Tổng quan luận án

Việt Nam sở hữu hệ thực vật nhiệt đới phong phú với khoảng 12.000 loài, trong đó ước tính khoảng một phần ba số loài được sử dụng trong y học cổ truyền. Việc nghiên cứu các cây thuốc nhằm tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao phục vụ sản xuất dược phẩm là một hướng nghiên cứu quan trọng trong hóa học các hợp chất thiên nhiên và dược học.

Theo Từ điển cây thuốc Việt Nam, chi Đẻn (Vitex), thuộc họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae), gồm nhiều loài được sử dụng trong dân gian để điều trị cảm mạo, sốt rét, ho, hen suyễn, rối loạn tiêu hóa và các bệnh ngoài da. Các nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng chi Vitex chứa nhiều nhóm hoạt chất đa dạng như terpenoid, ecdysteroid, flavonoid, lignan, iridoid, đồng thời thể hiện các hoạt tính sinh học như gây độc tế bào ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa và kháng viêm.

Tuy nhiên, tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Vitex còn rất hạn chế. Trước thời điểm thực hiện luận án, trong nước mới chỉ có khoảng 5 công bố về hóa học của một số loài thuộc chi này và chưa có công bố nào về hoạt tính sinh học. Đối với loài Vitex limonifolia Wall. ex C.B. Clarke, các công bố quốc tế mới chỉ dừng lại ở thành phần hóa học của tinh dầu và chưa từng được nghiên cứu tại Việt Nam. Đối với loài Vitex trifolia L., dù trên thế giới có hơn 40 công trình, song tại Việt Nam mới chỉ có 1 công trình khảo sát về quả. Do đó, luận án được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống dữ liệu thực nghiệm về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hai loài này.

Mục tiêu nghiên cứu:

  • Xác định thành phần hóa học chủ yếu của lá hai loài Vitex limonifolia Wall. ex C.B. Clarke và Vitex trifolia L.
  • Đánh giá hoạt tính kháng viêm và hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất phân lập được.

Nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu (đánh số theo văn bản):

  1. Phân lập các hợp chất từ lá loài Vitex limonifolia và Vitex trifolia ở Việt Nam bằng các phương pháp sắc ký;
  2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý, hóa học;
  3. Đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập được từ loài Vitex limonifolia và Vitex trifolia;
  4. Đánh giá hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất phân lập được từ loài Vitex trifolia.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lá của loài bình linh vàng chanh (Vitex limonifolia Wall. ex C.B. Clarke) và mẫu lá của loài mạn kinh (Vitex trifolia L.).
  • Địa điểm và thời gian thu hái: Cả hai mẫu thực vật được thu hái tại Vườn quốc gia Bạch Mã, tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam vào tháng 9 năm 2015.
  • Giám định tên khoa học: Tên khoa học được TS. Nguyễn Thế Cường (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật) và PGS. Ninh Khắc Bản giám định. Mẫu tiêu bản nghiên cứu được lưu giữ tại Phòng Nghiên cứu tài nguyên sinh vật, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với mã số lưu trữ lần lượt là TNSVB-01 (Vitex limonifolia) và TNSVB-02 (Vitex trifolia).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Đặc điểm thực vật và danh mục chi Vitex tại Việt Nam

Chi Vitex thuộc họ Verbenaceae, bộ Lamiales, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta. Chi này có khoảng 250 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, các tài liệu thực vật học ghi nhận có 20 loài phân bố từ vùng núi cao đến vùng ven biển.

TT Tên khoa học Tên tiếng Việt
1 Vitex canescens Kurz Đẻn lông, Mẫu kinh lông tro
2 Vitex glabrata Đẻn nhẵn
3 Vitex negundo Ngũ trảo, Hoàng kinh, Chân chim
4 Vitex cannabifolia Mẫu kinh, Ngũ trảo lá có răng
5 Vitex tripinnata (Lour.) Merr. San trắng, Cây chân vịt
6 Vitex pubescens Vahl Bình linh lông, Cây năng
7 Vitex ptilota Bình linh cánh, Cây nàng, Suông gia
8 Vitex quinata (Lour.) F.N. Williams Mẫu kinh núi, Mẫu kinh năm lá, Đẹn năm lá
9 Vitex puberula Moldenke Mẫu kinh núi lông ngắn, Mạn kinh lông
10 Vitex ovata Thunb. Bình linh xoan, Từ bi biển, Quan âm biển
11 Vitex trifolia L. Mạn kinh, Đẹn ba lá, Quan âm
12 Vitex heterophylla Mắt cáo, Chân chim ba lá
13 Vitex tripinnata var. evrardii (P. Dop) Phuong Chân chim evrard
14 Vitex limonifolia Wall. ex C.B. Clarke Bình linh vàng chanh
15 Vitex vestita Wall. ex Schauer Đẻn lông nhung
16 Vitex pierrei Craib Bình linh pierrei
17 Vitex longisepala Dop Bình linh vòi dài
18 Vitex curtisii Dop Bình linh nghệ
19 Vitex pierreana Dop Đẻn dài, Bình linh đá
20 Vitex pierreana var. chartacea Dop Đẻn lá như giấy

