Tổng quan luận án
Tài nguyên sinh vật biển là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất thiên nhiên có cấu trúc hóa học đặc trưng và hoạt tính sinh học đa dạng. Trong đó, các sinh vật thuộc ngành Da gai (Echinodermata), đặc biệt là lớp Sao biển (Asteroidea), được biết đến là nguồn cung cấp dồi dào các steroid phân cực, bao gồm polyhydroxysteroid, steroid sulfate và steroid glycoside. Lớp chất này thể hiện nhiều tác dụng sinh học như độc tế bào, kháng khuẩn, kháng nấm, chống virus và điều hòa miễn dịch.
Tại Việt Nam, với bờ biển dài trên 3.260 km và gần 12.000 loài sinh vật biển đã được ghi nhận, các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học sinh vật biển ngành Da gai trước đây chủ yếu dừng lại ở việc phân lập và đánh giá hoạt tính của một số hợp chất riêng lẻ. Chưa có công trình nào nghiên cứu một cách tổng thể từ khâu phân lập, chuyển hóa hóa học các dẫn xuất đến đánh giá hoạt tính sinh học của steroid từ sao biển.
Loài sao biển gai Acanthaster planci (thuộc chi Acanthaster, họ Acanthasteridae, bộ Valvatida) là đối tượng sinh vật biển phân bố phổ biến tại các vùng biển nhiệt đới Ấn Độ Dương - Thái Bình Dương và các rạn san hô ven biển miền Trung - Nam Việt Nam. Do có tập tính ăn các mầm polyp san hô sống, A. planci được xem là loài sinh vật xâm lấn gây nguy hại cho hệ sinh thái rạn san hô. Việc thu thập sinh khối loài này vừa phục vụ công tác kiểm soát sự bùng phát quần thể để bảo vệ san hô, vừa tạo nguồn nguyên liệu dồi dào để nghiên cứu hóa học và dược liệu.
Luận án "Nghiên cứu phân lập, chuyển hóa và đánh giá tác dụng sinh học của steroid từ loài sao biển Acanthaster planci" được triển khai nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu trên thông qua 3 nhiệm vụ cụ thể:
- Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài sao biển Acanthaster planci, đặc biệt là các hợp chất steroid.
- Chuyển hóa các dẫn xuất theo định hướng hydroxyl hóa và oxime hóa từ một steroid có hàm lượng lớn trong loài sao biển Acanthaster planci.
- Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập và tổng hợp được.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Loài sao biển gai Acanthaster planci Linnaeus, 1758 (mẫu tiêu bản ký hiệu SBG 05-2012, lưu trữ tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, do PGS.TS. Đỗ Công Thung - Viện Tài nguyên và Môi trường biển giám định).
- Phạm vi không gian: Mẫu sinh vật được thu thập tại Vịnh Vân Phong, khu vực gần thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa, ở độ sâu từ 5 đến 10 mét.
- Phạm vi thời gian: Mẫu nghiên cứu được thu thập vào tháng 05 năm 2012.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đặc điểm sinh học của sao biển, các nhóm steroid phân cực chính, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài sao biển gai Acanthaster planci, cùng các phương pháp bán tổng hợp dẫn xuất polyhydroxysteroid và hydroximinosteroid.
Phân loại học và các nhóm steroid phân cực từ sao biển
Lớp Sao biển (Asteroidea) thuộc ngành Da gai (Echinodermata) hiện có khoảng 1.900 loài thuộc 370 chi và 7 bộ: Brisingida, Forcipulatida, Notomyotida, Paxillosida, Spinulosida, Valvatida, Velatida (Blake, 1987; Mah và Hansson, 2013). Riêng tại Việt Nam, đã ghi nhận khoảng 78 loài sao biển. Theo Guang Dong và cộng sự (2007), đã có khoảng 98 loài sao biển được nghiên cứu về thành phần hóa học, phân lập được hơn 800 hợp chất steroid phân cực. Dựa trên cấu trúc hóa học, steroid phân cực từ sao biển được chia thành 3 nhóm cơ bản:
-
Polyhydroxysteroid: Chứa từ 4 đến 9 nhóm hydroxyl (-OH) trên khung tetracyclic steroid (thường ở các vị trí 3β, 6α/β, 8β, 15α/β, 16β, ít gặp hơn ở 4β, 5α, 7α/β, 14α) và trên mạch nhánh cholestane (C-24, C-26) hoặc ergostane/stigmastane (C-28, C-29).
- Từ loài Certonardoa semiregularis, các nhà khoa học Hàn Quốc đã phân lập 36 polyhydroxysteroid (1–36).
- Từ Asterina pectinifera, Yan Peng và cộng sự (2010) phân lập 4 hợp chất polyhydroxysteroid (37–40), bao gồm polyhydroxysteroid ester (25S)-5α-cholestane-3β,6α,7α,8,15α,16β-hexahydroxyl-26-O-14’Z-eicosenoate (37).
- Từ loài Archaster typicus thu tại Việt Nam, Ivanchina và cộng sự phân lập 2 hợp chất polyhydroxysteroid mới (41, 42) mang nhóm 14α-OH hiếm gặp.
-
Steroid sulfate: Các hợp chất monosulfate hoặc glycoside sulfate gắn nhóm sulfate ở vị trí C-3, C-15, trên mạch nhánh hoặc trên các đơn vị đường.
