Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất saponin từ hoa tam thất Panax pseudoginseng wall

• Tác giả: Phạm Thị Châm
• Người hướng dẫn: TS. Trần Thị Hồng Hạnh
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa học
• Đề tài: Phân lập và xác định cấu trúc saponin từ hoa tam thất Panax pseudoginseng
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC CÁC BẢNG
• 4. DANH MỤC CÁC HÌNH
• 5. MỞ ĐẦU
• 6. TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU TAM THẤT
• 6.1. Vị trí phân loại loài Panax pseudoginseng
• 6.2. Đặc điểm thực vật và phân bố loài Panax pseudoginseng Wall.
• 7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHI Panax
• 7.1. Tình hình nghiên cứu về hóa học
• 7.1.1. Các hợp chất Saponin
• 7.1.2. Saponin loại protopanaxadiol (PPD)
• 7.1.3. Saponin loại protopanaxatriol (PPT)
• 7.1.4. Các saponin loại oleanolic axit (OA)
• 7.1.5. Các saponin loại ocotillol (OT)
• 7.1.6. Các saponin khác
• 7.1.7. Phytosterol
• 7.1.8. Flavonoid
• 7.1.9. Polysaccharide
• 7.1.10. Axit béo
• 7.1.11. Các hợp chất khác
• 7.2. Tình hình nghiên cứu về hoạt tính sinh học
• 7.2.1. Tác dụng chống ung thư
• 7.2.2. Tác dụng chống viêm
• 8. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 9. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 9.1. Mục tiêu của luận văn
• 9.2. Các nội dung nghiên cứu
• 10. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 10.1. Phương pháp nghiên cứu hóa học
• 10.2. Phương pháp xử lý mẫu, tạo dịch chiết, phân lập các hợp chất
• 10.3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân
• 11. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM
• 11.1. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ HOA Panax pseudoginseng Wall.
• 11.1.1. Phân lập các hợp chất
• 11.1.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được
• 11.2. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 11.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC
• 11.3.1. Hợp chất 1: Ginsenoside F1
• 11.3.2. Hợp chất 2: Ginsenoside Rg1
• 11.3.3. Hợp chất 3: Notoginsenoside U
• 11.3.4. Hợp chất số 4: chất mới
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về dược liệu tam thất

Loài Panax pseudoginseng Wall. là một trong những dược liệu quý, được biết đến với nhiều tác dụng dược lý. Cây có chiều cao từ 30-50cm, với lá kép chân vịt và cụm hoa tán đơn. Hoa tam thất thường được sử dụng trong y học cổ truyền để hỗ trợ sức khỏe, đặc biệt là cho phụ nữ sau sinh và người mới ốm dậy. Nghiên cứu cho thấy, saponin trong hoa tam thất có tác dụng bổ dưỡng, cầm máu và giảm đau. Tuy nhiên, việc nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hoa tam thất vẫn còn hạn chế. Do đó, việc phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất saponin từ hoa tam thất là cần thiết để nâng cao giá trị sử dụng của cây dược liệu này.

1.1. Vị trí phân loại loài Panax pseudoginseng

Theo hệ thống phân loại, Panax pseudoginseng thuộc giới Plantae, bộ Apiales, họ Araliaceae. Loài này phân bố chủ yếu ở các vùng núi cao lạnh của Việt Nam, như Lào Cai, Hà Giang, và Cao Bằng. Cây ưa ẩm và bóng râm, thường được thu hoạch từ năm thứ 4 đến năm thứ 7 để đạt giá trị dược lý cao nhất. Việc nghiên cứu về cấu trúc hóa học của loài này sẽ giúp hiểu rõ hơn về các hoạt chất có trong cây, từ đó phát triển các sản phẩm dược phẩm hiệu quả.

II. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học của chi Panax

Chi Panax đã được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Đến nay, khoảng 760 hợp chất đã được phân lập, trong đó saponin là nhóm hợp chất được nghiên cứu nhiều nhất. Các nghiên cứu cho thấy saponin có nhiều hoạt tính sinh học như chống ung thư, kháng viêm và bảo vệ tế bào gan. Các hợp chất saponin trong chi Panax chủ yếu là triterpenoid, có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và cải thiện hệ miễn dịch. Việc phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất này sẽ mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển thuốc từ thiên nhiên.

2.1. Tình hình nghiên cứu về hóa học

Nghiên cứu về hóa học của chi Panax cho thấy sự đa dạng của các hợp chất như flavonoid, polysaccharid và phenol. Trong đó, saponin triterpenoid được chú ý nhiều nhất do hoạt tính sinh học mạnh mẽ. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng saponin trong các bộ phận của cây có sự khác biệt lớn, phụ thuộc vào loài, bộ phận và điều kiện sinh trưởng. Việc phân lập các hợp chất saponin từ hoa tam thất sẽ cung cấp thông tin quý giá cho các nghiên cứu tiếp theo về dược liệu này.

III. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu bao gồm việc chiết xuất và phân lập các hợp chất từ hoa Panax pseudoginseng. Các phương pháp hóa học như sắc ký cột và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được sử dụng để xác định cấu trúc của các hợp chất saponin. Việc áp dụng các công nghệ hiện đại trong nghiên cứu sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất. Điều này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu khoa học mà còn có thể ứng dụng trong sản xuất dược phẩm từ thiên nhiên.

3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập

Quá trình chiết xuất được thực hiện bằng cách sử dụng dung môi phù hợp để thu được dịch chiết từ hoa tam thất. Sau đó, các hợp chất được phân lập thông qua các phương pháp sắc ký khác nhau. Việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất saponin được thực hiện bằng các kỹ thuật phân tích hiện đại như NMR và MS. Những phương pháp này giúp xác định chính xác cấu trúc và tính chất của các hợp chất, từ đó đánh giá được giá trị dược lý của chúng.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy đã phân lập thành công một số hợp chất saponin từ hoa Panax pseudoginseng. Các hợp chất này được xác định có hoạt tính sinh học đáng kể, đặc biệt là trong việc chống ung thư và kháng viêm. Việc phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất này không chỉ cung cấp thông tin về thành phần hóa học mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển các sản phẩm dược liệu từ thiên nhiên. Những kết quả này có thể được ứng dụng trong y học hiện đại, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của hoa tam thất.

4.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

Các hợp chất phân lập được từ hoa tam thất đã được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phân tích hiện đại. Kết quả cho thấy các hợp chất này có cấu trúc tương tự như các saponin đã được biết đến trước đây, nhưng cũng có những đặc điểm mới. Việc xác định cấu trúc này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về hoạt tính sinh học của chúng mà còn có thể dẫn đến việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới từ thiên nhiên.

Tổng quan nghiên cứu

Tam thất (Panax pseudoginseng Wall.) là một dược liệu quý có giá trị y học lâu đời, được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền Việt Nam và Trung Quốc. Theo ước tính, chi Panax có khoảng 760 hợp chất đã được phân lập, trong đó saponin triterpenoid chiếm ưu thế và được nghiên cứu nhiều nhất do các hoạt tính sinh học đa dạng như chống ung thư, kháng viêm, bảo vệ gan, thần kinh và tim mạch. Tuy nhiên, các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của hoa tam thất, đặc biệt là hoa tam thất trồng tại Việt Nam, còn rất hạn chế.

Luận văn tập trung nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất saponin từ hoa tam thất Panax pseudoginseng Wall. thu hái tại Phó Bảng, Hà Giang vào tháng 7/2019. Mục tiêu chính là phân lập 3-4 hợp chất saponin từ dịch chiết hoa tam thất và xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp hóa lý hiện đại. Nghiên cứu nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc nâng cao giá trị sử dụng của tam thất, đồng thời làm tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu sâu hơn về dược liệu này tại Việt Nam.

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào phân đoạn nước của dịch chiết hoa tam thất, nơi tập trung chủ yếu các hợp chất saponin. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các sản phẩm dược liệu từ tam thất, góp phần bảo tồn và khai thác hiệu quả nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú của Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về hóa học tự nhiên và dược liệu, tập trung vào:

• Lý thuyết cấu trúc saponin triterpenoid: Saponin là glycosid có cấu trúc phức tạp, gồm phần aglycon (thường là dammarane) và các đơn vị đường gắn kèm. Các loại saponin chính trong chi Panax gồm protopanaxadiol (PPD), protopanaxatriol (PPT), oleanolic acid (OA) và ocotillol (OT), mỗi loại có đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học riêng biệt.

• Mô hình phân lập và xác định cấu trúc hợp chất thiên nhiên: Sử dụng các kỹ thuật sắc ký (TLC, sắc ký cột, MPLC) để phân tách hợp chất, kết hợp với phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) một chiều và hai chiều (1H-NMR, 13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC, NOESY) và phổ khối ion hóa phun điện phân giải cao (HR-ESI-MS) để xác định cấu trúc hóa học chi tiết.

• Khái niệm chính: Saponin dammarane, cấu trúc aglycon, đơn vị đường β-glucose, β-xylopyranosyl, phổ NMR, phổ HMBC, phổ HSQC, phổ COSY, phổ NOESY.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nguyên liệu là hoa tam thất Panax pseudoginseng Wall. thu hái tại Phó Bảng, Hà Giang, được giám định khoa học và bảo quản tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

• Phương pháp xử lý mẫu: Hoa tam thất được rửa sạch, sấy khô ở 50°C, xay nhỏ và chiết bằng methanol sử dụng siêu âm ở 40-50°C, thời gian chiết mỗi lần tối thiểu 60 phút, thực hiện 3 lần. Dịch chiết methanol được cô quay dưới áp suất giảm để thu dịch cô methanol.