Các nhóm hợp chất hóa học chính đã công bố từ chi Vitex

Đến nay, trên thế giới có khoảng 28 loài thuộc chi Vitex đã được nghiên cứu về thành phần hóa học, bao gồm các nhóm chất chính:

  1. Triterpenoid: Gồm các khung ursane (chất 1–17 như 3β-hydroxy-11-oxours-12-ene, tormentic acid, ursolic acid acetate, negundonorin A–B, 2α,3β-hydroxyursolic acid), oleanane và friedelane (chất 18–24 như oleanolic acid, 3α-friedelinol), và lupane (chất 25–29 như lupeol, betulinic acid, obtusalin, platanic acid).
  2. Ecdysteroid: Khoảng 29 hợp chất (chất 30–58) được phân lập chủ yếu từ rễ và thân lá, tiêu biểu như 20-hydroxyecdysone, shidasterone, ajugasterone C, abutasterone, canescensterone, pterosterone, turkesterone, makisterone A.
  3. Labdane diterpenoid: Đây là lớp chất phong phú với 74 hợp chất (chất 59–132) đã được công bố, gồm negundoin A–E, vitetrifolin B–I, vitextrifolin A–G, viteagnusin A–H, viterotulin A–B, rotundifuran, vitexilactone B–C, vitexlactam A.
  4. Lignan và Neolignan: Tổng cộng 42 hợp chất (chất 133–174) như sesamin, paulownin, vitelignin A, cannabilignin, vitexdoin A–I, vitrofolal A–F, negundin A–B.
  5. Flavonoid: 54 hợp chất (chất 175–228) gồm vitecetin, casticin, artemetin, penduletin, vitexicarpin, chrysosplenol D, chrysoplenetin, vitexin, luteolin và các dẫn xuất glycoside.
  6. Iridoid: 18 hợp chất (chất 229–246) gồm agnuside, agnusoside, pedunculariside, aucubin, mussaenosidic acid, agnucastoside A–C, iridolactone.
  7. Các hợp chất khác: Các dẫn xuất phenolic, chalcone (cardamomin, helichrysetin, các hợp chất hydroxy-dimethoxychalcone), tocopherol và phytosterol.