- Từ Asterina pectinifera, phân lập được chất 43 và polyhydroxysteroid glycoside mang nhóm sulfate (44).
- Từ Lethasterias fusca, Ivanchina và cộng sự phân lập fuscaside A (45) mang nhóm sulfate ở C-15 và natri 24,25-dihydromarthasterone-3-sulfate (46).
- Từ Mithrodia clavigera, Levina và cộng sự phân lập 3 steroid sulfate (47–49) có nhóm sulfate ở C-3 hoặc C-15.
- Từ Leptasterias ochotensis, Timofey và cộng sự (2015) phân lập 3 monoglycoside steroid sulfate (50–52) và 1 polyhydroxysteroid sulfate (53).
-
Steroid glycoside: Gồm 3 nhóm cấu trúc phụ:
- Polyhydroxysteroid glycoside: Gồm aglycon polyhydroxysteroid gắn với 1–3 đơn vị đường (pentose như Xyl, Ara; hexose như Qui, Glc, Gal, Fuc). Các công bố tiêu biểu gồm 11 anthenoside A–K (54–64) từ Anthenea chinensis (Ning Ma và cs, 2009–2010); 17 anthenoside L–U, V–X, A1–A2 (65–79) từ Anthenea aspera; 6 anthenoside S1–S6 (80–85) từ Anthenea sibogae thu tại Việt Nam; và kurilensoside A–H (86–93) cùng 15-O-sulfate của echinasteroside C (94) từ Hippasteria kurilensis (Kicha và cs).
- Asterosaponin: Khoảng 150 hợp chất đã được phát hiện, có phần aglycon Δ9(11)-3β,6α-dihydroxysteroid với nhóm sulfate ở C-3, mạch nhánh thường có 20β-OH và 23-oxo, gắn chuỗi penta- hoặc hexasaccharide tại C-6. Tiêu biểu là leptasterioside A–F (95–100) từ Leptasterias ochotensis; pentareguloside A–G (101–107) từ Pentaceraster regulus thu tại Cù Lao Chàm, Việt Nam; và astrosterioside A–D (108–111) từ Astropecten monacanthus thu tại Cát Bà, Việt Nam (Châu Văn Minh và cs).
- Cyclic steroid glycoside: Đặc trưng cho chi Echinaster, có chuỗi cyclic trisaccharide gắn hai đầu tại C-3 và C-6 của aglycon qua đơn vị glucuronic acid, gồm sepositoside A (112), các hợp chất 113–115 từ Echinaster sepositus, luzonicoside A (116) và luzonicoside B–F (117–121) từ Echinaster luzonicus thu tại Việt Nam (Kicha và cs, 2015).
| Tên đường thường gặp trong sao biển | Ký hiệu | Tên đường thường gặp trong sao biển | Ký hiệu |
|---|---|---|---|
| β-D-Quinovose | Qui | α-L-Arabinopyranose | Ara |
| β-D-Glucose | Glc | 6-Deoxy-xylo-hex-4-ulose | DXHU |
| β-D-Galactose | Gal | D-Glucuronic acid | Glcur |
| β-D-Xylopyranose | Xyl | β-D-Galactofuranose | Galf |
| β-D-Fucose | Fuc | α-L-Arabinofuranose | Araf |
Hoạt tính sinh học của các hợp chất steroid từ sao biển
Các tài liệu tổng quan ghi nhận steroid phân cực từ sao biển có nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý:
- Gây độc tế bào ung thư:
- Các polyhydroxysteroid (14, 16, 19–22, 30) từ C. semiregularis gây độc tế bào trên các dòng ung thư phổi A549, ung thư buồng trứng SK-OV-3, ung thư da KS-MEL-2, ung thư não XF498 và ung thư đại tràng HCT15. Trong đó, chất 14 thể hiện hoạt tính mạnh với ED50 từ 0,01 đến 0,15 µg/mL (mạnh hơn chất đối chứng doxorubicin trên một số dòng).
- Sáu asterosaponin leptasterioside A–F (95–100) từ Leptasterias ochotensis ức chế các dòng tế bào ung thư T-47D và RPMI-7951.
| Hợp chất | ED50 trên A549 (µg/mL) | ED50 trên SK-OV-3 (µg/mL) | ED50 trên KS-MEL-2 (µg/mL) | ED50 trên XF498 (µg/mL) | ED50 trên HCT15 (µg/mL) |
|---|---|---|---|---|---|
| Chất 14 | 0,15 | 0,08 | 0,09 | 0,07 | 0,01 |
| Chất 16 | 0,82 | 0,90 | 0,40 | 0,43 | 1,25 |
| Chất 19 | 0,48 | 0,83 | 0,28 | 0,40 | 1,26 |
| Chất 20 | 0,54 | 0,69 | 0,40 | 0,33 | 0,73 |
| Chất 21 | 1,75 | 1,51 | 0,48 | 1,22 | 1,25 |
| Chất 22 | 0,15 | 0,16 | <0,10 | 0,08 | 0,25 |
| Chất 30 | 0,43 | 0,22 | 0,17 | 0,12 | 0,48 |
| Doxorubicin | 0,04 | 0,12 | 0,05 | 0,12 | 0,18 |
| Dòng tế bào ung thư | IC50 của chất 95 (µM) | IC50 của chất 96 (µM) | IC50 của chất 97 (µM) | IC50 của chất 98 (µM) | IC50 của chất 99 (µM) | IC50 của chất 100 (µM) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| T-47D | 10 | 23 | 2 | 68 | 143 | 111 |
| RPMI-7951 | 17 | 30 | 27 | 151 | 151 | 91 |
- Kháng vi sinh vật và chống virus: Các hợp chất 39, 40, 43, 44 từ Asterina pectinifera ức chế virus Herpes type 1 (HSV-1) với MIC lần lượt là 0,2; 0,05; 0,2 và 0,07 µM.
