Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ hóa học với đề tài "Nghiên cứu phân lập, chuyển hóa và đánh giá tác dụng sinh học của steroid từ loài sao biển Acanthaster planci" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Đinh Thị Hà, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Trần Thị Thu Thủy và PGS. Ngô Đại Quang tại Học viện Khoa học và Công nghệ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Luận án thuộc chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, mã số chuyên ngành 9 44 01 07.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Bề mặt trái đất có khoảng 70% diện tích là biển và đại dương, nơi chứa đựng nguồn tài nguyên sinh vật biển phong phú với hàng trăm ngàn loài sinh vật khác nhau. Vùng biển Việt Nam có chiều dài bờ biển trên 3.260 km, diện tích hơn 1 triệu km² cùng điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, tạo môi trường thuận lợi cho gần 12.000 loài sinh vật biển phát triển. Trong hệ động vật biển, ngành Da gai (Echinodermata) với năm lớp chính gồm Sao biển (Asteroidea), Đuôi rắn (Ophiuroidea), Cầu gai (Echinoidea), Hải sâm (Holothuroidea) và Huệ biển (Crinoidea) là nguồn cung cấp dồi dào các steroid phân cực có cấu trúc hóa học đa dạng và phổ hoạt tính sinh học rộng (kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chống virus, gây độc tế bào ung thư).

Loài sao biển gai Acanthaster planci (thuộc chi Acanthaster, họ Acanthasteridae, bộ Valvatida) là loài sao biển có kích thước lớn, cơ thể nhiều cánh (16 đến 21 cánh) và được bao phủ bởi các gai nhọn chứa độc tính. Thức ăn chính của A. planci là các mầm san hô sống (polyp), khiến chúng trở thành một trong những loài sinh vật xâm lấn gây nguy hại cho hệ sinh thái rạn san hô tại các vùng biển nhiệt đới, trong đó có dải bờ biển miền Trung và miền Nam Việt Nam. Việc nghiên cứu thành phần hóa học của loài sao biển này không chỉ giúp làm sáng tỏ các hợp chất chuyển hóa thứ cấp và giải thích độc tính sinh học, mà còn mở ra định hướng khai thác nguồn sinh khối dồi dào phục vụ nghiên cứu phát triển dược chất.

Mặc dù loài A. planci đã được nghiên cứu trên thế giới từ những năm 1970, các nghiên cứu trong nước về loài này trước thời điểm thực hiện luận án còn rất hạn chế, chủ yếu dừng lại ở việc phân lập một số hợp chất pyrrole và glycoside đơn lẻ. Chưa có công trình tổng thể nào kết hợp đồng thời ba nội dung: phân lập xác định cấu trúc các steroid phân cực, chuyển hóa hóa học steroid tự nhiên có hàm lượng lớn thành các dẫn xuất polyhydroxysteroid và hydroximinosteroid, và thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro có hệ thống.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định ba mục tiêu nghiên cứu cụ thể như sau:

  1. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài sao biển Acanthaster planci, đặc biệt là các steroid.
  2. Chuyển hóa các dẫn xuất theo định hướng hydroxyl hóa và oxime hóa từ 1 steroid có hàm lượng lớn trong sao biển Acanthaster planci (cholesterol).
  3. Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập và tổng hợp được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu sinh vật loài sao biển gai Acanthaster planci thu thập tại các vùng rạn san hô thuộc vùng biển miền Trung - Nam Việt Nam (Nha Trang, Quảng Nam, Cù Lao Chàm). Đối tượng chuyển hóa hóa học là cholesterol.
  • Phạm vi nghiên cứu: Chiết tách, phân lập các hợp chất tự nhiên bằng sắc ký; xác định cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1D và 2D NMR) và khối phổ phân giải cao (HR-ESI-MS/MS); bán tổng hợp 17 dẫn xuất steroid (gồm 7 dẫn xuất polyhydroxysteroid và 10 dẫn xuất hydroximinosteroid/tiền chất); thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro (gây độc tế bào, ức chế hình thành khuẩn lạc khối u trên thạch mềm và ức chế sự di căn của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú bằng thử nghiệm làm lành vết thương).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan các hướng nghiên cứu trước