• Phân đoạn dịch chiết: Dịch chiết methanol hòa tan trong nước, chiết phân lớp với n-hexan, diclometan để loại tạp, tập trung phân đoạn nước chứa saponin.

• Phân lập hợp chất: Sử dụng sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo, sắc ký lỏng trung áp (MPLC) với cột RP-18, sắc ký lớp mỏng TLC để theo dõi quá trình phân lập. Hệ dung môi được điều chỉnh theo độ phân cực tăng dần.

• Xác định cấu trúc: Phổ NMR một chiều (1H, 13C) và hai chiều (COSY, HSQC, HMBC, NOESY) trên máy Bruker Advance AM500 FT-NMR. Phổ khối ion hóa phun điện phân giải cao (HR-ESI-MS) để xác định công thức phân tử.

• Cỡ mẫu và timeline: Mẫu hoa tam thất 5 g khô được sử dụng cho mỗi lần chiết. Quá trình nghiên cứu thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 7/2019 đến khi hoàn thành luận văn.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập thành công 4 hợp chất saponin từ phân đoạn nước của hoa tam thất với khối lượng thu được lần lượt là 15 mg (hợp chất 3), 4,5 mg (hợp chất 4), cùng các phân đoạn khác. Các hợp chất được xác định gồm Ginsenoside F1, Ginsenoside Rg1, Notoginsenoside U và một hợp chất mới.

2. Xác định cấu trúc chi tiết các hợp chất bằng phổ NMR và HR-ESI-MS:

   • Hợp chất 1 (Ginsenoside F1) có công thức phân tử C36H62O9, đặc trưng bởi khung dammarane với 1 đơn vị đường β-glucose gắn tại C-20.
   • Hợp chất 2 (Ginsenoside Rg1) có công thức C42H72O14, gồm 2 đơn vị đường β-glucose gắn tại C-6 và C-20.
   • Hợp chất 3 (Notoginsenoside U) cũng thuộc nhóm dammarane với 2 đơn vị đường β-glucose liên kết tại C-6ʹ và C-20.
   • Hợp chất 4 là hợp chất mới với công thức C47H80O19, chứa 3 đơn vị đường (2 glucose và 1 xylose), có nhóm hydroperoxide tại C-8, cấu trúc được xác định dựa trên phổ COSY, HSQC, HMBC và NOESY.

3. So sánh số liệu phổ với tài liệu tham khảo cho thấy các hợp chất 1-3 phù hợp hoàn toàn với các hợp chất đã biết trong chi Panax, trong khi hợp chất 4 là phát hiện mới, mở rộng thêm kho tàng hợp chất saponin của tam thất.

4. Phân tích phổ HMBC và NOESY cho phép xác định chính xác vị trí các nhóm đường và nhóm thế hydroxy, nối đôi trong cấu trúc aglycon, góp phần làm rõ cấu trúc hóa học phức tạp của các saponin.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy hoa tam thất Panax pseudoginseng Wall. chứa các hợp chất saponin dammarane đa dạng, tương tự như các loài Panax khác đã được nghiên cứu trên thế giới. Việc phân lập thành công hợp chất mới với nhóm hydroperoxide tại C-8 là đóng góp quan trọng, mở ra hướng nghiên cứu mới về hoạt tính sinh học và ứng dụng dược lý của các saponin chưa được biết đến.

So với các nghiên cứu trước đây tập trung chủ yếu vào củ và nụ hoa, nghiên cứu này bổ sung thông tin về thành phần hóa học của hoa tam thất trồng tại Việt Nam, góp phần làm rõ sự đa dạng hóa học và tiềm năng dược liệu của cây. Các số liệu phổ NMR và HR-ESI-MS được trình bày chi tiết có thể được minh họa qua các bảng số liệu và biểu đồ phổ để thuận tiện cho việc tham khảo và so sánh.

Ngoài ra, việc xác định cấu trúc các hợp chất saponin giúp làm rõ cơ sở khoa học cho các hoạt tính sinh học đã được ghi nhận của tam thất như chống ung thư, chống viêm, bảo vệ gan và thần kinh. Các hợp chất saponin dammarane được biết đến có khả năng tương tác với các mục tiêu sinh học quan trọng, do đó nghiên cứu này góp phần hỗ trợ phát triển các sản phẩm dược liệu từ tam thất có hiệu quả cao và an toàn.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính sinh học của hợp chất mới và các saponin phân lập được nhằm đánh giá tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh lý như ung thư, viêm nhiễm, bảo vệ gan và thần kinh. Thời gian thực hiện dự kiến 1-2 năm, do các viện nghiên cứu dược liệu và trường đại học chuyên ngành.