- Điều hòa miễn dịch: Hợp chất luzonicoside A (116) từ Echinaster luzonicus kích thích hoạt tính lysosome (tăng 50% ở 0,1 µM), tăng mức ROS và kích thích sản sinh NO (tăng 15–30% ở 0,01 và 0,1 µM) trên tế bào đại thực bào RAW 264.7.
Tình hình nghiên cứu hóa học và hoạt tính loài Acanthaster planci
Trên thế giới, khoảng 80 hợp chất đã được phân lập từ A. planci:
- Steroid tự do: Sapogenin 122, 123 (Sheikh và cs, 1972); 7 steroid 124–130 gồm thornasterol A (126) và B (127) (Kitagawa và cs, 1975); 3 acetylsteroid 131–133 (Kitagawa); 11 sterol 134–144 (Susumu Sato, 1980).
- Steroid glycoside và Asterosaponin: Monoglycoside 145, 146 (Sheikh, 1973); nodososide 147 (Minale); triglycoside 148 (Kicha); 8 asterosaponin gồm thornasteroside A (149) (Kitagawa, 1978), asterosaponin 150, acanthaglycoside A–D, F (151–155) và marthasteroside A1 (156) (Tetsuya Komori, 1978–1986).
- Glycosphingolipid: Khoảng 25 hợp chất gồm 10 cerebroside (156–165), acanthalactoside A–B (166, 167) (Komori và cs, 1980–1988); acanthaganglioside A–E (168–172), F–H (173–175) (Kawano và cs, 1990); ceramide AC-1-6, AC-1-10, AC-1-11 (176–178) (Inagaki, 1998); acanthaganglioside I, J (179, 180) (Miyamoto, 2000).
- Carotenoid và nucleoside: 7,8-didehydroastaxanthin (183), astaxanthin (184), peridiniol (185) cùng các dẫn xuất 186–193 (Maoka, 2010); thymine deoxyribonucleoside (181) và uracil deoxyribonucleoside (182).
- Hoạt tính sinh học của A. planci: Plancinin (peptide dimer 7.500 Da có cầu nối disulfit) gây kéo dài thời gian đông máu và tán huyết (Karasudani, 1996; Koyama, 1998); 7 asterosaponin (149, 151–156) ức chế sự thụ tinh trên phôi cầu gai và sao biển (Komori, 1996); cặn chiết BuOH ức chế 4 dòng tế bào ung thư A549, A375.S2, PC3 và Hep G2 (Chi-Chiu Lee, 2014).
| Phân đoạn cặn chiết của A. planci | IC50 trên A549 (µg/mL) | IC50 trên A375.S2 (µg/mL) | IC50 trên PC3 (µg/mL) | IC50 trên Hep G2 (µg/mL) |
|---|---|---|---|---|
| Ether dầu hỏa | >1000 | >1000 | >1000 | >1000 |
| EtOAc | >1000 | 697,74 ± 5,21 | >1000 | >1000 |
| EtOH | 298,45 ± 2,42 | 325,85 ± 3,39 | 435,75 ± 3,12 | 437,10 ± 4,71 |
| BuOH | 140,48 ± 3,77 | 112,65 ± 2,98 | 152,34 ± 2,32 | 216,62 ± 3,19 |
Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu của GS. Châu Văn Minh (Viện Hóa sinh biển) đã phân lập 2 hợp chất pyrrole oligoglycoside là plancipyrroside A (194, IC50 = 16,61 ± 1,85 µM) và plancipyrroside B (195, IC50 = 5,94 ± 0,34 µM) có hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào đại thực bào RAW 264.7 (2013), cùng 5 polyhydroxysteroid glycoside (196–200, trong đó 199 và 200 là chất mới) vào năm 2016.
Tổng hợp và chuyển hóa các dẫn xuất steroid
Tài liệu điểm lại hai hướng bán tổng hợp chính từ steroid tự nhiên:
- Hydroxyl hóa: Chuyển hóa stigmasterol thành 24-methylenecholest-4-en-3β,6β-diol (201, 10 bước, hiệu suất 20%) và đồng phân 6α-diol (202, 8 bước, hiệu suất 9%) (Cui và cs); tổng hợp 24-methylene-cholesta-3β,5α,6β,19-tetraol (203, 10 bước, hiệu suất 9%) (Weigang Lu và cs); tổng hợp (25R)-26-hydroxycholesterol (204, 4 bước, hiệu suất 58%) và certonardosterol D2 (14, 4 giai đoạn) từ diosgenin (Williams và cs; Jiang và cs); tổng hợp cholestan-3β,5α,6β-triol (205, hiệu suất 85% với 10 đương lượng HIO4) từ cholesterol (Maud Voisin và cs, 2014).