Nghiên cứu về hoạt tính sinh học từ chi Vitex

  • Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Tinh dầu V. agnus-castus thể hiện hoạt tính trên dòng HeLa (IC50 = 0,12 µg/mL), LS180 và A549 (Zhelev); dịch chiết n-butanol của V. trifolia ức chế dòng HepG2; các hợp chất labdane từ V. vestita (vitexolide A–E, vitexolin A–B) ức chế dòng HCT-116 và MRC-5 (Corlay và cộng sự); vitetrifolin H và I từ V. trifolia ức chế tế bào HeLa (IC50 = 4–28 µM, Wu và cộng sự); rotundifuran từ V. rotundifolia ức chế tế bào HL-60 (IC50 = 22,5 µM); casticin từ V. simplicifolia ức chế tế bào PANC-1 và K562 (IC50 lần lượt là 4,67 và 0,72 µg/mL, M. Huang và cộng sự); chrysoplenetin từ V. negundo ức chế dòng NCI-H522, OVCAR-3 và PC-3 với IC50 từ 0,12–0,18 µM (Awale và cộng sự).
  • Hoạt tính kháng viêm, giảm đau: Dịch chiết lá V. negundo có tác dụng giảm đau và kháng viêm cấp tính trên chuột; dịch chiết hạt V. negundo làm giảm nồng độ TNF-α, IL-1β, IL-6 và tăng IL-10 trong huyết thanh chuột viêm khớp (Zeng và cộng sự); các hợp chất negundoin B và C ức chế sản sinh nitric oxide (NO) trên đại thực bào RAW 264.7 kích thích bởi LPS với IC50 lần lượt là 0,12 và 0,23 µM, đồng thời ức chế biểu hiện iNOS và COX-2 (Zeng và cộng sự); các iridoid agnuside và pedunculariside ức chế chọn lọc COX-2 với IC50 tương ứng 0,15 mg/mL và 0,026 mg/mL (Suksamrarn).
  • Hoạt tính kháng virus và vi sinh vật: Dịch chiết ethanol lá V. negundo tác động lên quá trình phiên mã ngược của HIV-1; chalcone 3-(4-hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trimethoxyphenyl)-2-propen-1-one từ V. leptobotrys ức chế sự sao chép của HIV-1 tới 77% ở nồng độ 15,9 µM (W. Pan và cộng sự); vitexolide A từ V. vestita ức chế vi khuẩn Gram dương với MIC = 12 µM trên Bacillus sp. và Streptococcus agalactiae; chrysosplenol D từ V. negundo ức chế Pseudomonas fluorescens với nồng độ ức chế tối thiểu 500 µg/mL (T. Ling và cộng sự); vitegnoside và negundoside ức chế nấm Trichophyton mentagrophytes và Cryptococcus neoformans với MIC = 6,25 µg/mL (Sathiamoorthy và cộng sự).

Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và khoảng trống nghiên cứu

Tại Việt Nam, số lượng nghiên cứu về chi Vitex còn rất ít:

  • Năm 1998, Trần Văn Sung và cộng sự phân lập các hợp chất chalcone và ecdysteroid từ loài V. leptobotrys, trong đó xác định 3 hợp chất mới là 2',4'-dihydroxy-4,6'-dimethoxychalcone, 4'-hydroxy-4,2',6'-trimethoxychalcone và 4,2',4',β-tetrahydroxy-6'-methoxy-α,β-dihydrochalcone.
  • Năm 2014, Trần Huy Thái và cộng sự nghiên cứu thành phần tinh dầu lá và quả loài V. ovata.
  • Năm 2016, Đỗ Ngọc Đại và cộng sự công bố thành phần tinh dầu loài V. quinata với các cấu tử chính là β-pinene (30,1%), β-caryophyllene (26,9%) và β-elemene (7,4%).
  • Năm 2004, có 1 nghiên cứu công bố về thành phần hóa học của quả loài V. trifolia.

Do đó, khoảng trống nghiên cứu mà luận án trực tiếp giải quyết là thực hiện phân lập hệ thống các hợp chất hóa học từ lá loài Vitex limonifolia (chưa từng được nghiên cứu tại Việt Nam) và lá loài Vitex trifolia, đồng thời lần đầu tiên đánh giá thực nghiệm hoạt tính kháng viêm (in vitro qua mô hình ức chế NO trên tế bào BV2) và hoạt tính kháng virus (in vitro trên các chủng CVB3, EV71, HRV1B) của các hợp chất phân lập được.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

Cơ chế bệnh lý của quá trình viêm và vai trò của Nitric Oxide

Quá trình viêm là phản ứng bảo vệ tại chỗ của cơ thể trước tổn thương hoặc kích thích mô, diễn biến qua 3 giai đoạn:

  1. Giai đoạn I (Tổn thương tổ chức): Giải phóng các chất trung gian gây viêm (mediator) như histamine, serotonin, prostaglandin, men lysosome, lymphokine, kinin.
  2. Giai đoạn II (Rối loạn mạch máu và thoát dịch rỉ viêm): Bạch cầu trung tính, đại thực bào, tế bào lympho di chuyển tới ổ viêm để thực bào và kích hoạt đáp ứng miễn dịch.
  3. Giai đoạn III (Tăng sinh tổ chức): Đại thực bào định cư, tế bào hạt, nguyên bào sợi và mạch máu tân tạo phát triển để hàn gắn tổn thương.

Nitric oxide (NO) là phân tử truyền tín hiệu quan trọng do enzyme inducible nitric oxide synthase (iNOS) tổng hợp khi đại thực bào hoặc tế bào vi bọc đệm bị kích thích bởi độc tố vi khuẩn (như Lipopolysaccharide - LPS). Sự sản sinh quá mức NO dẫn đến tổn thương mô và duy trì tình trạng viêm mạn tính. Do đó, mức độ ức chế sản sinh NO in vitro được sử dụng làm chỉ thị định lượng đánh giá tiềm năng kháng viêm của các hợp chất tự nhiên.

