Luận văn tốt nghiệp sàng lọc in silico các hợp chất polyphenol có tác dụng ức chế enzym hmg coa reductase định hướng điều trị rối loạn lipid máu

Phân tích toàn diện in silico các hợp chất polyphenol ức chế enzym HMG-CoA reductase trong điều trị rối, đề xuất mô hình mới, nâng cao hiệu quả ứng

• Tác giả: Vũ Thị Thu Thủy
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Mạnh Hùng
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên cứu in silico các hợp chất polyphenol ức chế enzym HMG-CoA reductase trong điều trị rối loạn lipid máu
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH VẼ
• DANH MỤC BẢNG
• MỤC LỤC
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về bệnh rối loạn lipid máu
• 1.2. Bệnh rối loạn lipid máu
• 1.3. Điều trị rối loạn lipid máu
• 1.4. Tổng quan về enzym HMG-CoA reductase
• 1.5. Sinh tổng hợp cholesterol và vai trò của HMG-CoA reductase
• 1.6. Cấu trúc của HMG-CoA Reductase
• 1.7. Một số chất ức chế HMG-CoA Reductase
• 1.8. Tổng quan về nhóm hợp chất polyphenol
• 1.9. Tổng quan về nghiên cứu in silico
• 1.10. Kỹ thuật docking phân tử
• 1.11. Quy tắc Lipinski về các hợp chất giống thuốc
• 1.12. Dự đoán các thông số dược động học và độc tính (ADMET)
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu và thiết bị
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Sàng lọc bằng docking phân tử
• 2.5. Nghiên cứu các đặc điểm giống thuốc
• 2.6. Nghiên cứu các đặc tính dược động học và độc tính (ADMET)
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Đánh giá quy trình docking
• 3.2. Tìm kiếm các chất tiềm năng từ kết quả docking
• 3.3. Sàng lọc các hợp chất giống thuốc
• 3.4. Dự đoán các thông số ADMET
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Về kết quả
• 4.2. Về phương pháp
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về bệnh rối loạn lipid máu

Rối loạn lipid máu (RLLPM) là tình trạng bệnh lý khi có một hoặc nhiều thông số lipid bị rối loạn, như tăng cholesterol toàn phần hoặc triglycerid. Theo thống kê, tỷ lệ người mắc RLLPM ngày càng gia tăng, đặc biệt là ở các nước phát triển. RLLPM không chỉ là một bệnh lý độc lập mà còn là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến các bệnh tim mạch. Việc chẩn đoán RLLPM thường dựa vào các thông số lipid huyết thanh như cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL-c và HDL-c. Các nguyên nhân gây RLLPM có thể chia thành nguyên phát và thứ phát, trong đó nguyên phát thường liên quan đến di truyền, còn thứ phát thường do lối sống không lành mạnh. Điều trị RLLPM cần phải kết hợp giữa thay đổi lối sống và sử dụng thuốc, trong đó statin là nhóm thuốc chính được sử dụng để giảm cholesterol.

1.1. Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh

RLLPM có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau, bao gồm di truyền và lối sống. Đột biến gen có thể dẫn đến tăng sản xuất hoặc giảm đào thải lipid, trong khi lối sống ít vận động và chế độ ăn uống không hợp lý có thể làm tăng nồng độ lipid trong máu. Cơ chế bệnh sinh của RLLPM liên quan đến sự tích tụ cholesterol trong mạch máu, dẫn đến xơ vữa động mạch và các biến chứng tim mạch. Việc hiểu rõ nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh là rất quan trọng để phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.

II. Enzym HMG CoA reductase và vai trò trong điều trị RLLPM

Enzym HMG-CoA reductase (HMGCR) đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp cholesterol. HMGCR là enzym giới hạn tốc độ trong quá trình chuyển đổi HMG-CoA thành mevalonate, một bước quan trọng trong sinh tổng hợp cholesterol. Do đó, HMGCR trở thành mục tiêu chính trong việc phát triển các thuốc điều trị RLLPM. Các thuốc statin hiện nay hoạt động bằng cách ức chế HMGCR, từ đó làm giảm nồng độ cholesterol trong máu. Tuy nhiên, việc sử dụng lâu dài các thuốc này có thể gây ra một số tác dụng phụ không mong muốn, như đau cơ và tổn thương gan.