- Oxime hóa: Phân lập từ hải miên Cinachirella gồm 206, 207 (Rodriguez, 1997) và 208 (2005); tổng hợp các dãy 6-hydroximinosteroid từ cholesterol, sitosterol, gorgosterol (chất 209–220, Noé Deive và cs, 2001; chất 221–234, 2005; chất 235–248, Cui và cs, 2009). Các nghiên cứu khẳng định dẫn xuất mang mạch nhánh C-17 kiểu cholesterol thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cao hơn so với mạch nhánh dạng stigmasterol và sitosterol.
- Tại Việt Nam: Các nghiên cứu chuyển hóa steroid chủ yếu tập trung vào nguồn thực vật hoặc hormone (Lưu Đức Huy và cs: chuyển hóa sterol thành corticoid/pregnane; Trần Thị Thu Thủy và cs, 2018: tổng hợp 8 dẫn xuất polyhydroxysteroid từ diosgenin).
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Luận án sử dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm của chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên kết hợp hóa sinh và dược lý thực nghiệm.
Phương pháp phân lập và làm sạch hợp chất
- Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60 F254 (20 x 20 cm, Merck). Phát hiện vệt chất dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc phun thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH (sấy nóng), dung dịch FeCl3 (cho sterol) và thuốc thử Dragendorff.
- Sắc ký cột (CC): Sử dụng các chất hấp phụ:
- Silica gel 60 cỡ hạt 0,04–0,063 mm (230–400 mesh) và 0,063–0,200 mm (70–230 mesh) của hãng Merck (Đức).
- Polychrome 1 (Teflon, Biolar, Latvia) dùng để loại muối vô cơ khỏi dịch chiết nước.
- Silica gel KSK (50–160 µm, Sorbpolimer, Krasnodar, Nga).
- Florisil (200–300 mesh, Aldrich Chemical Co.).
- Sephadex LH-20 (GE Healthcare).
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Sử dụng hệ thống máy sắc ký lỏng Agilent 1100 với các cột pha đảo:
- Cột Diasfer-110-C18 (10 µm, 250 x 15 mm).
- Cột Discovery C18 (5 µm, 250 x 15 mm).
- Cột Ascentis RP-Amide (5 µm, 250 x 4,6 mm).
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học và cấu hình tuyệt đối
- Độ quay cực ([α]D): Đo trên phân cực kế Perkin-Elmer 141 polarimeter tại Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), Vladivostok, Nga.
- Khối phổ: Phổ ESI-MS đo trên hệ máy Agilent 6510 Q-TOF LC/MS; phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy Bruker Impact II Q-TOF (PIBOC, Nga) với nồng độ mẫu 0,001 mg/mL trong MeOH.
- Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker 500 MHz (Viện Hóa học, VAST), Bruker DRX 500 MHz và Bruker Avance III 700 MHz (PIBOC, Nga), chuẩn nội tetramethylsilane (TMS).
- Kỹ thuật 1D: 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1D-TOCSY.
- Kỹ thuật 2D: HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY, ROESY.
- Dung môi: CDCl3, CD3OD, Pyridin-d5, DMSO-d6.
- Sắc ký khí (GC): Đo trên máy Agilent 6580, cột mao quản HP-1 MS (30 m x 0,32 mm), khí mang He tốc độ 1,7 mL/phút, chương trình nhiệt độ 100–270 °C với tốc độ gia nhiệt 5 °C/phút.
- Quy trình thủy phân và xác định cấu hình gốc đường:
- Thủy phân: Glycoside (2 mg) trong 1 mL TFA 2M gia nhiệt ở 100 °C trong 2 giờ, chiết phân bố với CHCl3 (3 x 0,5 mL) để thu phần aglycon tinh chế bằng HPLC (cột Ascentis RP-Amide, hệ MeOH-H2O 9:1).
- Xác định cấu hình tuyệt đối: Phần dịch nước chứa đường sau thủy phân acid (1,2 mg mẫu) được cô cặn, phản ứng với 0,5 mL (R)-(-)-2-octanol và 1 giọt TFA đặc ở 130 °C trong 6 giờ. Sau đó làm khô, acetyl hóa bằng hỗn hợp pyridine/acetic anhydride (1:1, 0,6 mL) ở nhiệt độ phòng trong 7 giờ, rồi phân tích GC so sánh thời gian lưu ($t_R$) với mẫu đường chuẩn D/L đã được dẫn xuất hóa tương tự.
Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro
- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào (MTS assay):
- Dòng tế bào thử nghiệm: 8 dòng tế bào ung thư ở người gồm HCT-116 (ATCC CCL-247), HT-29 (ATCC HTB-38), RPMI-7951 (ATCC HTB-66), MDA-MB-231 (ATCC HTB-26), T-47D (ATCC HTB-133), Hep G2 (ATCC HB-8065), HeLa (ATCC CCL-2), T98G (ATCC CRL-1690).
- Quy trình: Tế bào được cấy vào phiến 96 giếng (5,0 x $10^4$ tế bào/200 µL). Thử nghiệm chất ở nồng độ 10–150 µM trong 24 giờ ở 37 °C, 5% CO2. Bổ sung 20 µL tác nhân MTS, ủ 3 giờ, đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 490/630 nm trên máy Power Wave XS (Mỹ) để tính giá trị IC50.