Cơ chế của các thuốc kháng virus

Virus có kích thước nhỏ (20–300 nm), cấu trúc cơ bản gồm lõi acid nucleic (ADN hoặc ARN), vỏ capsid bằng protein và ở một số chủng có thêm lớp màng bao ngoài (envelop) chứa glycoprotein cùng các enzyme cấu trúc (polymerase, men phiên mã ngược). Thuốc kháng virus tác động bằng cách ức chế các giai đoạn trong chu kỳ nhân lên của virus (bám màng, cởi vỏ, tổng hợp vật liệu di truyền, lắp ráp hoặc giải phóng hạt virus).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Phương pháp chiết xuất và phân lập

  • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng pha thường DC-Alufolien 60 F254 (độ dày 0,25 mm, Merck) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254s (Merck). Phát hiện vết chất dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc phun thuốc thử dung dịch H2SO4 10% rồi hơ nóng.
  • Sắc ký cột (CC): Sử dụng các pha tĩnh gồm Silica gel (cỡ hạt 0,040–0,063 mm / 230–400 mesh), pha đảo RP-18 (kích thước hạt 30–50 µm, Fuji Silysia Chemical Ltd.), nhựa hấp phụ Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Co.) và Sephadex LH-20.

2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

  • Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS): Đo trên máy FT-ICR-MS (Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và máy Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS (Viện Hóa sinh biển và Đại học Yonsei, Hàn Quốc).
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker DRX 500 MHz (chất chuẩn nội TMS, Viện Hóa học, VAST). Thực hiện các kỹ thuật 1D-NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và 2D-NMR (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY) trong dung môi DMSO-d6 hoặc CD3OD.
  • Phổ lưỡng sắc tròn (CD) và tính toán lý thuyết: Đo phổ CD thực nghiệm trên thiết bị Chirascan CD spectrometer (Applied Photophysics Ltd., Surrey, UK). Tính toán phổ CD lý thuyết thông qua tìm kiếm cấu dạng trên Spartan 14, tối ưu hóa cấu trúc trên Gaussian 09 và hiệu chỉnh phân bố Boltzmann bằng phần mềm SpecDis v1.61.
  • Độ quay cực ([α]D): Đo trên máy phân cực kế JASCO P-2000 polarimeter tại Viện Hóa sinh biển.

3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro

Thực nghiệm tiến hành tại Khoa Dược, Đại học Yonsei, Hàn Quốc qua 4 bước:

  1. Nuôi cấy tế bào: Tế bào vi bọc đệm BV2 được nuôi trong môi trường DMEM–F12 bổ sung 10% FBS, penicillin 100 IU/mL, streptomycin 100 µg/mL ở 37°C, 5% CO2.
  2. Kiểm tra độc tính tế bào (MTT assay): Tế bào BV2 (3 × 10^5 tế bào/giếng) ủ với mẫu thử trong 48 giờ; sau đó bổ sung 10 µL MTT (2 mg/mL trong PBS), ủ 4 giờ, hòa tan tinh thể formazan bằng 50 µL DMSO và đo mật độ quang OD ở bước sóng 540 nm.
  3. Đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO (Griess assay): Tế bào BV2 ủ với mẫu thử ở các dải nồng độ trong 2 giờ, kích thích bằng 0,5 µg/mL LPS trong 24 giờ. Trộn 100 µL dịch nuôi cấy với 100 µL thuốc thử Griess (1% sulfanilamide, 0,1% naphthylethylenediamine dihydrochloride trong 2% H3PO4), ủ 15 phút và đo OD ở bước sóng 525 nm bằng máy đọc ELISA. Đối chứng dương: L-NMMA. Đối chứng âm: LPS (0,5 µg/mL).
  4. Xử lý số liệu: Tính toán tỷ lệ phần trăm ức chế NO, xây dựng đường cong liều - đáp ứng và tính giá trị IC50 bằng phương pháp hồi quy phi tuyến trên phần mềm GraphPad Prism 6. Thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần.

4. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng virus in vitro

Thực nghiệm thực hiện tại Khoa Dược, Đại học Yonsei, Hàn Quốc:

  • Chủng virus và dòng tế bào: Coxsackievirus B3 (CVB3) và Enterovirus 71 (EV71) nuôi cấy trên tế bào thận khỉ xanh Vero; Human rhinovirus 1B (HRV1B) nuôi cấy trên tế bào biểu mô ung thư HeLa.
  • Quy trình thử nghiệm (SRB assay): Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB). Sàng lọc độc tính tế bào của mẫu thử để chọn các chất không gây độc (CC50 > 50 µM). Tế bào (2 × 10^4 tế bào/giếng) được gây nhiễm virus ở liều TCID50 và tiếp xúc với chất thử ở các nồng độ 0,1; 1,0; 10,0 và 100 µM trong 2 ngày ở 37°C, 5% CO2.
  • Nhuộm và đo quang: Cố định tế bào bằng acetone 70% lạnh (-20°C) trong 30 phút, sấy khô ở 60°C, nhuộm bằng 100 µL dung dịch SRB 0,4% (trong 1% acid acetic) trong 30 phút, rửa sạch bằng acid acetic 1%, hòa tan protein gắn thuốc nhuộm bằng 100 µL đệm Tris-base (10 mM) và đo OD ở bước sóng 540 nm trên máy VERSAmax microplate reader.
  • Chất đối chứng dương: Rupintrivir (đối với CVB3 và EV71) và Ribavirin (đối với HRV1B). Xử lý số liệu tính IC50 trên phần mềm GraphPad Prism 6.

Nội dung chính theo từng chương

Phần Mở đầu

Trình bày tổng quan về tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu nguồn dược liệu tự nhiên của Việt Nam, đặc biệt là chi Vitex. Nêu rõ mục tiêu xác định thành phần hóa học của lá hai loài Vitex limonifolia và Vitex trifolia, đồng thời đánh giá hoạt tính kháng viêm và kháng virus in vitro của các hợp chất phân lập. Xác lập 4 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể của luận án.

Chương 1: Tổng quan

Chương này tổng thuật toàn diện các dữ liệu thực vật, hóa học và dược lý liên quan đến đề tài:

  • Đặc điểm thực vật: Mô tả hình thái chi Vitex và liệt kê chi tiết danh mục 20 loài đã ghi nhận tại Việt Nam.
    • Vitex limonifolia: Cây gỗ nhỏ cao 8–10 m, cuống chung dài 5–7 cm có cánh rộng 20–25 mm, lá kép chân vịt 3–5 lá chét; phân bố tại Bắc Giang, Bắc Ninh, Ninh Thuận, Thừa Thiên Huế và một số nước châu Á (Ấn Độ, Myanmar, Lào, Campuchia, Thái Lan).
    • Vitex trifolia: Cây bụi lớn hoặc gỗ nhỏ, lá kép 3 lá chét phủ đầy lông trắng ở mặt dưới, hoa màu lam nhạt hoặc tím nhạt, quả hạch hình cầu màu đen khi chín; phân bố ở độ cao dưới 100 m tại nhiều tỉnh từ Quảng Ninh, Hà Nội, Thanh Hóa, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam đến Tiền Giang.
  • Tổng quan hóa học và hoạt tính sinh học: Tổng hợp 283 hợp chất tiêu biểu đã biết từ chi Vitex thuộc các nhóm triterpenoid (ursane, oleanane, friedelane, lupane), ecdysteroid, labdane diterpenoid, lignan, flavonoid, iridoid, chalcone. Trình bày chi tiết các công trình nghiên cứu hoạt tính sinh học trên thế giới về tác dụng gây độc tế bào, kháng viêm, kháng virus HIV-1, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa và hạ đường huyết.
  • Tổng quan y dược học: Trình bày lý thuyết cơ bản về các giai đoạn của phản ứng viêm, vai trò của chất trung gian hóa học NO, enzyme iNOS, COX-1, COX-2, các nhóm thuốc chống viêm NSAIDs, glucocorticoids; cấu trúc hạt virus và nguyên lý các phương pháp sàng lọc thuốc kháng virus.

Chương 2: Thực nghiệm và Kết quả phân lập

Chương này trình bày toàn bộ quy trình thực nghiệm thu thập mẫu, chiết tách phân đoạn và phân lập các hợp chất tinh khiết từ hai loài thực vật nghiên cứu.

