Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Hóa hữu cơ) mang tên: "Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của loài Trichosanthes baviensis Gagnep. (Dưa núi) và Trichosanthes kirilowii Maxim." (nghiên cứu mở rộng trên 3 loài thuộc chi Trichosanthes tại Việt Nam gồm: Trichosanthes baviensis, Trichosanthes anguina và Trichosanthes kirilowii).

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Việt Nam có điều kiện địa lý và khí hậu nhiệt đới gió mùa đặc trưng, sở hữu hệ thực vật phong phú với khoảng 12.000 loài thực vật, trong đó gần một phần ba được nhân dân sử dụng làm thuốc. Chi Qua lâu (Trichosanthes L.), thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae), là một chi lớn bao gồm khoảng 100 loài trên thế giới. Tại Việt Nam, GS. Phạm Hoàng Hộ đã ghi nhận và mô tả sơ bộ khoảng 12 loài, trong đó có 2 loài đặc hữu là Qua lâu Ba Vì (T. baviensis) và Qua lâu Pierre (T. pierrei). Nhiều loài thuộc chi này được sử dụng trong y học cổ truyền để thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, hạ đường huyết, chữa đau đầu, đau dạ dày, viêm tuyến vú và các bệnh lý ngoài da.

Mặc dù các nghiên cứu quốc tế đã chứng minh chi Trichosanthes chứa nhiều nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học đáng chú ý (đặc biệt là khả năng gây độc tế bào ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn và chống oxy hóa), tình hình nghiên cứu các loài thuộc chi này tại Việt Nam còn rất hạn chế:

  • Loài Trichosanthes baviensis Gagnep. là loài đặc hữu của Việt Nam, trước thời điểm nghiên cứu của luận án chưa từng có công trình nào công bố về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học.
  • Loài Trichosanthes anguina L. trên thế giới mới chỉ có duy nhất một công trình nghiên cứu được ghi nhận vào năm 1990.
  • Loài Trichosanthes kirilowii Maxim. phân bố tại Việt Nam mới chỉ có một công bố sơ bộ trên mẫu hạt, phần rễ củ thu hái tại Việt Nam chưa được khảo sát một cách có hệ thống.

Xuất phát từ thực tiễn trên, luận án được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống dữ liệu hóa thực vật và hoạt tính sinh học của 3 loài thuộc chi Trichosanthes tại Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát của luận án bao gồm:

  1. Xác định thành phần hóa học chủ yếu của ba loài T. baviensis, T. anguina và T. kirilowii ở Việt Nam.
  2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư và hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của các hợp chất phân lập được để tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học.

Nhiệm vụ nghiên cứu (nội dung cụ thể)

  1. Phân lập các hợp chất từ ba loài thuộc chi Trichosanthes (T. baviensis, T. anguina, T. kirilowii) bằng các phương pháp sắc ký.
  2. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp hoá lý hiện đại.
  3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư và hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của các chất phân lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng thực vật:
    • Loài Trichosanthes baviensis Gagnep. (mẫu toàn cây): Thu hái vào tháng 9 năm 2011 tại Ba Vì, Hà Nội, Việt Nam. Mẫu tiêu bản lưu trữ mang ký hiệu NCCT-TB1109.
    • Loài Trichosanthes anguina L. (mẫu lá): Thu hái vào tháng 8 năm 2013 tại Hòa Bình, Việt Nam. Mẫu tiêu bản lưu trữ mang ký hiệu NCCT-TA1308.
    • Loài Trichosanthes kirilowii Maxim. (mẫu rễ củ): Thu hái vào tháng 9 năm 2012 tại Hòa Bình, Việt Nam. Mẫu tiêu bản lưu trữ mang ký hiệu NCCT-TK1209.
    • Toàn bộ mẫu thực vật được PGS. Ninh Khắc Bản, Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định tên khoa học và lưu trữ tiêu bản.
  • Phạm vi khoa học: Chiết xuất, phân tách sắc ký, xác định cấu trúc hóa học bằng quang phổ (NMR 1D/2D, HR-ESI-MS, CD, năng suất quay cực) và thử nghiệm sinh học in vitro (độc tính tế bào ung thư theo phương pháp MTT và ức chế enzym tyrosinase).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam

Tác giả luận án đã tổng hợp có hệ thống các công trình nghiên cứu quốc tế và trong nước về thực vật học, công dụng y học cổ truyền, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Trichosanthes:

  1. Về thành phần hóa học: Các tài liệu đã công bố trên thế giới xác định hơn 130 hợp chất từ chi Trichosanthes, tập trung chủ yếu ở 8 loài (T. kirilowii, T. cucumerina, T. tricuspidata, T. dioica, T. cucumeroides, T. anguina, T. rosthornii, T. pericarpium), bao gồm các khung cấu trúc chính:

    • Triterpenoid (64 hợp chất, 1–64): Phổ biến là khung cucurbitane và multiflorane như 7-oxo-10α-cucurbitadienol (1), 10α-cucurbitadienol (2), 23,24-dihydrocucurbitacin D (3), cucurbitacin B (4), cucurbitacin D (35), karounidiol (45), multiflorenol (54), acid bryonolic (53)... được phân lập từ hạt, quả và rễ bởi các tác giả Ryu và cs. [2, 3, 4], Akihisa và cs. [12, 13, 14, 19, 21, 22], Kondo và cs. [20].
    • Steroid (26 hợp chất, 65–90): Bao gồm stigmastane, ergostane và các glycoside steroid phân lập từ hạt, lá, thân và rễ của T. dioica, T. kirilowii, T. cucumeroides [21–28].
    • Flavonoid (20 hợp chất, 91–110): Phân lập từ hạt, vỏ quả và quả của T. kirilowii, gồm 7-hydroxychromone (91), tricin (92), isoetin 5'-methyl ether (93), quercetin, luteolin, apigenin và các dẫn xuất glucoside [29–33].
    • Lignan (5 hợp chất, 110–114): Gồm hanutarin (110), (-)-secoisolariciresinol (111), 1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (112), (-)-pinoresinol (113), 4-ketopinoresinol (114) phân lập từ hạt T. kirilowii bởi Moon và cs. [34].
    • Hợp chất chứa nitơ (17 hợp chất, 115–131): Bao gồm soya-cerebroside I, các acid amin tự do (aspartic acid, glutamic acid, serine, leucine...) và dẫn xuất pyrrolidinyl fructofuranoside từ rễ và quả của T. kirilowii [9, 35].

  2. Về hoạt tính sinh học:

    • Gây độc tế bào ung thư: Ryu và cs. (1994) ghi nhận các cucurbitacin (4, 7, 35, 36) gây độc mạnh trên dòng tế bào A-549, SK-OV-3, SK-MEL-2, HCT-15 mạnh hơn adriamycin [4]. Kondo và cs. (1995) phát hiện acid bryonolic (53) gây độc tế bào HL-60 [20]. Akihisa và cs. (1994) công bố karounidiol (45) ức chế tế bào ung thư thận UO-31 ($IC_{50} = 1,98\ \mu\text{M}$), bạch cầu CCRF-CEM ($IC_{50} = 1,63\ \mu\text{M}$), phổi A-549 ($IC_{50} = 1,76\ \mu\text{M}$) và buồng trứng OVCAR-3 ($IC_{50} = 1,79\ \mu\text{M}$) [14]. Rahman và Moon (2007) xác định isoetin 5'-methyl ether (93) gây độc tế bào ung thư A-549 ($IC_{50} = 0,92\ \mu\text{g/mL}$) [29]. Shin và cs. chứng minh cặn chiết rễ T. kirilowii ức chế trùng hợp tubulin ở pha G2/M trên dòng HepG2 ($IC_{50} = 25\ \mu\text{g/mL}$) [38]. Kongtun và cs. (2009) đánh giá cucurbitacin B (4) trên các dòng MCF-7, T47D, MDA-MB-435, Caco-2 [16].
    • Kháng viêm: Akihisa và cs. (1994) chứng minh các triterpenoid (48, 49, 50, 51, 52) và 7-oxo-10α-cucurbitadienol (1) có hoạt tính kháng viêm trên mô hình tai chuột kích ứng bởi TPA ($IC_{50} = 0,2 - 0,7\ \text{mg/tai}$) [2, 19]. Cặn chiết nước nóng của T. cucumerina thể hiện tác dụng kháng viêm tương đương indomethacin ở liều $750\ \text{mg/kg}$ [46].
    • Ức chế tyrosinase và tổng hợp melanin: Oh và cs. công bố 23,24-dihydrocucurbitacin D (3) và cucurbitacin D (35) từ rễ T. kirilowii ức chế enzym tyrosinase ($IC_{50}$ lần lượt là $6,70\ \mu\text{M}$ và $0,18\ \mu\text{M}$) và ức chế tổng hợp melanin trong tế bào u ác tính B16/F10 ($IC_{50}$ lần lượt là $7,50\ \mu\text{M}$ và $0,16\ \mu\text{M}$) [37].
    • Chống oxy hóa và kháng khuẩn: Jang và cs. (2007) ghi nhận 1-C-(p-hydroxyphenyl)-glycerol từ T. kirilowii bắt gốc tự do DPPH ($IC_{50} = 56,0\ \text{ppm}$) và kháng 5 chủng vi khuẩn ở nồng độ 10 ppm [47]. Alam và cs. (2011) khảo sát phân đoạn ethyl acetate từ T. dioica ($IC_{50} = 12,32\ \mu\text{g/mL}$) [48]. Saboo và cs. (2013) khảo sát phân đoạn chloroform từ T. tricuspidata [50].