Luận án đã hệ thống hóa các kết quả nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lớp Sao biển (Asteroidea), loài Acanthaster planci, cũng như các phương pháp bán tổng hợp dẫn xuất steroid:

  • Các lớp chất steroid phân cực từ sao biển: Luận án phân loại steroid phân cực thành ba nhóm chính:

    • Polyhydroxysteroid: Thường chứa từ 4 đến 9 nhóm hydroxyl (-OH) phân bố tại các vị trí xác định như 3β, 6(α/β), 8β, 15(α/β), 16β và mạch nhánh tại C-17. Nghiên cứu của các tác giả Hàn Quốc trên loài Certonardoa semiregularis đã phân lập 36 hợp chất polyhydroxysteroid (1-36); Yan Peng và cộng sự (2010) phân lập 4 hợp chất (37-40) từ Asterina pectinifera; Ivanchina và cộng sự phân lập 2 hợp chất mới (41, 42) có nhóm -OH ở vị trí 14α từ loài Archaster typicus tại Việt Nam.
    • Steroid sulfate: Gồm các steroid tự do hoặc steroid glycoside mang nhóm sulfate tại C-3, C-15, trên mạch nhánh hoặc đơn vị đường. Yan Peng và cộng sự (2010) phân lập hợp chất 43 và polyhydroxysteroid glycoside 44 từ A. pectinifera; Ivanchina và cộng sự phân lập fuscaside A (45) và natri 24,25-dihydromarthasterone-3-sulfate (46) từ Lethasterias fusca; Levina và cộng sự phân lập các steroid sulfate 47-49 từ Mithrodia clavigera; Timofey và cộng sự (2015) phân lập 4 steroid sulfate mới (50-53) từ Leptasterias ochotensis.
    • Steroid glycoside: Gồm polyhydroxysteroid glycoside, asterosaponin và cyclic steroid glycoside. Ning Ma và cộng sự (2009-2010) phân lập anthenoside A-K (54-64) từ Anthenea chinensis; Timofey và cộng sự phân lập anthenoside L-U (65-74), anthenoside V-X (75-77), anthenoside A1-A2 (78, 79) từ Anthenea aspera và anthenoside S1-S6 (80-85) từ Anthenea sibogae tại Việt Nam; Kicha và cộng sự phân lập kurilensoside A-H (86-93) từ Hippasteria kurilensis; Kicha và cộng sự (2014, 2017) phân lập leptasterioside A-F (95-100) từ Leptasterias ochothensis và pentareguloside A-G (101-107) từ Pentaceraster regulus tại Cù Lao Chàm; Châu Văn Minh và cộng sự phân lập astrosterioside A-D (108-111) từ Astropecten monacanthus tại Cát Bà; De Riccardis và cộng sự, Kicha và cộng sự (2015) nghiên cứu nhóm cyclic steroid glycoside sepositoside A (112), luzonicoside A-F (116-121) từ chi Echinaster.

  • Thành phần hóa học và hoạt tính của loài Acanthaster planci:

    • Nghiên cứu quốc tế: Y. Sheikh và cộng sự (1972, 1973) phân lập các sapogenin (122, 123) và monoglycoside (145, 146); Isao Kitagawa và cộng sự (1975, 1978) phân lập thornasterol A (126), thornasterol B (127), các acetylsteroid (131-133) và thornasteroside A (149); Susumu Sato (1980) nhận diện 11 sterol (134-144) qua GC-MS; Minale phân lập nodososide (147); Kicha và cộng sự phân lập triglycoside (148); Tetsuya Komori và cộng sự (1980-1988, 1996) phân lập asterosaponin 150, acanthaglycoside A-F (151-155), marthasteroside A1 (156), 10 cerebroside (156-165), 2 ceramide lactoside acanthalactoside A-B (166, 167) và đánh giá độc tính trên trứng cầu gai; Kawano và cộng sự (1990), Inagaki (1998), Miyamoto và cộng sự (2000) phân lập chuỗi acanthaganglioside A-J (168-175, 179, 180) và ceramide AC-1-6, AC-1-10, AC-1-11 (176-178); Maoka (2010) và Luo và cộng sự (2011) xác định các carotenoid như astaxanthin (184), 7,8-didehydroastaxanthin (183); Karasudani (1996), Koyama và cộng sự (1998), Chi-Chiu Lee và cộng sự (2013, 2014) khảo sát hoạt tính tán huyết của plancinin và độc tính tế bào của các phân đoạn chiết (ether dầu hỏa, EtOAc, EtOH, BuOH).
    • Nghiên cứu tại Việt Nam: Châu Văn Minh và cộng sự (2013, 2016) phân lập hai pyrrole oligoglycoside plancipyrroside A (194) và B (195) có hoạt tính ức chế sinh NO trên dòng RAW 264.7, cùng 5 hợp chất polyhydroxysteroid glycoside (196-200).