1. Phân lập các hợp chất từ lá loài Vitex limonifolia

Từ 4,2 kg bột lá khô V. limonifolia, chiết siêu âm với methanol (3 lần × 10 L, 50°C, 1 giờ/lần) thu được 350 g cặn chiết thô. Hòa tan cặn chiết trong 2 L nước cất, chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với dichloromethane và ethyl acetate, thu được:

  • Cặn dichloromethane (VIL1, khối lượng 130,0 g)
  • Cặn ethyl acetate (VIL2, khối lượng 27,0 g)
  • Lớp nước còn lại (VIL3)

Quy trình sắc ký phân lập từ phân đoạn VIL1 và VIL3 được tóm tắt trong bảng sau:

Phân đoạn ban đầu Phân đoạn trung gian Phương pháp sắc ký & Hệ dung môi rửa giải Hợp chất thu được Khối lượng thu được
VIL1 (130,0 g) VIL1B -> VIL1B1 Cột Silica gel (n-hexane:EtOAc 1,5:1) VL7 6,0 mg
VIL1B -> VIL1B3 Cột Silica gel (n-hexane:EtOAc 1,5:1) VL4
VL6		 4,4 mg
12,5 mg
VIL1C -> VIL1C1 Cột Sephadex LH-20 (MeOH:nước 1:1) VL5 2,5 mg
VIL1C -> VIL1C2 Cột Silica gel (CH2Cl2:MeOH 17:1) VL3 14,0 mg
VIL1C -> VIL1C3 Cột Silica gel (n-hexane:EtOAc 1,4:1) VL8 10,3 mg
VIL1D -> VIL1D2A Cột Silica gel (n-hexane:EtOAc 1,4:1) VL9
VL10		 18,0 mg
4,5 mg
VIL1D -> VIL1D2C Cột Silica gel (n-hexane:EtOAc 1,4:1) VL11 7,0 mg
VIL1D -> VIL1D4A Cột Silica gel (CH2Cl2:acetone 2,5:1) VL2 8,0 mg
VIL1D -> VIL1D4C Cột Silica gel (n-hexane:acetone 1,4:1) VL1 10,5 mg
VIL3 (Lớp nước) VIL3A -> VIL3A5A Cột Diaion HP-20 -> Cột RP-18 -> Cột Silica gel (EtOAc:MeOH:nước 3,5:1:0,15) VL12 9,2 mg

Tổng cộng đã phân lập được 12 hợp chất tinh khiết từ lá loài Vitex limonifolia, ký hiệu từ VL1 đến VL12.

2. Phân lập các hợp chất từ lá loài Vitex trifolia

Từ 2,2 kg bột lá khô V. trifolia, chiết siêu âm với methanol (3 lần × 5 L, 50°C, 1 giờ/lần) thu được 130 g cặn chiết thô. Chiết phân bố lỏng - lỏng với dichloromethane và ethyl acetate thu được:

  • Cặn dichloromethane (VIT1, khối lượng 51,0 g)
  • Cặn ethyl acetate (VIT2, khối lượng 27,0 g)
  • Lớp nước còn lại (VIT3)

Quy trình sắc ký phân lập từ phân đoạn VIT2 và VIT3 được tóm tắt trong bảng sau:

Phân đoạn ban đầu Phân đoạn trung gian Phương pháp sắc ký & Hệ dung môi rửa giải Hợp chất thu được Khối lượng thu được
VIT2 (27,0 g) VIT2B -> VIT2B2 Cột RP-18 -> Cột Silica gel (n-hexane:EtOAc 1,1:1) VT15
VT16		 12,0 mg
10,0 mg
VIT2C Cột RP-18 (MeOH:nước 1,2:1) VT9
VT10		 9,0 mg
10,0 mg
VIT2D -> VIT2D1A Cột Sephadex LH-20 (MeOH:nước 1:1) VT1
VT3		 5,0 mg
9,0 mg
VIT2D -> VIT2D1C Cột Silica gel (CH2Cl2:acetone:nước 1,5:1:0,05) VT4
VT7		 10,0 mg
8,0 mg
VIT2D -> VIT2D2A Cột Silica gel (CH2Cl2:MeOH 12:1) VT8 8,0 mg
VIT2D -> VIT2D2B Cột Silica gel (CH2Cl2:acetone:nước 1:1:0,05) VT5 16,0 mg
VIT2D -> VIT2D3 Cột RP-18 (MeOH:nước 1:1,5) VT11 10,0 mg
VIT3 (Lớp nước) VIT3B -> VIT3B1 Cột Diaion HP-20 -> Cột Sephadex LH-20 (MeOH:nước 1:1) VT13 12,0 mg
VIT3B -> VIT3B2 Cột RP-18 (acetone:nước 1:3) VT2
VT6		 8,0 mg
12,0 mg
VIT3B -> VIT3B3 Cột Sephadex LH-20 (MeOH:nước 1:1) VT12 13,0 mg
VIT3C Cột RP-18 (MeOH:nước 1:1,5) VT14 15,0 mg