- Thử nghiệm ức chế hình thành khối u trên thạch mềm (soft agar assay):
- Tế bào mật độ 2,4 x $10^4$ tế bào/mL nuôi trong 1 mL Eagle's agar 0,3% chứa 10% FBS. Các chất thử bổ sung ở nồng độ 5, 10, 15 µM, ủ 2–4 tuần ở 37 °C, 5% CO2. Khối u hình thành được quan sát và định lượng qua kính hiển vi Motic AE20 và phần mềm Image J theo phương pháp của Colburn.
- Thử nghiệm ức chế di căn tế bào ung thư biểu mô tuyến vú (wound-healing assay):
- Tế bào MDA-MB-231 (3,0 x $10^5$ tế bào/mL) được nuôi trong phiến 6 giếng đến khi tạo thảm tế bào 80%. Tạo vết thương bằng đầu pipet 200 µL vô trùng, rửa bằng PBS, bổ sung chất thử ở nồng độ 10 µM. Theo dõi khoảng cách di chuyển của tế bào tại 0, 24 và 48 giờ bằng kính hiển vi Motic AE20 và Image J.
Nội dung chính theo từng chương
Mở đầu
Trình bày bối cảnh nghiên cứu về tiềm năng dược liệu của tài nguyên biển, tính cấp thiết của việc nghiên cứu hóa học và sinh học loài sao biển gai Acanthaster planci tại Việt Nam, nêu mục tiêu tổng quát và 3 nhiệm vụ cụ thể của luận án.
Tổng quan tài liệu
Hệ thống hóa toàn bộ các công trình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam về đặc điểm sinh học lớp Asteroidea và chi Acanthaster; cấu trúc hóa học của các lớp steroid phân cực (polyhydroxysteroid, steroid sulfate, steroid glycoside, asterosaponin, cyclic steroid glycoside); các dữ liệu hoạt tính sinh học của steroid phân cực; các nghiên cứu hóa học, độc tố và dược lý trên loài A. planci; và các phản ứng hydroxyl hóa, oxime hóa bán tổng hợp dẫn xuất steroid.
Chương II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Mô tả nguồn gốc mẫu sinh vật sao biển gai A. planci thu tại Khánh Hòa; trình bày chi tiết các hóa chất, dung môi, thiết bị sắc ký (TLC, CC, HPLC, GC), hệ thống máy đo phổ (HR-ESI-MS, NMR 1D/2D, phân cực kế); quy trình thủy phân xác định cấu hình tuyệt đối của gốc đường; cùng các quy trình thử nghiệm sinh học in vitro (MTS assay, soft agar assay, wound-healing assay) trên các dòng tế bào ung thư người.
Chương III - Thực nghiệm
Chương III mô tả chi tiết quy trình chiết xuất, phân lập và các hằng số vật lý, dữ kiện phổ của 14 hợp chất tinh khiết từ 10 kg mẫu sao biển tươi Acanthaster planci.
Mẫu tươi A. planci (10 kg)
Ngâm EtOH (3 x 20 L), lọc, cô
Dịch cô EtOH
n-Hexan (3 x 500 mL) CH2Cl2 (3 x 500 mL) MeOH (3 x 500 mL)
Cặn Hexan Cặn DCM Cặn MeOH
(14,7 g) (27,5 g) (50 g)
Cột Silica gel Polychrome 1
(CH2Cl2 - MeOH) (Khử muối H2O, EtOH)
FD1 - FD5 (5 pđ) Phân đoạn FM (35 g)
(5,2 g) (4,7 g) FM1 - FM9 (9 pđ)
D2.2 D2.3 D3.2 Cột CC Cột CC
AP1 AP2 AP3 AP4 AP12 AP11 AP13 AP14
Quy trình chiết xuất và phân lập
- Mẫu sao biển tươi (10 kg) được rã đông, rửa sạch muối, thái nhỏ, ngâm chiết 3 lần với ethanol (20 L/lần) ở nhiệt độ phòng. Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn cô EtOH.
- Cặn EtOH được chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan (3 x 500 mL), dichloromethane (3 x 500 mL) và methanol (3 x 500 mL), thu được 3 phân đoạn cặn:
- Cặn n-hexan: 14,7 g.
- Cặn DCM: 27,5 g.
- Cặn MeOH: 50 g.
- Xử lý cặn MeOH (50 g): Hòa tan trong 1 L nước cất, chia làm 2 phần chạy qua 2 cột Polychrome 1 (Ф 75 mm, L = 260 mm) rửa bằng nước cất để loại muối (kiểm tra bằng dung dịch AgNO3 1N đến khi không còn kết tủa). Sau đó rửa giải hợp chất hữu cơ bằng ethanol (3 L), cô cặn thu được 35 g phân đoạn FM.
- Phân đoạn FM (35 g) sắc ký trên cột silica gel KSK (50–160 µm, Ф 60 mm, L = 160 mm), rửa giải bằng CH2Cl2–EtOH (9:1 đến 5:1), CH2Cl2–EtOH–H2O (5:1:0,1 đến 1:1:0,2) và EtOH–H2O (15:1 đến 5:1), thu được 9 phân đoạn: FM1 (1,4 g), FM2 (2,1 g), FM3 (3,2 g), FM4 (4,5 g), FM5 (3,8 g), FM6 (5,5 g), FM7 (2,6 g), FM8 (3,1 g) và FM9 (2,3 g).