2. Phát triển quy trình chiết tách và tinh chế các hợp chất saponin từ hoa tam thất quy mô bán công nghiệp để phục vụ sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng, hướng tới nâng cao giá trị kinh tế của cây tam thất tại Việt Nam. Chủ thể thực hiện là các doanh nghiệp dược liệu phối hợp với viện nghiên cứu.

3. Xây dựng cơ sở dữ liệu thành phần hóa học và phổ phân tử của tam thất trồng tại Việt Nam làm tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo và quản lý chất lượng dược liệu. Thời gian thực hiện 1 năm, do các viện nghiên cứu và cơ quan quản lý dược liệu.

4. Khuyến khích hợp tác quốc tế trong nghiên cứu và phát triển sản phẩm từ tam thất nhằm tận dụng kinh nghiệm và công nghệ hiện đại, đồng thời mở rộng thị trường xuất khẩu. Chủ thể thực hiện là các tổ chức nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu dược liệu và hóa học tự nhiên: Luận văn cung cấp dữ liệu chi tiết về thành phần saponin và phương pháp phân lập, xác định cấu trúc, hỗ trợ nghiên cứu chuyên sâu về dược liệu tam thất.

2. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng: Thông tin về các hợp chất hoạt tính và quy trình chiết tách giúp phát triển sản phẩm mới từ tam thất, nâng cao chất lượng và giá trị sản phẩm.

3. Cơ quan quản lý và kiểm định chất lượng dược liệu: Cơ sở khoa học để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng, kiểm soát nguồn nguyên liệu tam thất, đảm bảo an toàn và hiệu quả khi sử dụng.

4. Sinh viên và học viên cao học chuyên ngành Hóa dược, Dược học, Công nghệ sinh học: Tài liệu tham khảo quý giá về phương pháp nghiên cứu hóa học tự nhiên, kỹ thuật phân tích phổ và ứng dụng trong nghiên cứu dược liệu.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu tập trung vào hoa tam thất mà không phải củ hay nụ hoa?
   Hoa tam thất chứa nhiều hợp chất saponin đặc trưng chưa được nghiên cứu kỹ, bổ sung kiến thức về thành phần hóa học toàn diện của cây, đồng thời hoa dễ thu hái và xử lý hơn so với củ.

2. Phương pháp phân lập hợp chất có ưu điểm gì?
   Sử dụng kết hợp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo, cùng sắc ký lỏng trung áp giúp tách chiết hiệu quả, thu được hợp chất tinh khiết với số lượng đủ cho phân tích cấu trúc.

3. Các kỹ thuật phổ NMR và MS được sử dụng như thế nào để xác định cấu trúc?
   Phổ 1H và 13C-NMR cung cấp thông tin về nguyên tử hydro và cacbon, phổ hai chiều (COSY, HSQC, HMBC, NOESY) giúp xác định liên kết và vị trí nhóm thế, phổ HR-ESI-MS xác định công thức phân tử chính xác.

4. Hợp chất mới được phát hiện có ý nghĩa gì?
   Hợp chất mới mở rộng kho tàng hợp chất saponin của tam thất, có thể có hoạt tính sinh học đặc biệt, tạo tiền đề cho nghiên cứu phát triển thuốc mới từ dược liệu thiên nhiên.

5. Nghiên cứu này có thể ứng dụng thực tiễn như thế nào?
   Kết quả giúp phát triển sản phẩm dược liệu chất lượng cao, hỗ trợ bảo tồn và khai thác bền vững tam thất, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc.

Kết luận

• Phân lập thành công 4 hợp chất saponin từ hoa tam thất Panax pseudoginseng Wall., trong đó có 3 hợp chất đã biết và 1 hợp chất mới.
• Xác định cấu trúc chi tiết các hợp chất bằng phổ NMR một chiều, hai chiều và phổ khối ion hóa phun điện phân giải cao.
• Hợp chất mới có cấu trúc phức tạp với nhóm hydroperoxide, mở rộng kiến thức về thành phần hóa học của tam thất.
• Nghiên cứu góp phần làm rõ cơ sở khoa học cho các hoạt tính sinh học của tam thất, hỗ trợ phát triển dược liệu và sản phẩm từ tam thất tại Việt Nam.
• Đề xuất nghiên cứu tiếp tục hoạt tính sinh học, phát triển quy trình chiết tách quy mô lớn và xây dựng cơ sở dữ liệu thành phần hóa học tam thất.

Luận văn là tài liệu tham khảo quan trọng cho các nhà nghiên cứu, doanh nghiệp và cơ quan quản lý trong lĩnh vực dược liệu. Các bước tiếp theo nên tập trung vào đánh giá hoạt tính sinh học và ứng dụng thực tiễn nhằm phát huy tối đa giá trị của tam thất.