  3. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam:

    • Lê Phương Mai và cộng sự (2002) phân lập tricuspidatin (33) và 2-O-glucocucurbitacin J (34) từ loài T. tricuspidata thu tại Nghệ An; hợp chất 33 gây độc trên dòng tế bào KB với $IC_{50} = 0,4\ \mu\text{M}$ [8].
    • Nguyễn Tiến Đạt và cộng sự (2010) phân lập cucurbitacin B (4), (E)-3-(4-hydroxybenzylidene)-6-hydroxy-4-methoxybenzo-2(3H)-furanone (94), 6-(3-hydroxy-4-methoxystyryl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one (95) và blumenol A từ cặn chiết methanol của hạt loài T. kirilowii, chứng minh hoạt tính ức chế HIF và NF-$\kappa$B [30].

Vị trí và khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn

Luận án định vị trọng tâm vào việc khai thác nguồn dược liệu bản địa chưa được nghiên cứu hoặc chưa nghiên cứu đầy đủ tại Việt Nam:

  • Là công trình đầu tiên nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài đặc hữu T. baviensis.
  • Là nghiên cứu sâu sắc về thành phần hóa học phân lập từ lá loài T. anguina.
  • Bổ sung các dẫn xuất hóa học và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ rễ củ loài T. kirilowii thu hái tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Quy trình chiết xuất và phân lập

Luận án áp dụng các kỹ thuật tách chiết và phân lập sắc ký:

  • Xử lý mẫu và chiết xuất: Mẫu thực vật khô (toàn cây T. baviensis, 4,0 kg bột khô lá T. anguina, 2,5 kg bột khô rễ củ T. kirilowii) được chiết siêu âm với methanol (MeOH) 3 lần (mỗi lần 15 giờ). Dịch chiết được cô quay dưới áp suất giảm thu cặn chiết tổng số (cặn MeOH T. baviensis; cặn MeOH T. anguina 150,0 g; cặn MeOH T. kirilowii 120,0 g).
  • Phân bố pha lỏng - lỏng: Hòa cặn tổng vào nước cất và chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, chloroform ($CHCl_3$), ethyl acetate (EtOAc) và pha nước còn lại.
  • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel $60\text{ F}{254}$ (Merck 1,05715) và pha đảo $\text{RP18 F}{254\text{S}}$ (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 365 nm hoặc dùng thuốc thử dung dịch acid sulfuric ($H_2SO_4$) 10% sấy nóng hiện màu.
  • Sắc ký cột (Column Chromatography - CC):
    • Pha thường: Silica gel cỡ hạt $0,040 - 0,063\text{ mm}$ ($240 - 430\text{ mesh}$) và $230 - 400\text{ mesh}$.
    • Pha đảo: Chất hấp phụ RP-18 cỡ hạt $30 - 50\ \mu\text{m}$ (Fujisilysia Chemical Ltd.).
    • Sắc ký hấp phụ/rây phân tử: Nhựa Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Co.) để loại đường và phân tách phân đoạn nước; Sephadex.
  • Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Sử dụng hệ thống HPLC Agilent 1290 với cột bán điều chế J’sphere ODS H-80 ($250\text{ mm} \times 20\text{ mm}$, $4\ \mu\text{m}$, $8\text{ nm}$ và $20\text{ mm} \times 150\text{ mm}$) để tinh chế các hợp chất có độ phân cực gần nhau.
Mẫu dược liệu khô
Dịch chiết MeOH
Cặn chiết tổng MeOH
Phân đoạn n-Hexane / CHCl3    Phân đoạn EtOAc        Phân đoạn Nước
Các phân đoạn nhỏ             Các phân đoạn nhỏ      Các phân đoạn giải ly MeOH:H2O
         Sắc ký cột pha đảo RP-18 / Cột Sephadex / HPLC (cột J’sphere H-80)
                     Hợp chất sạch (TB1-TB14, TA1-TA8, TK1-TK8)

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được xác định dựa trên sự kết hợp giữa các thông số vật lý và phổ nghiệm:

  • Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS): Đo trên thiết bị FT-ICR-Mass spectrometry (Viện Hóa học) và Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS (Viện Hóa sinh biển và Đại học Yonsei, Hàn Quốc).
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên các máy Jeol EA600, Varian 400 MR và Bruker Avance 500 MHz (chất chuẩn nội TMS) tại Đại học Yonsei và Viện Hóa học. Kỹ thuật đo gồm:
    • Phổ 1D: $^1\text{H-NMR}$ (thang đo $0 - 14\text{ ppm}$), $^{13}\text{C-NMR}$ (thang đo $0 - 230\text{ ppm}$), DEPT 90° (chỉ xuất hiện tín hiệu CH), DEPT 135° (CH, $\text{CH}_3$ hướng lên; $\text{CH}_2$ hướng xuống; C bậc 4 không có tín hiệu).
    • Phổ 2D: HSQC/HMQC (tương tác trực tiếp $^1\text{H}-^{13}\text{C}$ qua 1 liên kết), HMBC (tương tác dị hạt nhân xa qua 2–3 liên kết), $^1\text{H}-^1\text{H}\text{ COSY}$ (tương tác giữa các proton kề nhau), NOESY/ROESY (tương tác không gian để xác định cấu hình lập thể).
    • Dung môi đo phổ: $\text{CDCl}_3$, $\text{C}_5\text{D}_5\text{N}$, $\text{CD}_3\text{OD}$, $\text{DMSO-d}_6$.
  • Phổ lưỡng sắc tròn (CD): Đo trên máy Chirascan CD spectrometer (Applied Photophysics Ltd., Surrey, UK) tại Viện Hóa sinh biển và Đại học Quốc gia Seoul để xác định cấu hình tuyệt đối.
  • Năng suất quay cực ($[\alpha]$): Đo trên phân cực kế JASCO P-2000 polarimeter tại Viện Hóa sinh biển.

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

  1. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư (MTT assay):

    • Nguyên tắc: Dựa trên khả năng của enzyme dehydrogenase trong ty thể của tế bào sống khử muối tetrazolium MTT màu vàng thành phức hợp formazan màu tím đen (theo phương pháp của Tim Mosman 1983, sửa đổi bởi Alley). Mật độ quang được đo tại bước sóng 540 nm.
    • Thực nghiệm: Thực hiện tại Khoa Dược, Đại học Quốc gia Chungnam và Đại học Yonsei, Hàn Quốc. Tế bào ung thư người ($3 \times 10^5\text{ tế bào/mL}$) được nuôi trong môi trường RPMI 1640 (bổ sung 10% FBS, 100 U/mL penicillin, $100\ \mu\text{g/mL}$ streptomycin) ở 37°C, 5% $\text{CO}_2$.
    • Nồng độ mẫu thử: 0,01; 0,1; 1; 10; 50 và $100\ \mu\text{M}$ trong 3 ngày. Chất đối chứng dương: mitoxantrone; đối chứng âm: DMSO 1%. Thêm $0,1\ \mu\text{g}$ MTT/giếng, ủ 4 giờ ở 37°C, ly tâm 1000 rpm trong 5 phút, hòa tan formazan bằng $150\ \mu\text{L}$ DMSO và đo OD tại 540 nm trên máy đọc microplate.
    • Xử lý số liệu: Tỷ lệ tế bào sống sót ($CS%$) tính theo công thức: $$CS% = \frac{OD(\text{mẫu}) - OD(\text{trắng})}{OD(\text{DMSO}) - OD(\text{trắng})} \times 100$$ $$% \text{ ức chế} = 100% - CS%$$ Giá trị $IC_{50}$ được tính bằng phần mềm Table curve dựa trên thang logarit của nồng độ chất và $CS%$.

  2. Đánh giá hoạt tính ức chế enzym tyrosinase:

    • Nguyên tắc: Đo mật độ quang của phản ứng oxy hóa cơ chất L-tyrosine dưới tác dụng xúc tác của tyrosinase (chiết xuất từ nấm, hãng Sigma-Aldrich). Cường độ hấp thụ quang tỷ lệ thuận với hoạt tính của enzym.
    • Quy trình: Dung dịch gốc mẫu thử ($10\text{ mM}$ trong DMSO) được pha loãng trong đệm phosphat ($50\text{ mM}$, pH 6,5) thành các nồng độ làm việc (1,0; 5,0; 10,0; 20,0 và $50,0\ \mu\text{M}$). Hỗn hợp phản ứng trên đĩa 96 giếng gồm: $130\ \mu\text{L}$ dung dịch tyrosinase ($113,3\text{ U/mL}$), $20\ \mu\text{L}$ chất thử, $50\ \mu\text{L}$ dung dịch L-tyrosine ($2,0\text{ mM}$).
    • Đo quang: Phản ứng ủ ở 37°C, đo mật độ quang tại bước sóng 475 nm liên tục mỗi phút 1 lần trong suốt 20 phút. Chất đối chứng dương là acid kojic; đối chứng âm là dung dịch đệm.
    • Xử lý thống kê: Thí nghiệm lặp lại độc lập 3 lần. Số liệu biểu diễn dưới dạng $\text{Trung bình} \pm \text{SD}$. Xử lý số liệu bằng phần mềm GraphPad 6.0 với phân tích phương sai ANOVA và kiểm định Dunnett post-hoc ($p < 0,05$).