  • Nghiên cứu chuyển hóa dẫn xuất steroid:

    • Dẫn xuất polyhydroxysteroid: Cui và cộng sự (2001) tổng hợp 24-methylenecholest-4-en-3β,6β-diol (201) và dẫn xuất 6α-ol (202) từ stigmasterol; Weigang Lu và cộng sự (2001) tổng hợp 24-methylene-cholesta-3β,5α,6β,19-tetraol (203) từ stigmasterol; John R. Williams và cộng sự (1998) tổng hợp (25R)-26-hydroxycholesterol (204) từ diosgenin; Jiang và cộng sự tổng hợp certonardosterol D2 (14); Maud Voisin và cộng sự (2014) tổng hợp cholestan-3β,5α,6β-triol (205) từ cholesterol bằng tác nhân HIO4.
    • Dẫn xuất hydroximinosteroid: Rodriguez và cộng sự (1997) phân lập 6E-hydroximinosteroid 206 và 207 từ hải miên Cinachirella alloclada và C. apion; phân lập chất 208 từ C. australiensis (2005); Noé Deive và cộng sự (2001) tổng hợp 12 dẫn xuất 6-hydroximinosteroid (209-220) và chuỗi 14 dẫn xuất (221-234) từ cholesterol; Cui và cộng sự (2009) tổng hợp 14 dẫn xuất (235-248) từ cholesterol, stigmasterol và β-sitosterol.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù các công trình trước đây đã ghi nhận một số nhóm chất từ Acanthaster planci, thành phần các steroid phân cực (đặc biệt là các polyhydroxysteroid glycoside và asterosaponin mới) từ mẫu sao biển thu thập tại vùng biển Việt Nam vẫn chưa được khảo sát đầy đủ. Hơn nữa, việc khai thác cholesterol (một thành phần steroid phổ biến trong mẫu) để chuyển hóa bán tổng hợp thành các dẫn xuất polyhydroxysteroid và hydroximinosteroid nhằm so sánh mối liên quan cấu trúc - hoạt tính gây độc tế bào ung thư chưa được thực hiện đồng bộ tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết hóa học các hợp chất thiên nhiên biển và lý thuyết hóa học hữu cơ thực nghiệm. Quá trình nghiên cứu kết hợp giữa phương pháp phân lập các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ nguồn sinh vật tự nhiên và phương pháp chuyển hóa hóa học bán tổng hợp từ khung cấu trúc steroid có sẵn (cholesterol) thông qua các phản ứng hydroxyl hóa chọn lọc vị trí, phản ứng oxy hóa, phản ứng epoxy hóa và phản ứng oxime hóa nhóm carbonyl bằng hydroxylamine hydrochloride ($NH_2OH\cdot HCl$).

Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc

  • Phương pháp phân lập:
    • Chiết mẫu sinh khối sao biển bằng methanol (MeOH), phân bố lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol).
    • Sử dụng sắc ký cột thường (Column Chromatography - CC) với chất hấp phụ silica gel pha thuận ($SiO_2$) và pha đảo ($RP_{18}$), kết hợp sắc ký bản mỏng (TLC).
    • Tinh chế các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
  • Phương pháp xác định cấu trúc:
    • Đo độ quay cực riêng ($[\alpha]_D$), xác định điểm nóng chảy (M.p), đo phổ hồng ngoại (IR).
    • Phổ khối lượng: Khối phổ ion hóa phun mù điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS, HR-ESI-MS/MS) và sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) để xác định khối lượng phân tử chính xác và các mảnh phân cắt cấu trúc.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Đo phổ 1D-NMR ($^1H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$, DEPT-90, DEPT-135) và các phổ 2D-NMR ($^1H\text{-}^1H\text{ COSY}$, HSQC, HMBC, H2BC, NOESY, ROESY, TOCSY, 1D TOCSY) trên các thiết bị đo phổ hiện đại để xác lập cấu trúc phẳng và cấu hình lập thể của khung aglycon và chuỗi đường.