Tổng cộng đã phân lập được 16 hợp chất tinh khiết từ lá loài Vitex trifolia, ký hiệu từ VT1 đến VT16.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về khoa học và lý luận

  1. Về mặt hóa thực vật:
    • Đã xây dựng quy trình chiết xuất và phân lập bằng sắc ký nhiều bước (kết hợp Silica gel, RP-18, Diaion HP-20, Sephadex LH-20), thu nhận thành công 12 hợp chất tinh khiết (VL1–VL12) từ lá loài Vitex limonifolia và 16 hợp chất tinh khiết (VT1–VT16) từ lá loài Vitex trifolia thu hái tại Vườn quốc gia Bạch Mã, Thừa Thiên Huế.
    • Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học của lá loài Vitex limonifolia, đóng góp dữ liệu cấu trúc hóa học cho kho tàng hóa thực vật của chi Vitex.
  2. Về phương pháp xác định cấu trúc:
    • Ứng dụng đồng bộ và hiện đại các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D (1H, 13C, DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS kết hợp với đo phổ CD thực nghiệm và tính toán phổ CD lý thuyết lượng tử (Spartan 14, Gaussian 09, SpecDis v1.61) để xác định cấu hình lập thể của các hợp chất.

Đóng góp mới về thực tiễn và hoạt tính sinh học

  1. Hoạt tính kháng viêm in vitro:
    • Luận án lần đầu tiên đánh giá tác dụng kháng viêm của các hợp chất phân lập từ hai loài trên mô hình ức chế sản sinh NO trên tế bào vi bọc đệm thần kinh BV2 được kích thích bởi LPS.
    • Cung cấp dẫn chứng thực nghiệm làm sáng tỏ cơ sở khoa học của các bài thuốc kinh nghiệm dân gian sử dụng lá mạn kinh (Vitex trifolia) và các loài thuộc chi Vitex để điều trị đau nhức, cảm mạo và các bệnh viêm nhiễm.
  2. Hoạt tính kháng virus in vitro:
    • Thiết lập quy trình và đánh giá thực nghiệm hoạt tính kháng các chủng virus đường ruột (Enterovirus 71 - EV71, Coxsackievirus B3 - CVB3) và virus đường hô hấp (Human Rhinovirus 1B - HRV1B) bằng phương pháp nhuộm protein SRB.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Phạm vi thu mẫu thực vật mới chỉ thực hiện tại một địa điểm duy nhất là Vườn quốc gia Bạch Mã, tỉnh Thừa Thiên Huế vào thời điểm tháng 9 năm 2015, chưa so sánh biến động thành phần hóa học theo mùa hoặc theo các vùng sinh thái khác nhau.
  • Các thử nghiệm hoạt tính sinh học mới dừng lại ở quy mô in vitro trên các dòng tế bào nuôi cấy (BV2, Vero, HeLa), chưa tiến hành đánh giá tác dụng in vivo trên động vật thực nghiệm hoặc khảo sát độc tính bán trường diễn.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Tiếp tục khảo sát sâu hơn về cơ chế phân tử của các hợp chất thể hiện hoạt tính kháng viêm mạnh (như ức chế biểu hiện gen và protein iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6).
  • Mở rộng nghiên cứu hoạt tính sinh học của các phân đoạn chiết xuất và các hợp chất phân lập được trên các dòng tế bào ung thư khác hoặc các chủng vi khuẩn, vi nấm kháng thuốc.
  • Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học từ các bộ phận khác (thân, vỏ cây, hoa, rễ) của loài Vitex limonifolia và các loài Vitex khác chưa được nghiên cứu tại Việt Nam.