2.1. Cấu trúc và chức năng của HMG CoA reductase

HMGCR là một chuỗi polipeptid dài, bao gồm nhiều miền chức năng khác nhau. Vị trí hoạt động của enzym này nằm ở miền xúc tác, nơi diễn ra phản ứng chuyển đổi HMG-CoA thành mevalonate. Cấu trúc của HMGCR cho phép enzym này tương tác với các phân tử khác, như HMG và CoA, để thực hiện chức năng của mình. Sự hiểu biết về cấu trúc và chức năng của HMGCR là rất cần thiết để phát triển các chất ức chế enzym hiệu quả hơn.

III. Nghiên cứu in silico các hợp chất polyphenol

Nghiên cứu in silico là một phương pháp hiện đại trong việc sàng lọc các hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế HMGCR. Các hợp chất polyphenol, được chiết xuất từ thực vật, đã cho thấy tiềm năng trong việc giảm cholesterol và ức chế enzym HMGCR. Phương pháp docking phân tử cho phép đánh giá khả năng tương tác giữa các hợp chất polyphenol và HMGCR, từ đó xác định các hợp chất tiềm năng cho điều trị RLLPM. Việc sử dụng các hợp chất tự nhiên có thể giúp giảm thiểu tác dụng phụ so với các thuốc statin truyền thống.

3.1. Phương pháp sàng lọc in silico

Phương pháp sàng lọc in silico sử dụng các công cụ mô phỏng để dự đoán khả năng tương tác giữa các hợp chất và enzym mục tiêu. Kỹ thuật docking phân tử cho phép xác định vị trí liên kết và độ mạnh của tương tác giữa các hợp chất polyphenol và HMGCR. Các thông số dược động học và độc tính cũng được đánh giá để đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của các hợp chất được sàng lọc. Nghiên cứu này không chỉ giúp phát hiện các hợp chất mới mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị RLLPM.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Rối loạn lipid máu (RLLPM) là một trong những thách thức sức khỏe cộng đồng hàng đầu hiện nay, đặc trưng bởi sự bất thường của một hoặc nhiều thông số lipid huyết thanh như tăng cholesterol toàn phần (TC), tăng triglycerid (TG), tăng LDL-cholesterol (LDL-c) hoặc giảm HDL-cholesterol (HDL-c). Theo số liệu từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2018), tỷ lệ người trưởng thành mắc RLLPM trên quy mô toàn cầu là 39% (châu Âu 54%, châu Mỹ 48%, Đông Nam Á 29% và châu Phi 22,6%). Tại Việt Nam, thống kê của Bộ Y tế năm 2015 cho thấy khoảng 30,2% dân số có nồng độ cholesterol toàn phần trong máu ≥ 5,0 mmol/L hoặc đang phải sử dụng thuốc hạ lipid máu. RLLPM thúc đẩy quá trình hình thành mảng xơ vữa động mạch, làm tăng gấp đôi nguy cơ mắc các biến cố tim mạch nguy hiểm như nhồi máu cơ tim và đột quỵ thiếu máu não cục bộ.

Enzym 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCR) là enzym xúc tác cho phản ứng khử HMG-CoA thành mevalonate – bước phản ứng chậm nhất quyết định tốc độ (rate-limiting step) của toàn bộ con đường sinh tổng hợp cholesterol nội sinh tại gan. Do đó, HMGCR là đích tác động sinh học kinh điển của nhóm thuốc statin (lovastatin, simvastatin, atorvastatin, fluvastatin...). Tuy nhiên, việc điều trị bằng statin kéo dài ghi nhận nhiều tác dụng không mong muốn như đau cơ (khoảng 10%), viêm cơ (0,1%), tiêu cơ vân cấp (0,01%), tăng men transaminase gan (1–3%), tăng nguy cơ đái tháo đường (10–20%) và chống chỉ định tuyệt đối trên phụ nữ mang thai do nguy cơ gây dị tật thai nhi. Nhóm hợp chất polyphenol tự nhiên từ thực vật đã được chứng minh qua nhiều thử nghiệm in vitro và mô hình động vật là có tiềm năng ức chế HMGCR và hạ lipid máu với độ an toàn cao, nhưng các nghiên cứu mô phỏng tương tác ở mức độ phân tử còn hạn chế.

Đề tài được thực hiện nhằm giải quyết 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Sàng lọc các hợp chất polyphenol có tác dụng ức chế enzym HMG-CoA reductase bằng phương pháp docking phân tử.
2. Đánh giá các đặc điểm giống thuốc và phân tích các thông số dược động học, độc tính (ADMET) của các hợp chất tốt nhất thu được sau quá trình sàng lọc.

