên biệt.
  • Nghiên cứu cơ chế tác dụng bảo vệ gan chuyên sâu ở mức độ sinh học phân tử (các chỉ số peroxy hóa lipid MDA, nồng độ glutathione nội sinh, sự biểu hiện của các enzyme chống oxy hóa SOD, CAT) của các hợp chất phân lập từ Nhó đông và Xáo tam phân.
  • Triển khai bán tổng hợp hoặc tối ưu hóa quy trình chiết xuất để thu nhận các hợp chất có hoạt tính cao phục vụ thử nghiệm tiền lâm sàng.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn đối với:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên và giảng viên thuộc các chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược, Dược học, Thực vật học và Công nghệ sinh học.
  • Các nhà nghiên cứu và cơ sở sản xuất dược phẩm trong việc tra cứu quy trình phân lập, hệ dữ liệu phổ đặc trưng của các dẫn xuất coumarin, alkaloid acridone, anthraquinone và iridoid glycoside.
  • Các đơn vị nghiên cứu dược lý trong việc ứng dụng quy trình thử nghiệm kháng virus viêm gan B trên dòng tế bào HepG2.15 kết hợp bộ kit CCK-8 và ELISA HBsAg, cũng như quy trình chuẩn hóa mô hình gây độc gan bằng paracetamol trên chuột BALB/c.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phát hiện bao nhiêu hợp chất mới và thuộc những khung cấu trúc nào?

Luận án đã phát hiện 08 hợp chất mới lần đầu tiên trong tự nhiên, bao gồm:

  • 05 hợp chất từ cây Xáo tam phân (Paramignya trimera): ninhvanin (PT-2, dẫn xuất coumarin), paramitrimerol (PT-5, dẫn xuất diterpenoid), ninhvanin B (PT-7, dẫn xuất coumarin), paratrimerin A (PT-8, coumarin dimer) và paratrimerin B (PT-9, coumarin dimer).
  • 03 hợp chất từ cây Nhó đông (Morinda longissima): morinlongoside A (ML-13), morinlongoside B (ML-14) và morinlongoside C (ML-15), đều thuộc nhóm iridoid glycoside.

2. Mô hình sàng lọc hoạt tính kháng virus viêm gan B (HBV) in vitro trong luận án được tiến hành như thế nào?

Thực nghiệm sử dụng dòng tế bào ung thư gan người mang bộ gen HBV (HepG2.15) nuôi cấy ở mật độ $4 \times 10^4\ \text{tế bào/ml}$. Độc tính tế bào được đánh giá bằng bộ kit Cell Counting Kit-8 (CCK-8) tại bước sóng 450 nm nhằm chọn các mẫu thử có tỷ lệ sống sót tế bào $> 80%$. Mức độ biểu hiện HBsAg được xác định định lượng qua bộ kit Genedia HBsAg ELISA 3.0 (xử lý với enzyme conjugate, cơ chất HRP, chất chỉ thị màu TMB và đo quang tại 450 nm). Giá trị $\text{IC}_{50}$ được xác định bằng việc thử nghiệm dải nồng độ từ 5 đến $20\ \mu\text{M}$.

3. Thiết kế thực nghiệm mô hình bảo vệ gan in vivo trên chuột BALB/c bằng paracetamol được chuẩn hóa ra sao?

Chuột BALB/c ($26 \pm 2\ \text{g}$, $n=6\ \text{con/lô}$) được chia thành các lô: sinh lý (uống $\text{NaCl}\ 0{,}9%$), bệnh lý (uống paracetamol), các lô uống mẫu thử (cao chiết hoặc chất sạch PT-1, PT-2) và lô chứng dương (Silymarin $50\ \text{mg/kgP}$). Mẫu thử được cho uống liên tục 7 ngày trước và 2 ngày sau gây độc. Ngày thứ 7 (sau nhịn đói 14–16 giờ), chuột được gây tổn thương gan cấp bằng một liều paracetamol duy nhất $400\ \text{mg/kgP}$. Sau 48 giờ gây độc, máu chuột được xét nghiệm các chỉ số AST, ALT, cholesterol toàn phần trên máy AU680 và mô gan được giải phẫu bệnh vi thể nhuộm H&E.

4. Những hợp chất sạch nào từ cây Xáo tam phân được chứng minh có tác dụng bảo vệ gan in vivo?

Hai hợp chất coumarin sạch là ostruthin (PT-1) và ninhvanin (PT-2, hợp chất mới) được thử nghiệm và chứng minh có tác dụng làm giảm nồng độ các men gan AST, ALT và cholesterol toàn phần trong huyết thanh chuột BALB/c bị gây độc bởi paracetamol ($p < 0{,}05$), đồng thời giảm mức độ tổn thương hoại tử tế bào gan trên hình ảnh tiêu bản mô bệnh học vi thể ở độ phóng đại 200X.

5. Nguồn gốc mẫu thực vật nghiên cứu được thu thập và giám định ở đâu?

Mẫu thân rễ Xáo tam phân (Paramignya trimera) được thu hái vào tháng 02/2013 tại xã Ninh Vân, thị xã Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa (mẫu tiêu bản C-499). Mẫu thân rễ Nhó đông (Morinda longissima) được thu hái vào tháng 04/2013 tại tỉnh Sơn La (mẫu tiêu bản C-547). Cả hai đối tượng thực vật đều do TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam) giám định tên khoa học và được lưu trữ tại Phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Trần Thu Hường đã hoàn thành việc nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học theo định hướng bảo vệ gan của hai loài dược liệu Paramignya trimera và Morinda longissima tại Việt Nam. Công trình đã phân lập và xác định cấu trúc 32 hợp chất, trong đó phát hiện 08 hợp chất mới trong tự nhiên thuộc các nhóm coumarin, coumarin dimer, diterpenoid và iridoid glycoside. Kết quả thử nghiệm sinh học đã cung cấp các chứng cứ định lượng về hoạt tính ức chế kháng nguyên HBsAg của virus viêm gan B trên dòng tế bào HepG2.15 và tác dụng bảo vệ gan in vivo của cao chiết cũng như hai hợp chất coumarin ostruthin và ninhvanin trên mô hình chuột nhiễm độc paracetamol. Các dữ liệu thu được góp phần hoàn thiện cơ sở khoa học cho việc sử dụng Xáo tam phân và Nhó đông trong y học cổ truyền và tạo tiền đề cho các nghiên cứu phát triển dược phẩm bảo vệ gan.