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

  1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro:
    • Sử dụng phương pháp thử nghiệm MTT / MTS trên các dòng tế bào ung thư ở người: ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư gan (Hep-G2), ung thư ruột kết (HCT-116), ung thư biểu mô tuyến vú (MDA-MB-231, T-47D), ung thư u sắc tố ác tính (RPMI-7951), ung thư não (T98G), ung thư đại trực tràng (HT-29), cùng dòng tế bào đại thực bào chuột (RAW 264.7). Xác định giá trị $IC_{50}$ hoặc $ED_{50}$ ($\mu M$ hoặc $\mu g/ml$).
  2. Phương pháp thử nghiệm khả năng ức chế hình thành khối u trên thạch mềm (Soft agar colony formation assay):
    • Đánh giá khả năng ức chế sự hình thành và phát triển của các khuẩn lạc tế bào ung thư biểu mô trong môi trường thạch mềm, xác định giá trị $IF_{50}$ (nồng độ ức chế 50% sự hình thành khối u).
  3. Phương pháp thử nghiệm ức chế sự di căn của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú bằng xét nghiệm chữa lành vết thương (Wound-healing assay):
    • Đánh giá khả năng ức chế sự di chuyển của dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú người MDA-MB-231 thông qua việc đo mức độ thu hẹp khoảng cách vết rạch nhân tạo trên lớp đơn tế bào theo các mốc thời gian.

Nguồn tư liệu và hóa chất

  • Sinh khối sao biển Acanthaster planci thu nhận tại vùng biển Việt Nam.
  • Các hóa chất, dung môi hữu cơ và tác nhân phản ứng: $BH_3$, $CeCl_3\cdot 7H_2O$, $CHCl_3$, $CH_2Cl_2$, DMAP, DMEM, DMSO, EtOH, EtOAc, HCOOH, $H_2O_2$, m-CPBA, MeOH, $NaBH_4$, $NH_2OH\cdot HCl$, NMO, $OsO_4$, PCC, THF, TMS, $SeO_2$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương I. Tổng quan tài liệu

Chương I trình bày tổng quan hệ thống về ngành Da gai, lớp Sao biển (Asteroidea) và đặc điểm sinh học, sinh thái của loài sao biển gai Acanthaster planci. Luận án phân tích chi tiết đặc điểm cấu tạo của các lớp chất steroid phân cực gồm polyhydroxysteroid (các khung pentaol, hexaol), steroid sulfate và steroid glycoside (polyhydroxysteroid glycoside, asterosaponin, cyclic steroid glycoside), cùng các đơn vị monosaccharide cấu thành (Quinovose, Glucose, Galactose, Xylose, Fucose, Arabinose, DXHU, Glucuronic acid).

Chương này cũng tổng hợp các công bố về hoạt tính sinh học của steroid phân cực từ sao biển như hoạt tính gây độc tế bào, kháng vi sinh vật, kháng nấm, kháng virus Herpes type 1 (HSV-1) và điều hòa miễn dịch trên dòng tế bào đại thực bào RAW 264.7. Đồng thời, chương I điểm luận chi tiết 80 hợp chất đã biết từ loài A. planci (sterol, cerebroside, ganglioside, carotenoid astaxanthin, nucleoside) và tổng quan các sơ đồ phản ứng bán tổng hợp polyhydroxysteroid và hydroximinosteroid trên thế giới từ stigmasterol, diosgenin và cholesterol.