- Phân đoạn FM4 (4,5 g) sắc ký cột nhanh silica gel KSK với CHCl3–EtOH (2:1 đến 1:2), thu được 13 phân đoạn phụ. Phân đoạn phụ 4.4 (68,7 mg) tinh chế bằng RP-HPLC (cột Diasfer-110-C18 và Discovery C18, hệ rửa giải EtOH–H2O–1M NH4OAc 60:24:1 v/v/v) thu được AP1 (Planciside A, 7,0 mg, $t_R$ = 24,5 phút) và AP2 (Planciside B, 1,9 mg, $t_R$ = 25,2 phút). Phân đoạn phụ 4.5 (249,5 mg) tinh chế bằng RP-HPLC tương tự thu được AP3 (Planciside C, 0,3 mg, $t_R$ = 20,3 phút) và AP4 (Planciside D, 1,4 mg, $t_R$ = 12,4 phút).
- Phân đoạn FM5 (3,8 g) sắc ký cột nhanh silica gel KSK thu được hợp chất AP12 (Pentareguloside G, 14,4 mg) và 2 phân đoạn phụ 5.1 và 5.2. Phân đoạn phụ 5.1 (313 mg) tinh chế qua RP-HPLC (hệ EtOH–H2O–1M NH4OAc 45:54:1 v/v/v) thu được AP11 (Acanthaglycoside G, 6,9 mg, $t_R$ = 13,1 phút). Phân đoạn phụ 5.2 (524 mg) tinh chế qua RP-HPLC (hệ EtOH–H2O–1M NH4OAc 50:49:1 v/v/v) thu được AP13 (Acanthaglycoside A, 2,5 mg, $t_R$ = 14,4 phút) và AP14 (Maculatoside, 8,9 mg, $t_R$ = 18,5 phút).
- Xử lý cặn DCM (27,5 g): Sắc ký cột với hệ DCM–MeOH gradient từ 100:0 đến 0:100 thu được 5 phân đoạn: FD1 (1,8 g), FD2 (5,2 g), FD3 (4,7 g), FD4 (3,1 g), FD5 (4,5 g).
- Từ FD2 (5,2 g): Qua cột Sephadex LH-20 (MeOH–DCM 95:5) thu được phân đoạn D2.2 (2,93 g) hiện màu hồng tím với FeCl3. Sắc ký cột silica gel (n-hexan–EtOAc 12:1) và kết tinh lại trong MeOH ở 5 °C thu được hợp chất AP7 (2,74 g). Phân đoạn D2.3 (58 mg) sắc ký qua Sephadex LH-20 và kết tinh lại trong 3% DCM/MeOH ở 5–10 °C thu được hợp chất AP8 (70 mg, tinh thể màu tím sẫm).
- Từ FD3 (4,7 g): Qua cột Sephadex LH-20 (5% DCM trong MeOH) thu được phân đoạn D3.2 (2,49 g), tiếp tục tinh chế qua Sephadex LH-20 và kết tinh trong MeOH lạnh thu được AP6 (1,58 g, tinh thể hình kim màu trắng).
- Từ FD5 (4,5 g): Qua cột Sephadex LH-20 (5% DCM trong MeOH) thu được phân đoạn D5.2 (93 mg) và D5.4 (104,7 mg). Phân đoạn D5.2 sắc ký pha đảo RP-18 (MeOH–H2O 1:1) thu được AP10 (6,3 mg). Phân đoạn D5.4 qua cột silica gel (DCM–MeOH 9:1) và RP-18 (MeOH–H2O 7:3) thu được AP5 (7,6 mg).
Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập
| Ký hiệu | Tên hợp chất | Tình trạng phát hiện | Công thức phân tử | Khối lượng thu được | Dữ kiện phổ khối (HR-ESI-MS) | Độ quay cực $[ \alpha ]_D$ |
|---|---|---|---|---|---|---|
| AP1 | Planciside A | Hợp chất mới | C39H68O16 | 7,0 mg | $m/z$ 815,4279 $[M+Na]^+$; $m/z$ 791,4650 $[M-H]^-$ | -30,7 ($c$ 0,7, MeOH) |
| AP2 | Planciside B | Hợp chất mới | C40H70O15 | 1,9 mg | $m/z$ 813,4476 $[M+Na]^+$; $m/z$ 789,4891 $[M-H]^-$ | -37,9 ($c$ 0,2, MeOH) |
| AP3 | Planciside C | Hợp chất mới | C40H69O18SNa | 0,3 mg | $m/z$ 915,3855 $[M+Na]^+$; $m/z$ 869,4461 $[M-Na]^-$ | +3,3 ($c$ 0,03, MeOH) |
| AP4 | Planciside D | Đã biết | C45H76O18 | 1,4 mg | $m/z$ 927,4954 $[M+Na]^+$; $m/z$ 903,4915 $[M-H]^-$ | -21,7 ($c$ 0,06, MeOH) |
| AP5 | Chưa định danh chi tiết | Đã biết | - | 7,6 mg | - | - |
| AP6 | Chưa định danh chi tiết | Đã biết | - | 1,58 g | Hiện màu tím hồng với H2SO4 | - |
| AP7 | Steroid chính | Đã biết | - | 2,74 g | Hiện màu hồng tím với FeCl3 | - |
| AP8 | Hợp chất màu | Đã biết | - | 70 mg | Tinh thể tím sẫm, UV 254 nm mạnh | - |
| AP10 | Dẫn xuất alkaloid/steroid | Đã biết | - | 6,3 mg | Bắt UV 254 nm, hiện Dragendorff cam | - |
| AP11 | Acanthaglycoside G | Hợp chất mới | C51H81O26SNa | 6,9 mg | $m/z$ 1187,4533 $[M+Na]^+$; $m/z$ 1141,4735 $[M-Na]^-$ | +21,6 ($c$ 0,1, MeOH) |