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày bối cảnh khoa học về vai trò của nguồn tài nguyên cây thuốc tại Việt Nam, tổng quan vị trí chi Trichosanthes trong hệ thống thực vật học (Giới: Plantae, Ngành: Magnoliophyta, Lớp: Magnoliopsida, Bộ: Cucurbitales, Họ: Cucurbitaceae). Nêu rõ tính cấp thiết, mục tiêu và 3 nội dung chính của luận án.

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tư liệu khoa học bao gồm:

  1. Đặc điểm thực vật học chi Trichosanthes L.: Mô tả chi tiết hình thái thân thảo leo quấn, lá phân thùy (hoặc lá kép giả như T. pedata), tua cuốn 2–5 nhánh, hoa đơn tính khác gốc hoặc cùng gốc (T. cucumerina), cấu tạo đài hoa xòe 5 thùy có tua dài ở mép tràng hoa; quả mọng dạng tròn, trứng hoặc kéo dài; hạt 1 ô hoặc 3 ô (như T. pilosa). Thống kê danh sách 12 loài thuộc chi Trichosanthes tại Việt Nam và vùng phân bố địa lý.
  2. Tình hình sử dụng trong y học cổ truyền: Phân tích công dụng của các loài Qua lâu trong các bài thuốc dân gian và cổ phương tại các địa phương (Bắc Kạn, Hòa Bình, Sa Pa, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Khánh Hòa) dùng chữa ho phế nhiệt, tắc tia sữa, đái tháo đường, vàng da, sốt rét, đau thắt ngực do co thắt mạch vành.
  3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học: Điểm luận chi tiết 131 hợp chất đã biết (64 triterpenoid, 26 steroid, 20 flavonoid, 5 lignan, 17 hợp chất chứa nitơ) và các kết quả nghiên cứu dược lý in vitro (gây độc tế bào, ức chế EBV-EA, ức chế NF-$\kappa$B, ức chế HIF-1, kháng viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn).
  4. Mô tả chi tiết 3 loài nghiên cứu: Trình bày đặc điểm hình thái, phân bố, tính vị công năng và bộ phận dùng của T. baviensis Gagnep., T. anguina L. và T. kirilowii Maxim.
STT Tên khoa học Tên thông thường Bộ phận nghiên cứu trong luận án Địa điểm thu hái Ký hiệu mẫu tiêu bản
1 Trichosanthes baviensis Gagnep. Qua lâu Ba Vì, Dưa núi Toàn cây Ba Vì, Hà Nội (9/2011) NCCT-TB1109
2 Trichosanthes anguina L. Mướp tây, Mướp hổ, Bí con rắn Lá Hòa Bình (8/2013) NCCT-TA1308
3 Trichosanthes kirilowii Maxim. Qua lâu, Dưa trời, Dây bạc bát Rễ củ Hòa Bình (9/2012) NCCT-TK1209

Chương 2: Thực nghiệm và kết quả

Chương 2 trình bày toàn bộ quy trình thực nghiệm phân lập, dữ liệu vật lý, thông số phổ và kết quả thử hoạt tính sinh học của 30 hợp chất:

  1. Phân lập từ Trichosanthes baviensis (14 hợp chất: TB1–TB14):
    • Từ cặn n-hexane (TBL1, 50,0 g), qua cột silica gel và RP-18 thu được: TB1 ($5,0\text{ mg}$), TB2 ($12,0\text{ mg}$), TB3 ($7,0\text{ mg}$), TB4 ($10,0\text{ mg}$), TB5 ($7,0\text{ mg}$), TB6 ($30,0\text{ mg}$).
    • Từ phân đoạn nước (TBL3), qua cột Diaion HP-20, silica gel và RP-18 thu được: TB7 ($30,0\text{ mg}$), TB8 ($20,0\text{ mg}$), TB9 ($10,0\text{ mg}$), TB10 ($12,0\text{ mg}$), TB11 ($8,0\text{ mg}$), TB12 ($6,0\text{ mg}$), TB13 ($6,0\text{ mg}$), TB14 ($7,0\text{ mg}$).
  2. Phân lập từ Trichosanthes anguina (8 hợp chất: TA1–TA8):
    • Từ cặn $CHCl_3$ (TAL1, 70,0 g), qua sắc ký cột silica gel và HPLC (cột J’sphere ODS H-80, eluent acetonitrile 50% trong nước, $3\text{ mL/phút}$) thu được: TA1 ($8,0\text{ mg}$) và TA2 ($6,0\text{ mg}$).
    • Từ cặn nước (TAL3), qua sắc ký silica gel và HPLC (acetonitrile 16% và 20% trong nước) thu được: TA3 ($14,0\text{ mg}$), TA4 ($4,0\text{ mg}$), TA5 ($6,0\text{ mg}$), TA6 ($8,0\text{ mg}$), TA7 ($6,0\text{ mg}$), TA8 ($5,0\text{ mg}$).
  3. Phân lập từ Trichosanthes kirilowii (8 hợp chất: TK1–TK8):
    • Từ cặn $CHCl_3$ (TKR1, 80,0 g), qua sắc ký cột silica gel và RP-18 thu được: TK1 ($7,0\text{ mg}$), TK2 ($6,0\text{ mg}$), TK3 ($9,0\text{ mg}$), TK4 ($20,0\text{ mg}$), TK7 ($8,0\text{ mg}$), TK8 ($30,0\text{ mg}$).
    • Từ phân đoạn nước (TKR3), qua cột Diaion HP-20 và Sephadex (MeOH:nước 1:1) thu được: TK5 ($10,0\text{ mg}$) và TK6 ($15,0\text{ mg}$).
  4. Đánh giá hoạt tính sinh học:
    • Thử nghiệm ức chế enzym tyrosinase trên các hợp chất từ T. baviensis (TB1–TB10) và T. anguina (TA1–TA8).
    • Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên các hợp chất từ T. kirilowii (TK1–TK8).