Chương II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương II mô tả xuất xứ mẫu nghiên cứu Acanthaster planci thu thập tại vùng biển Việt Nam. Trình bày chi tiết quy trình chiết xuất, sơ đồ phân lập bằng sắc ký cột thường và HPLC. Chương này nêu rõ nguyên lý, thông số kỹ thuật và điều kiện vận hành của các phương pháp phân tích phổ ($^1H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, H2BC, TOCSY, ROESY, NOESY, HR-ESI-MS/MS, GC-MS, IR, $[\alpha]_D$).

Bên cạnh đó, quy trình thực nghiệm sinh học được chuẩn hóa bao gồm: quy trình nuôi cấy các dòng tế bào ung thư (HeLa, Hep-G2, HCT-116, MDA-MB-231, RPMI-7951, T-47D, T98G, HT-29), phương pháp MTT/MTS đo độ hấp thụ quang học, quy trình thử nghiệm ức chế tạo khuẩn lạc trong thạch mềm xác định $IF_{50}$, và quy trình chụp ảnh đo diện tích di chuyển của tế bào MDA-MB-231 trong thử nghiệm wound-healing assay.

Chương III - Thực nghiệm

Chương III trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm, quy trình hóa học và các hằng số lý hóa thu được trong quá trình nghiên cứu:

  1. Phân lập các hợp chất từ sao biển Acanthaster planci: Quy trình tách chiết và thông số phổ, hằng số vật lý của 14 hợp chất:
    • Hợp chất mới: Planciside A (AP1), Planciside B (AP2), Planciside C (AP3), Acanthaglycoside G (AP11).
    • Hợp chất đã biết: Planciside D (AP4), Pentareguloside G (AP12), Acanthaglycoside A (AP13), Maculatoside (AP14), 3-O-sulfothornasterol A (AP5), 5-ergost-7-en-3-ol (AP6), Cholesterol (AP7), Astaxanthin (AP8), Thymine (AP9), Uracil (AP10).
  2. Bán tổng hợp các dẫn xuất từ cholesterol:
    • Dãy polyhydroxysteroid: Tổng hợp thành công 7 dẫn xuất gồm cholest-3β,6α-diol (15c), cholest-3β,6β-diol (16c), cholestan-5-ene-3β,4β-diol (17c), cholestan-5-ene-3β,7β-diol (18c), cholestan-5-ene-3β,4β,7β-triol (19c), cholestane-3β,5α,6α-triol (20c), cholestane-3β,5α,6β-triol (21c).
    • Dãy hydroximinosteroid và tiền chất: Tổng hợp thành công 10 dẫn xuất gồm cholest-4-ene-3,6-dione (22c), cholestane-3,6-dione (24c), cholest-4-ene-3β,6α-diol (26c), 6α-hydroxy-4α,5α-epoxycholestane-3-one (27c), 4α,5α-epoxycholestane-3,6-dione (28c), cùng các dẫn xuất oxime 23c, 25c, 29c, 31c và hợp chất 30c.
  3. Thử nghiệm hoạt tính sinh học: Bố trí các phép thử in vitro đối với các chất phân lập tự nhiên và các dẫn xuất tổng hợp.

Chương IV – Kết quả và thảo luận

Chương IV tập trung biện luận cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập, cơ chế các phản ứng chuyển hóa hóa học và phân tích kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học:

1. Thành phần hóa học loài sao biển Acanthaster planci

Biện luận chi tiết cấu trúc phẳng và cấu hình không gian của 14 hợp chất phân lập được (AP1 – AP14), trong đó xác lập cấu trúc của 4 hợp chất mới:

  • Planciside A (AP1): Hợp chất polyhydroxysteroid glycoside mới, aglycon dạng cholestane đa hydroxyl gắn với chuỗi đường qua các tương tác phổ COSY, HMBC và NOESY.
  • Planciside B (AP2): Hợp chất polyhydroxysteroid glycoside mới, được xác định qua phân tích phổ HR-ESI-MS/MS, $^1H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$ và tương tác ROESY.
  • Planciside C (AP3): Hợp chất polyhydroxysteroid glycoside mới, xác định đặc điểm chuỗi đường và aglycon bằng so sánh phổ 2D-NMR.
  • Acanthaglycoside G (AP11): Hợp chất asterosaponin mới, xác lập trật tự liên kết các đơn vị monosaccharide trong chuỗi carbohydrate gắn ở vị trí C-6 của khung steroid qua phổ 1D TOCSY, HMBC và ROESY.
  • Xác định cấu trúc 10 hợp chất đã biết gồm AP4-AP10 và AP12-AP14 bằng việc đối chiếu dữ liệu phổ NMR và MS với tài liệu tham khảo.
Ký hiệu Tên hợp chất Loại hợp chất Tình trạng cấu trúc
AP1 Planciside A Polyhydroxysteroid glycoside Hợp chất mới
AP2 Planciside B Polyhydroxysteroid glycoside Hợp chất mới
AP3 Planciside C Polyhydroxysteroid glycoside Hợp chất mới
AP4 Planciside D Polyhydroxysteroid glycoside Đã biết
AP5 3-O-sulfothornasterol A Steroid sulfate Đã biết
AP6 5-ergost-7-en-3-ol Sterol tự do Đã biết
AP7 Cholesterol Sterol tự do Đã biết
AP8 Astaxanthin Carotenoid Đã biết
AP9 Thymine Nucleobase Đã biết
AP10 Uracil Nucleobase Đã biết
AP11 Acanthaglycoside G Asterosaponin Hợp chất mới
AP12 Pentareguloside G Asterosaponin Đã biết
AP13 Acanthaglycoside A Asterosaponin Đã biết
AP14 Maculatoside Asterosaponin Đã biết

2. Kết quả chuyển hóa hóa học từ cholesterol

Luận án đã biện luận cơ chế các phản ứng chuyển hóa chọn lọc vị trí từ cholesterol tạo ra 17 dẫn xuất:

  • Nhóm polyhydroxysteroid (15c – 21c): Phản ứng hydroxyl hóa qua tác nhân hydroboration/oxy hóa, phản ứng mở vòng epoxide và oxy hóa chọn lọc tạo các diol và triol mang nhóm -OH ở các vị trí C-3, C-4, C-5, C-6 và C-7.
  • Nhóm hydroximinosteroid và tiền chất (22c – 31c): Phản ứng oxy hóa tạo các dẫn xuất 3,6-dione (22c, 24c, 28c), dẫn xuất 4α,5α-epoxy (27c, 28c) và phản ứng ngưng tụ với $NH_2OH\cdot HCl$ trong dung môi pyridin tạo các dẫn xuất hydroximino ở vị trí C-3 và/hoặc C-6 (23c, 25c, 29c, 31c).
Ký hiệu Tên hóa học dẫn xuất bán tổng hợp Nhóm cấu trúc
15c Cholest-3β,6α-diol Polyhydroxysteroid
16c Cholest-3β,6β-diol Polyhydroxysteroid
17c Cholestan-5-ene-3β,4β-diol Polyhydroxysteroid
18c Cholestan-5-ene-3β,7β-diol Polyhydroxysteroid
19c Cholestan-5-ene-3β,4β,7β-triol Polyhydroxysteroid
20c Cholestane-3β,5α,6α-triol Polyhydroxysteroid
21c Cholestane-3β,5α,6β-triol Polyhydroxysteroid
22c Cholest-4-ene-3,6-dione Tiền chất dione
24c Cholestane-3,6-dione Tiền chất dione
26c Cholest-4-ene-3β,6α-diol Polyhydroxysteroid
27c 6α-hydroxy-4α,5α-epoxycholestane-3-one Dẫn xuất epoxy-ketone
28c 4α,5α-epoxycholestane-3,6-dione Dẫn xuất epoxy-dione
23c, 25c, 29c, 31c Các dẫn xuất hydroximinosteroid Hydroximinosteroid
30c Dẫn xuất steroid chuyển hóa trung gian Dẫn xuất steroid