| AP12 | Pentareguloside G | Đã biết | C50H79O26SNa | 14,4 mg | $m/z$ 1173,4356 $[M+Na]^+$; $m/z$ 1127,4552 $[M-Na]^-$ | +7,0 ($c$ 0,5, MeOH) |
| AP13 | Acanthaglycoside A | Đã biết | C56H89O27SNa | 2,5 mg | $m/z$ 1271,5003 $[M+Na]^+$; $m/z$ 1225,5316 $[M-Na]^-$ | -8,7 ($c$ 0,4, H2O) |
| AP14 | Maculatoside | Đã biết | C56H91O27SNa | 8,9 mg | $m/z$ 1273,5167 $[M+Na]^+$; $m/z$ 1227,5450 $[M-Na]^-$ | 0,0 ($c$ 0,5, MeOH) |
Kết quả phân tích thành phần đường của hợp chất AP11 bằng GC:
- Thời gian lưu ($t_R$) các đỉnh đường dẫn xuất của AP11: D-quinovose ($t_R$ = 20,60; 20,82; 21,16 và 21,45 phút); D-fucose ($t_R$ = 20,60; 21,12 và 21,54 phút).
- Đối chiếu mẫu đường chuẩn: D-quinovose ($t_R$ = 20,64; 20,86; 21,21; 21,47 phút), D-fucose ($t_R$ = 20,70; 21,23; 21,61 phút), L-quinovose ($t_R$ = 20,44; 20,92; 21,50 phút) và L-fucose ($t_R$ = 20,95; 21,03; 21,21; 21,30 phút). Kết quả khẳng định các gốc đường trong AP11 có cấu hình tuyệt đối thuộc dãy D.
Kết quả và những đóng góp mới
-
Về mặt hóa học phân lập:
- Đã nghiên cứu xử lý và chiết xuất thành công mẫu sao biển gai Acanthaster planci thu thập tại vùng biển Khánh Hòa với khối lượng 10 kg, xây dựng quy trình phân tách phân đoạn cặn MeOH qua cột chất hấp phụ Polychrome 1 để loại muối vô cơ hiệu quả trước khi tách sắc ký cột.
- Phân lập và xác định cấu trúc của 14 hợp chất sạch (AP1–AP14). Trong đó, xác định được 4 hợp chất mới gồm:
- Planciside A (AP1): Công thức phân tử C39H68O16 ($m/z$ 815,4279 $[M+Na]^+$).
- Planciside B (AP2): Công thức phân tử C40H70O15 ($m/z$ 813,4476 $[M+Na]^+$).
- Planciside C (AP3): Công thức phân tử C40H69O18SNa ($m/z$ 915,3855 $[M+Na]^+$).
- Acanthaglycoside G (AP11): Công thức phân tử C51H81O26SNa ($m/z$ 1187,4533 $[M+Na]^+$).
- Phân lập các hợp chất steroid glycoside và asterosaponin đã biết: Planciside D (AP4), Pentareguloside G (AP12), Acanthaglycoside A (AP13), Maculatoside (AP14).
- Phân lập được hợp chất steroid AP7 với hàm lượng lớn (2,74 g) và AP6 (1,58 g) từ phân đoạn cặn DCM ít phân cực, tạo nguồn nguyên liệu ban đầu cho các phản ứng chuyển hóa hóa học.
-
Về mặt phương pháp và phân tích:
- Ứng dụng thành công phương pháp thủy phân chọn lọc kết hợp tạo dẫn xuất chiral với (R)-(-)-2-octanol và acetyl hóa để xác định cấu hình tuyệt đối dãy D của các gốc đường D-quinovose và D-fucose trong hợp chất mới acanthaglycoside G (AP11) bằng sắc ký khí (GC).
-
Về mặt định hướng ứng dụng và sinh học:
- Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về việc sử dụng sao biển gai Acanthaster planci – một loài sinh vật biển xâm lấn gây hại cho rạn san hô – làm nguồn nguyên liệu sinh khối để chiết xuất các steroid phân cực và cung cấp khung steroid tự nhiên hàm lượng lớn phục vụ tổng hợp các dẫn xuất có hoạt tính sinh học.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế
- Mẫu sinh vật nghiên cứu chỉ được thu thập tại một vùng biển duy nhất (Vịnh Vân Phong, tỉnh Khánh Hòa) vào một thời điểm nhất định (tháng 05/2012) ở dải độ sâu 5–10 m, chưa phản ánh được sự biến động về thành phần hóa học theo mùa hoặc theo các vùng địa lý biển khác nhau tại Việt Nam.
- Các đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất trong luận án mới chỉ dừng lại ở quy mô thử nghiệm in vitro trên các dòng tế bào ung thư nuôi cấy, chưa tiến hành các thử nghiệm trên mô hình động vật in vivo.