Chương 3: Thảo luận kết quả

Chương 3 biện giải chi tiết quá trình quy kết cấu trúc hóa học dựa trên tương tác phổ 1D/2D NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT, HSQC/HMQC, HMBC, COSY, NOESY/ROESY), phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS và phổ CD:

Ký hiệu Tên hợp chất Phân loại cấu trúc Nguồn gốc loài Tình trạng phát hiện
TB1 9,26-epoxymultiflorenol Triterpenoid T. baviensis Hợp chất mới
TB2 $\beta$-amyrin acetate Triterpenoid T. baviensis Đã biết
TB3 ergosta-6,22-dien-$3\beta,5\alpha,8\alpha$-triol Steroid T. baviensis Đã biết
TB4 spinasterol Steroid T. baviensis Đã biết
TB5 $4\alpha,14\alpha$-dimethyl-9,19-cyclo-$5\alpha,9\beta$-ergost-24(28)-en-$3\beta$-ol Steroid T. baviensis Đã biết
TB6 lup-20(29)-en-$3\beta$-ol Triterpenoid T. baviensis Đã biết
TB7 (+)-lyoniresinol $3\alpha\text{-O-}\beta\text{-D}$-glucopyranoside Lignan T. baviensis Đã biết
TB8 (-)-lyoniresinol $3\alpha\text{-O-}\beta\text{-D}$-glucopyranoside Lignan T. baviensis Đã biết
TB9 demethoxybergenin Dẫn xuất Isocoumarin T. baviensis Đã biết
TB10 bergenin Dẫn xuất Isocoumarin T. baviensis Đã biết
TB11 icariside $\text{F}_2$ Flavonoid glycoside T. baviensis Đã biết
TB12 nicotiflorin Flavonoid glycoside T. baviensis Đã biết
TB13 (6S,9S)-roseoside Megastigmane glucoside T. baviensis Đã biết
TB14 thymidine Nucleoside T. baviensis Đã biết
TA1 tricanguina A Megastigmane dẫn xuất T. anguina Hợp chất mới
TA2 tricanguina B Megastigmane dẫn xuất T. anguina Hợp chất mới
TA3 corchoionoside B Megastigmane glucoside T. anguina Đã biết
TA4 icariside $\text{B}_5$ Megastigmane glucoside T. anguina Đã biết
TA5 (3R,9S) 3,9-dihydroxymegastigman-5-ene $9\text{-O-}\beta\text{-D}$-glucopyranoside Megastigmane glucoside T. anguina Đã biết
TA6 icariside $\text{B}_1$ Megastigmane glucoside T. anguina Đã biết
TA7 kaempferol $3\text{-O-}\beta\text{-D}$-glucopyranoside-$(1\rightarrow 3)\text{-O-}\beta\text{-D}$-glucopyranoside Flavonoid glycoside T. anguina Đã biết
TA8 isopentyl $1\text{-O-}\beta\text{-D}$-glucopyranoside Alkyl glucoside T. anguina Đã biết
TK1 trichobenzolignan Lignan dẫn xuất T. kirilowii Hợp chất mới
TK2 ligballinol Lignan T. kirilowii Đã biết
TK3 (-)-pinoresinol Lignan T. kirilowii Đã biết
TK4 ehleticanol C (ehletianol C) Lignan T. kirilowii Đã biết
TK5 luteolin $7\text{-O-}\beta\text{-D}$-glucopyranoside Flavonoid glycoside T. kirilowii Đã biết
TK6 chrysoeriol $7\text{-O-}\beta\text{-D}$-glucopyranoside Flavonoid glycoside T. kirilowii Đã biết
TK7 $10\alpha$-cucurbita-5,24-dien-$3\beta$-ol Triterpenoid T. kirilowii Đã biết
TK8 arvenin I Triterpenoid glucoside T. kirilowii Đã biết