3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học

  • Hợp chất tự nhiên:
    • Hợp chất mới Planciside A (AP1) thể hiện hoạt tính ức chế sự tăng sinh trên 3 dòng tế bào ung thư người gồm HCT-116 (ung thư ruột kết), T-47D (ung thư vú) và RPMI-7951 (u hắc tố ác tính).
    • Bốn hợp chất asterosaponin AP11 – AP14 (gồm chất mới Acanthaglycoside G và 3 chất đã biết) thể hiện khả năng ức chế sự hình thành khối u trên thạch mềm và ức chế sự di chuyển của dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú người MDA-MB-231 trong thử nghiệm wound-healing assay.
  • Các dẫn xuất bán tổng hợp từ cholesterol:
    • Dãy dẫn xuất polyhydroxysteroid (15c – 21c) được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên hai dòng tế bào ung thư người Hep-G2 (ung thư gan) và T98G (ung thư não).
    • Dãy dẫn xuất hydroximinosteroid và tiền chất (22c – 31c) được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư người Hep-G2, HeLa (ung thư cổ tử cung) và T98G. Kết quả ghi nhận mối liên quan giữa vị trí nhóm oxime, sự xuất hiện của vòng epoxy và nhóm hydroxyl trên vòng A/B của khung steroid đối với mức độ thể hiện độc tính tế bào in vitro.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

  1. Đóng góp về thành phần hóa học:
    • Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 14 hợp chất từ loài sao biển gai Acanthaster planci thu thập tại vùng biển Việt Nam, bao gồm 4 hợp chất mới có cấu trúc phức tạp: 3 polyhydroxysteroid glycoside mới (Planciside A, B, C tương ứng AP1, AP2, AP3) và 1 asterosaponin mới (Acanthaglycoside G, AP11); cùng 10 hợp chất đã biết (AP4 – AP10, AP12 – AP14).
    • Đã thực hiện chuyển hóa hóa học thành công từ nguyên liệu cholesterol tự nhiên để tổng hợp 17 dẫn xuất steroid, gồm 7 dẫn xuất polyhydroxysteroid mang các nhóm hydroxyl ở vị trí C-3, C-4, C-5, C-6, C-7 (15c – 21c) và 10 dẫn xuất thuộc dãy oxime, dione và epoxy (22c – 31c).
  2. Đóng góp về hoạt tính sinh học:
    • Bổ sung dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính gây độc tế bào in vitro của hợp chất mới Planciside A (AP1) trên các dòng tế bào HCT-116, T-47D và RPMI-7951.
    • Lần đầu tiên đánh giá tác dụng ức chế sự hình thành khuẩn lạc khối u trên thạch mềm và ức chế khả năng di cư/di căn của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 bằng xét nghiệm làm lành vết thương (wound-healing assay) đối với các asterosaponin AP11 – AP14 phân lập từ Acanthaster planci.
    • Cung cấp dữ liệu sàng lọc độc tính tế bào in vitro có hệ thống của 17 dẫn xuất polyhydroxysteroid và hydroximinosteroid bán tổng hợp trên các dòng tế bào ung thư người Hep-G2, HeLa và T98G, góp phần làm sáng tỏ mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của nhóm chất này.

Kiến nghị và định hướng ứng dụng

  • Tận dụng nguồn sinh khối sao biển gai A. planci thu gom từ các chiến dịch bảo vệ rạn san hô làm nguồn nguyên liệu tự nhiên để chiết xuất các steroid phân cực và saponin có hoạt tính sinh học.
  • Sử dụng cholesterol làm nguyên liệu ban đầu thuận lợi để phát triển các phản ứng bán tổng hợp chọn lọc vị trí nhằm tạo ra các thư viện phân tử dẫn xuất steroid phục vụ sàng lọc dược chất chống ung thư.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Các đánh giá hoạt tính sinh học trong luận án mới chỉ dừng lại ở quy mô thử nghiệm in vitro trên các dòng tế bào nuôi cấy và các mô hình tế bào đơn lớp/thạch mềm, chưa thực hiện các thử nghiệm in vivo trên động vật thực nghiệm.
  • Quá trình thu nhận mẫu sao biển Acanthaster planci phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên và vùng phân bố rạn san hô, hàm lượng một số hợp chất steroid phân cực trong mẫu tự nhiên còn thấp, gây khó khăn cho việc mở rộng thử nghiệm dược lý chuyên sâu.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động ở mức độ sinh học phân tử (các con đường truyền tín hiệu nội bào, quá trình apoptosis, biểu hiện protein) của hợp chất mới Planciside A (AP1) và các asterosaponin (AP11 – AP14) trong việc ức chế tăng sinh và ức chế di căn tế bào ung thư.
  • Tối ưu hóa điều kiện phản ứng và hiệu suất tổng hợp các dẫn xuất hydroximinosteroid có hoạt tính cao từ cholesterol, đồng thời mở rộng tổng hợp các dẫn xuất steroid gắn thêm các nhóm chức hoặc dị vòng mới.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo dành cho:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa hữu cơ, Hóa dược và Dược học: Cung cấp quy trình chiết tách sắc ký, phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (2D-NMR) để giải mã các chuỗi carbohydrate phức tạp gắn trên khung steroid.
  • Các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực hóa dược và tổng hợp hữu cơ: Cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về các phản ứng chuyển hóa chọn lọc vị trí trên khung steroid (hydroxyl hóa, tạo liên kết đôi, mở vòng oxirane, oxime hóa).
  • Các nhà sinh học biển và quản lý môi trường biển: Cung cấp cơ sở khoa học về giá trị sinh hóa của loài sao biển gai Acanthaster planci, hỗ trợ định hướng khai thác hợp lý nguồn sinh khối sinh vật gây hại rạn san hô phục vụ phát triển dược liệu biển.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phát hiện bao nhiêu hợp chất mới từ loài sao biển Acanthaster planci?

Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 4 hợp chất mới từ tự nhiên, bao gồm 3 hợp chất polyhydroxysteroid glycoside là Planciside A (AP1), Planciside B (AP2), Planciside C (AP3) và 1 hợp chất asterosaponin là Acanthaglycoside G (AP11).

2. Nguyên liệu ban đầu được lựa chọn cho quá trình bán tổng hợp các dẫn xuất steroid là gì?

Nguyên liệu ban đầu được sử dụng là cholesterol (AP7), một hợp chất sterol tự nhiên có sẵn với trữ lượng lớn, giá thành thấp và cũng là một thành phần có mặt trong loài sao biển Acanthaster planci.

3. Những dòng tế bào ung thư nào đã được sử dụng để đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trong luận án?

Luận án sử dụng các dòng tế bào ung thư người gồm: ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư gan (Hep-G2), ung thư ruột kết (HCT-116), ung thư biểu mô tuyến vú (MDA-MB-231, T-47D), ung thư hắc tố ác tính (RPMI-7951), ung thư não (T98G), ung thư đại trực tràng (HT-29), cùng dòng tế bào đại thực bào chuột RAW 264.7.

4. Thử nghiệm chữa lành vết thương (wound-healing assay) trong luận án được dùng để đánh giá tác dụng gì?

Thử nghiệm chữa lành vết thương được sử dụng để đánh giá khả năng ức chế sự di chuyển (ức chế khả năng di căn) của dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú người MDA-MB-231 dưới tác động của các hợp chất asterosaponin AP11, AP12, AP13 và AP14.

5. Luận án đã tổng hợp được bao nhiêu dẫn xuất từ cholesterol và chia thành những nhóm nào?

Luận án đã tổng hợp thành công 17 dẫn xuất từ cholesterol, được chia thành hai nhóm: nhóm polyhydroxysteroid gồm 7 hợp chất (15c – 21c) và nhóm hydroximinosteroid/tiền chất dione/epoxy gồm 10 hợp chất (22c – 31c).

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Đinh Thị Hà đã hoàn thành các mục tiêu nghiên cứu đề ra về thành phần hóa học, chuyển hóa bán tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học của steroid từ loài sao biển gai Acanthaster planci tại vùng biển Việt Nam. Công trình đã phân lập, xác định cấu trúc 14 hợp chất tự nhiên (trong đó có 4 hợp chất mới) và bán tổng hợp thành công 17 dẫn xuất polyhydroxy và hydroximino steroid từ nguồn nguyên liệu cholesterol. Các kết quả thử nghiệm sinh học in vitro đã ghi nhận hoạt tính gây độc tế bào, ức chế tạo khuẩn lạc và ức chế sự di chuyển tế bào ung thư biểu mô tuyến vú của các hợp chất tự nhiên và dẫn xuất tổng hợp, cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học cho hướng nghiên cứu khai thác nguồn tài nguyên sinh vật biển phục vụ hóa dược.