Hướng nghiên cứu tiếp
- Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của các phân đoạn sắc ký chưa được tinh chế triệt để từ dịch chiết sao biển gai (các phân đoạn FM1–FM3, FM6–FM9, FD1, FD4).
- Tiếp tục tối ưu hóa quy trình bán tổng hợp hydroxyl hóa và oxime hóa trên khung steroid AP7 thu được với hàm lượng lớn, mở rộng đánh giá cơ chế tác động phân tử của các dẫn xuất có hoạt tính mạnh.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho các nhóm đối tượng sau:
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học và nhà nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược biển, Hóa học hữu cơ: Có thể tham khảo quy trình phân lập các hợp chất steroid phân cực cao (steroid sulfate, asterosaponin), phương pháp loại muối bằng Polychrome 1, và quy trình phân tích cấu hình tuyệt đối của chuỗi đường trong steroid glycoside bằng GC dẫn xuất hóa chiral.
- Giảng viên các trường đại học: Sử dụng các dữ liệu phổ nghiệm NMR (1D, 2D) và HR-ESI-MS của các hợp chất tự nhiên phân lập từ biển làm tài liệu giảng dạy chuyên đề phân tích cấu trúc hợp chất thiên nhiên.
- Cơ quan quản lý và nghiên cứu tài nguyên môi trường biển: Tham khảo dữ liệu để xây dựng định hướng thu gom, xử lý loài sao biển gai xâm hại san hô nhằm phục vụ nghiên cứu và khai thác hoạt chất sinh học có giá trị.
Câu hỏi thường gặp
1. Mẫu sao biển gai Acanthaster planci trong luận án được thu thập ở đâu và thông tin định danh mẫu như thế nào?
Mẫu sao biển gai Acanthaster planci được thu thập tại Vịnh Vân Phong, gần thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa vào tháng 05/2012 ở độ sâu 5–10 m. Mẫu được PGS.TS. Đỗ Công Thung (Viện Tài nguyên và Môi trường biển) giám định phân loại, tiêu bản mang ký hiệu SBG 05-2012 lưu giữ tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
2. Những hợp chất mới nào đã được phân lập và xác định cấu trúc từ loài sao biển Acanthaster planci trong luận án?
Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 4 hợp chất mới gồm: Planciside A (AP1, công thức phân tử C39H68O16), Planciside B (AP2, công thức phân tử C40H70O15), Planciside C (AP3, công thức phân tử C40H69O18SNa) và Acanthaglycoside G (AP11, công thức phân tử C51H81O26SNa).
3. Phương pháp nào được sử dụng để xác định cấu hình tuyệt đối của các gốc đường trong steroid glycoside?
Phương pháp gồm 3 bước: Thủy phân mẫu glycoside trong dung dịch acid trifluoroacetic (TFA 2M) ở 100 °C trong 2 giờ; cho phần đường thu được phản ứng với (R)-(-)-2-octanol và TFA đặc ở 130 °C trong 6 giờ; sau đó acetyl hóa bằng hỗn hợp pyridine/acetic anhydride (1:1) ở nhiệt độ phòng trong 7 giờ và phân tích sắc ký khí (GC) so sánh thời gian lưu với các mẫu đường chuẩn D và L tương ứng.
4. Hợp chất steroid nào thu được với hàm lượng lớn nhất từ cặn chiết của loài sao biển A. planci?
Hợp chất AP7 được phân lập từ phân đoạn cặn dichloromethane (FD2) với khối lượng lớn nhất là 2,74 g (kết tinh lại dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng trong methanol ở 5 °C), cùng với hợp chất AP6 thu được 1,58 g.
5. Luận án sử dụng những mô hình thử nghiệm sinh học in vitro nào để đánh giá hoạt tính của các hợp chất?
Luận án áp dụng 3 mô hình thử nghiệm in vitro: (1) Thử nghiệm gây độc tế bào bằng phương pháp MTS trên 8 dòng tế bào ung thư người (HCT-116, HT-29, RPMI-7951, MDA-MB-231, T-47D, Hep G2, HeLa, T98G); (2) Thử nghiệm ức chế tạo khối u trên thạch mềm (soft agar assay); (3) Thử nghiệm ức chế di căn tế bào ung thư vú MDA-MB-231 bằng phương pháp làm lành vết thương (wound-healing assay).
Kết luận
Luận án "Nghiên cứu phân lập, chuyển hóa và đánh giá tác dụng sinh học của steroid từ loài sao biển Acanthaster planci" đã thực hiện nghiên cứu thành phần hóa học của 10 kg mẫu sao biển gai thu thập tại Vịnh Vân Phong, Khánh Hòa. Công trình đã phân lập và xác định cấu trúc của 14 hợp chất tinh khiết, trong đó có 4 hợp chất mới thuộc lớp chất polyhydroxysteroid glycoside và asterosaponin (Planciside A–C và Acanthaglycoside G), đồng thời thu nhận được steroid AP7 với hàm lượng lớn (2,74 g). Luận án đã chuẩn hóa quy trình phân tách sắc ký, xác định cấu hình tuyệt đối của gốc đường bằng GC dẫn xuất hóa và thiết lập hệ thống thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro đa dạng trên các dòng tế bào ung thư người. Kết quả nghiên cứu đóng góp cơ sở khoa học quan trọng cho hướng nghiên cứu khai thác sinh khối sao biển gai phục vụ lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên và phát triển dược phẩm biển tại Việt Nam.