Chương này cũng tổng hợp danh mục toàn bộ các hợp chất phân lập được và thảo luận chi tiết về mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học (ức chế tyrosinase và gây độc tế bào ung thư) của các nhóm chất.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

  1. Phát hiện các hợp chất mới: Luận án đã phân lập, xác định cấu trúc và công bố 04 hợp chất mới chưa từng được ghi nhận trong y văn hóa học thế giới:
    • Hợp chất TB1 (9,26-epoxymultiflorenol): phân lập từ loài Qua lâu Ba Vì (Trichosanthes baviensis).
    • Hợp chất TA1 (tricanguina A): phân lập từ lá loài Mướp tây (Trichosanthes anguina).
    • Hợp chất TA2 (tricanguina B): phân lập từ lá loài Mướp tây (Trichosanthes anguina).
    • Hợp chất TK1 (trichobenzolignan): phân lập từ rễ củ loài Qua lâu (Trichosanthes kirilowii).
  2. Đóng góp dữ liệu hóa thực vật học:
    • Đây là công trình đầu tiên trên thế giới nghiên cứu thành phần hóa học của loài đặc hữu Trichosanthes baviensis, phân lập và xác định cấu trúc 14 hợp chất (TB1–TB14).
    • Bổ sung 8 hợp chất (TA1–TA8, trong đó có 2 chất mới và nhiều dẫn xuất megastigmane glucoside) cho nguồn dữ liệu hóa thực vật loài Trichosanthes anguina.
    • Phân lập và xác lập cấu trúc 8 hợp chất (TK1–TK8) từ rễ củ loài Trichosanthes kirilowii thu hái tại Hòa Bình, Việt Nam.

Đóng góp thực tiễn và định hướng ứng dụng

  1. Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của các hợp chất phân lập từ T. baviensis (TB1–TB10) và T. anguina (TA1–TA8), định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng hoạt chất tự nhiên ức chế sinh tổng hợp melanin trong ngành da liễu và mỹ phẩm.
  2. Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập từ rễ củ T. kirilowii (TK1–TK8), làm cơ sở khoa học giải thích các kinh nghiệm sử dụng chi Trichosanthes trong y học cổ truyền và định hướng tìm kiếm các hoạt chất có tiềm năng kháng ung thư.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Nghiên cứu tập trung vào 3 loài tại các địa điểm và thời điểm thu hái cụ thể (Ba Vì - Hà Nội, Hòa Bình); chưa khảo sát sự biến đổi hàm lượng hoạt chất theo mùa vụ, độ tuổi của cây và các vùng sinh thái khác nhau.
  • Các thử nghiệm sinh học mới dừng lại ở mức độ sàng lọc in vitro (hoạt tính ức chế enzym tyrosinase trên mô hình enzym nấm và thử độc tính tế bào ung thư theo phương pháp MTT); chưa thực hiện các thử nghiệm in vivo hoặc đánh giá chi tiết cơ chế phân tử tác động đối với các hợp chất mới.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng nghiên cứu thành phần hóa học trên các bộ phận khác (hoa, quả, hạt) của loài đặc hữu T. baviensis và các loài Qua lâu khác tại Việt Nam chưa được khảo sát.
  • Tiến hành thử nghiệm sâu hơn về cơ chế gây độc tế bào ung thư (chu trình tế bào, kích hoạt apoptosis, ức chế enzyme caspase/kinases) và thử nghiệm in vivo đối với các hợp chất có hoạt tính cao và 4 hợp chất mới (TB1, TA1, TA2, TK1).
  • Nghiên cứu phương pháp bán tổng hợp hoặc tối ưu hóa quy trình chiết tách để gia tăng hiệu suất thu hồi các hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ ứng dụng thực tế.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo dành cho:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa Dược và Dược liệu học: Cung cấp quy trình chi tiết về kỹ thuật chiết xuất phân đoạn, sắc ký cột pha thuận/pha đảo, sắc ký rây phân tử, sắc ký HPLC bán điều chế và các bước quy kết phổ NMR 2D (HSQC, HMBC, COSY, NOESY, ROESY), phổ HR-ESI-MS và CD đối với các hợp chất tự nhiên khung triterpenoid, lignan, steroid, megastigmane.
  • Các nhà nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc mới: Cung cấp bộ dữ liệu sàng lọc in vitro chuẩn xác về hoạt tính ức chế enzym tyrosinase và độc tính tế bào ung thư từ nguồn thảo dược Việt Nam.
  • Các nhà thực vật học và bảo tồn tài nguyên dược liệu: Cung cấp dẫn liệu hóa phân loại học (chemotaxonomy) phục vụ việc phân loại và bảo tồn các loài thực vật thuộc chi Trichosanthes, đặc biệt là loài đặc hữu Trichosanthes baviensis.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phát hiện ra bao nhiêu hợp chất có cấu trúc mới và thuộc những loài nào?