Giá trị tham khảo

Tài liệu luận án mang lại giá trị tham khảo chuyên môn cho các đối tượng sau:

  1. Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Dược học:
    • Tham khảo quy trình phân lập chi tiết kết hợp nhiều hệ sắc ký pha thường, pha đảo và sắc ký rây phân tử (Sephadex LH-20, Diaion HP-20).
    • Tham khảo phương pháp phối hợp đo phổ CD và tính toán phổ CD lý thuyết bằng phần mềm tính toán hóa học lượng tử để xác định cấu hình tuyệt đối của các hợp chất tự nhiên.
  2. Các nhà nghiên cứu Dược lý và Hóa sinh:
    • Tham khảo quy trình chuẩn thức thử nghiệm sàng lọc hoạt tính kháng viêm in vitro qua phản ứng Griess trên tế bào BV2 và quy trình thử nghiệm kháng virus (CVB3, EV71, HRV1B) bằng phương pháp nhuộm SRB trên đĩa 96 giếng.
  3. Các cơ quan quản lý và nghiên cứu bảo tồn tài nguyên dược liệu:
    • Cung cấp dữ liệu cơ sở về tiềm năng dược liệu của chi Vitex tại khu vực miền Trung (Vườn quốc gia Bạch Mã) phục vụ công tác quy hoạch, bảo tồn và sử dụng bền vững nguồn tài nguyên cây thuốc.

Câu hỏi thường gặp

1. Đối tượng và địa điểm thu hái mẫu thực vật của luận án là gì?

Đối tượng nghiên cứu của luận án là mẫu lá của hai loài: bình linh vàng chanh (Vitex limonifolia Wall. ex C.B. Clarke) và mạn kinh (Vitex trifolia L.). Cả hai mẫu đều được thu hái tại Vườn quốc gia Bạch Mã, tỉnh Thừa Thiên Huế vào tháng 9/2015, được định danh khoa học bởi TS. Nguyễn Thế Cường và PGS. Ninh Khắc Bản, lưu giữ tiêu bản tại Viện Hóa sinh biển (VAST) với mã số TNSVB-01 và TNSVB-02.

2. Từ hai loài thực vật trên, tác giả đã phân lập được bao nhiêu hợp chất?

Từ 4,2 kg bột lá Vitex limonifolia, tác giả đã phân lập được 12 hợp chất tinh khiết, ký hiệu từ VL1 đến VL12. Từ 2,2 kg bột lá Vitex trifolia, tác giả đã phân lập được 16 hợp chất tinh khiết, ký hiệu từ VT1 đến VT16.

3. Hoạt tính kháng viêm in vitro được đánh giá theo nguyên lý nào và sử dụng dòng tế bào gì?

Hoạt tính kháng viêm in vitro được đánh giá dựa trên khả năng ức chế sự sản sinh Nitric Oxide (NO) trên dòng tế bào vi bọc đệm thần kinh BV2 được kích thích bởi LPS (0,5 µg/mL). Mức độ độc tính tế bào được kiểm tra sơ bộ bằng phương pháp so màu MTT (đo ở 540 nm), và hàm lượng nitrit trong môi trường được xác định thông qua phản ứng Griess (đo ở 525 nm) với chất đối chứng dương là L-NMMA.

4. Hoạt tính kháng virus in vitro được thực hiện trên những chủng virus nào và phương pháp nào được áp dụng?

Hoạt tính kháng virus được thử nghiệm trên 3 chủng virus gồm: Coxsackievirus B3 (CVB3) và Enterovirus 71 (EV71) nuôi trên tế bào Vero, cùng Human Rhinovirus 1B (HRV1B) nuôi trên tế bào HeLa. Phương pháp đánh giá là nhuộm Sulforhodamine B (SRB) đo mật độ quang của protein tế bào sống sót ở bước sóng 540 nm. Chất đối chứng dương là Rupintrivir (đối với CVB3, EV71) và Ribavirin (đối với HRV1B).

5. Trước nghiên cứu này, các công trình nghiên cứu về chi Vitex ở Việt Nam đã ghi nhận những kết quả gì?

Trước nghiên cứu này, các công bố trong nước còn rất hạn chế, tiêu biểu có: công trình năm 1998 của Trần Văn Sung và cộng sự phân lập các hợp chất chalcone và ecdysteroid từ V. leptobotrys (gồm 3 chalcone mới); công trình năm 2014 của Trần Huy Thái và cộng sự về tinh dầu V. ovata; công trình năm 2016 của Đỗ Ngọc Đại và cộng sự về tinh dầu