Luận án đã phát hiện và xác định cấu trúc của 04 hợp chất mới, bao gồm:

  • TB1 (9,26-epoxymultiflorenol): Hợp chất triterpenoid mới phân lập từ toàn cây Trichosanthes baviensis.
  • TA1 (tricanguina A): Hợp chất megastigmane mới phân lập từ lá Trichosanthes anguina.
  • TA2 (tricanguina B): Hợp chất megastigmane mới phân lập từ lá Trichosanthes anguina.
  • TK1 (trichobenzolignan): Hợp chất lignan mới phân lập từ rễ củ Trichosanthes kirilowii.

2. Quy trình thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym tyrosinase được tiến hành như thế nào?

Thử nghiệm sử dụng cơ chất L-tyrosine ($2,0\text{ mM}$) và enzym tyrosinase từ nấm ($113,3\text{ U/mL}$) pha trong đệm phosphat ($50\text{ mM}$, pH 6,5). Phản ứng thực hiện trên đĩa 96 giếng ở 37°C với các nồng độ mẫu thử từ 1,0 đến $50,0\ \mu\text{M}$. Mật độ quang được đo tại bước sóng 475 nm với tần suất 1 phút/lần liên tục trong suốt 20 phút. Phép thử sử dụng acid kojic làm đối chứng dương và dung dịch đệm làm đối chứng âm; số liệu được xử lý bằng phần mềm GraphPad 6.0 (ANOVA, kiểm định Dunnett, $p < 0,05$).

3. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư dựa trên nguyên lý gì?

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được đánh giá bằng phương pháp MTT (theo Mosman và Alley). Nguyên lý dựa vào khả năng enzyme dehydrogenase trong ty thể của tế bào sống khử muối tetrazolium MTT màu vàng thành tinh thể formazan màu tím đen không tan. Tinh thể này được hòa tan trong DMSO và đo mật độ quang (OD) tại bước sóng 540 nm. Tỷ lệ sống sót ($CS%$) và giá trị $IC_{50}$ phản ánh mức độ ức chế sinh trưởng của dòng tế bào thử nghiệm dưới tác dụng của chất thử (so sánh với đối chứng dương mitoxantrone).

4. Nguồn gốc mẫu thực vật nghiên cứu trong luận án được thu hái ở đâu và ai giám định tên khoa học?

  • Mẫu T. baviensis (NCCT-TB1109) thu hái tháng 9/2011 tại Ba Vì, Hà Nội.
  • Mẫu T. anguina (NCCT-TA1308) thu hái tháng 8/2013 tại Hòa Bình.
  • Mẫu T. kirilowii (NCCT-TK1209) thu hái tháng 9/2012 tại Hòa Bình. Toàn bộ mẫu nghiên cứu được PGS. Ninh Khắc Bản thuộc Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định tên khoa học và lưu trữ tiêu bản tại Viện.

5. Tổng số hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc trong luận án là bao nhiêu?

Tổng cộng có 30 hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc từ 3 loài thực vật nghiên cứu:

  • 14 hợp chất từ Trichosanthes baviensis (TB1–TB14: gồm triterpenoid, steroid, lignan, isocoumarin, flavonoid glycoside, megastigmane glucoside, nucleoside).
  • 08 hợp chất từ Trichosanthes anguina (TA1–TA8: gồm megastigmane, flavonoid glycoside, alkyl glucoside).
  • 08 hợp chất từ Trichosanthes kirilowii (TK1–TK8: gồm lignan, flavonoid glycoside, triterpenoid và triterpenoid glucoside).

Kết luận

Luận án đã hoàn thành toàn diện các mục tiêu nghiên cứu đặt ra đối với 3 loài thuộc chi Trichosanthes (T. baviensis, T. anguina, T. kirilowii) tại Việt Nam. Bằng các phương pháp sắc ký và phổ nghiệm hiện đại (HR-ESI-MS, NMR 1D/2D, CD), luận án đã phân lập và xác định cấu trúc 30 hợp chất, trong đó phát hiện 04 hợp chất có cấu trúc hoàn toàn mới (TB1, TA1, TA2, TK1) và công bố bộ dữ liệu hóa thực vật học đầu tiên cho loài đặc hữu T. baviensis. Đồng thời, các kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzym tyrosinase và gây độc tế bào ung thư in vitro đã cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học tin cậy, đóng góp vào kho tàng tri thức về hóa học các hợp chất thiên nhiên và định hướng tiềm năng ứng dụng nguồn dược liệu chi Trichosanthes tại Việt Nam.