• Đối tượng nghiên cứu: 150 hợp chất polyphenol tự nhiên và 07 thuốc statin đối chứng (lovastatin, pravastatin, simvastatin, atorvastatin, fluvastatin, pitavastatin, rosuvastatin); cấu trúc tinh thể phần xúc tác của enzym HMGCR người phức hợp với phối tử fluvastatin (mã PDB: 1HWI).
• Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu tính toán in silico (sàng lọc ảo, docking phân tử, đánh giá tính chất hóa lý theo quy tắc Lipinski, dự đoán ADMET); hoàn thành tại Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội vào năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết hóa sinh, dược lý và hóa tin sinh học:

• Cơ chế bệnh sinh và đích sinh học HMGCR: Quá trình tổng hợp cholesterol tại gan gồm 4 giai đoạn, trong đó enzym HMGCR xúc tác chuyển đổi $(S)\text{-HMG-CoA} + 2\text{NADPH} + 2\text{H}^+ \rightarrow (R)\text{-mevalonate} + 2\text{NADP}^+ + \text{CoA-SH}$. Cấu trúc miền xúc tác HMGCR người là một tetramer gồm 4 monomer (mỗi chuỗi 888 acid amin), vị trí hoạt động nằm ở mặt phân cách giữa các monomer gồm 3 túi liên kết: túi HMG, túi CoA và túi NADPH với các acid amin quan trọng (Glu559, Arg590, Ser684, Asp690, Lys691, Lys692, Lys735, Asn755, Asp767, Leu853, His866).
• Nhóm hợp chất polyphenol: Nhóm chất chuyển hóa thứ cấp ở thực vật có chứa vòng benzen mang một hoặc nhiều nhóm -OH, chia thành 4 phân nhóm chính: flavonoid, phenolic acid, stilbene và lignan.
• Kỹ thuật Docking phân tử: Phương pháp mô phỏng gắn kết phối tử vào tâm hoạt động của receptor nhằm dự đoán cấu dạng tối ưu và tính toán năng lượng tự do liên kết ($\Delta G$, tính bằng kcal/mol).
• Quy tắc 5 tiêu chí Lipinski: Tiêu chuẩn đánh giá tính chất giống thuốc (drug-likeness) dùng đường uống, gồm: (1) Khối lượng phân tử $< 500\text{ Da}$; (2) $\text{Log}P < 5$; (3) Số nhóm cho liên kết hydro $\le 5$; (4) Số nhóm nhận liên kết hydro $\le 10$; (5) Độ khúc xạ phân tử (MR) từ 40–130.
• Mô hình dự đoán ADMET: Dự đoán các đặc tính hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính thông qua thuật toán đồ thị phân tử của nền tảng pkCSM.

Hệ thống thiết bị và công cụ nghiên cứu thực tế bao gồm:

• Thiết bị: Máy vi tính ThinkPad X250, hệ điều hành Windows 10.
• Phần mềm và công cụ tính toán: MGL Tools 1.5.6, AutoDock Vina 1.1.2, UCSF Chimera 1.14, Discovery Studio 2021 Client, Avogadro, công cụ đánh giá Lipinski trực tuyến và máy chủ phân tích pkCSM.
• Nguồn dữ liệu: Cấu trúc 3D protein HMGCR tải từ Protein Data Bank (PDB ID: 1HWI, độ phân giải 2,80 Å); cấu trúc hóa học 3D dạng SDF của 150 polyphenol và 07 statin tải từ cơ sở dữ liệu PubChem.

Quy trình thực nghiệm in silico được triển khai qua các bước:

1. Chuẩn bị receptor và ligand: Tách nước và phối tử fluvastatin khỏi 1HWI, thêm hydrogen phân cực, gán điện tích và trường lực Kollman, chuyển sang định dạng .pdbqt. Thiết lập hộp lưới docking (grid box) kích thước $20 \times 20 \times 20\text{ \AA}$, khoảng cách ô lưới $0,375\text{ \AA}$, tọa độ tâm $(x, y, z) = (16,0; 6,0; 10,0)$. Tối ưu hóa năng lượng phối tử bằng thuật toán Gradient liên hợp trên Avogadro.
2. Thẩm định quy trình docking (Re-docking): Tiến hành dock lại chính phối tử đồng kết tinh fluvastatin vào vị trí liên kết ban đầu của protein 1HWI. Đo độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) giữa cấu dạng sau dock và cấu dạng tinh thể gốc; giá trị RMSD $< 1,5\text{ \AA}$ xác nhận quy trình có độ tin cậy.
3. Docking sàng lọc và chọn lọc phân tầng: Docking 150 hợp chất polyphenol và 07 statin bằng AutoDock Vina; chọn các chất có $\Delta G \le -8,3\text{ kcal/mol}$ (mức năng lượng của atorvastatin – chất chứng tốt nhất). Tiếp tục lọc qua quy tắc Lipinski (thỏa mãn $\ge 2/5$ tiêu chí) và phân tích ADMET để loại trừ các hợp chất có độc tính tim mạch (hERG), gây đột biến gen (AMES), độc gan, kích ứng da hoặc độc tính cấp cao ($\text{LD}_{50} < 2\text{ mol/kg}$).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương này hệ thống hóa các y văn khoa học về ba nội dung cốt lõi:

• Bệnh học RLLPM và chiến lược điều trị: Định nghĩa, phân loại RLLPM (theo Fredrickson và De Gennes), cơ chế gây xơ vữa động mạch từ sự tích tụ và oxy hóa LDL-c tại lớp nội mạc, vai trò của thang điểm SCORE/Framingham trong phân tầng nguy cơ tim mạch. Đánh giá các nhóm thuốc hạ lipid máu, cơ chế và dược động học của 7 statin thương mại (chia thành statin loại 1 nguồn gốc vi sinh và statin loại 2 tổng hợp), kèm theo phân tích chi tiết về các tác dụng phụ nghiêm trọng trên cơ, gan và đường huyết.
• Enzym HMGCR và nhóm polyphenol: Cấu trúc 3 miền của HMGCR, vị trí không gian của các túi liên kết xúc tác, vai trò chuyển giao proton của His866 và Glu559. Tổng quan cấu trúc hóa học, phân loại và tác dụng sinh học đa dạng của polyphenol (chống oxy hóa, chống viêm, kháng ung thư và hạ cholesterol).
• Phương pháp luận in silico: Khái quát về khám phá thuốc dựa trên cấu trúc (SBVS), nguyên lý trường lực và hàm tính điểm trong AutoDock Vina, cơ sở lý thuyết của quy tắc 5 Lipinski và các chỉ số ADMET dự đoán qua pkCSM.

Chương 2: Nguyên liệu, thiết bị, phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy chuẩn kỹ thuật và các bước thực nghiệm tính toán:

• Đặc tả thông số kỹ thuật của phần cứng và phiên bản các phần mềm ứng dụng.
• Quy trình chuẩn bị cấu trúc thụ thể HMGCR (1HWI) và thư viện phối tử từ PubChem.
• Tiêu chuẩn thẩm định quy trình docking dựa trên chỉ số sai số hình học RMSD.
• Thiết lập tiêu chí lựa chọn hợp chất: điểm số năng lượng docking vượt qua statin đối chứng tốt nhất, đáp ứng quy tắc lọc Lipinski và đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học theo dự đoán ADMET.

Chương 3: Kết quả

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thu được qua từng phễu lọc:

• Thẩm định quy trình: Kết quả re-dock fluvastatin cho thấy cấu dạng dự đoán chồng khít hoàn toàn lên cấu tạo tinh thể nguyên bản với chỉ số $\text{RMSD} = 1,5\text{ \AA}$, khẳng định hệ thống thông số grid box và trường lực đạt chuẩn giá trị khoa học.
• Kết quả docking sàng lọc:
  • Năng lượng liên kết của 7 statin đối chứng: Atorvastatin ($-8,3\text{ kcal/mol}$), Rosuvastatin ($-8,1\text{ kcal/mol}$), Pitavastatin ($-8,1\text{ kcal/mol}$), Fluvastatin ($-8,0\text{ kcal/mol}$), Lovastatin ($-7,4\text{ kcal/mol}$), Pravastatin ($-7,1\text{ kcal/mol}$), Simvastatin ($-7,1\text{ kcal/mol}$). Các statin loại 2 thể hiện ái lực cao hơn hẳn statin loại 1.
  • Sàng lọc 150 polyphenol thu được 81/150 hợp chất có năng lượng liên kết $\Delta G \le -8,3\text{ kcal/mol}$.
• Đánh giá tính giống thuốc (Lipinski): Có 50/81 hợp chất thỏa mãn $\ge 2/5$ tiêu chí Lipinski. Đặc biệt có 4 hợp chất đạt trọn vẹn cả 5 tiêu chí gồm Furowanin A, Euchrenone A10, Cyclomorusin và 11-Hydroxytephrosin. Các chất có năng lượng rất âm như Ochnaflavone ($-10,8\text{ kcal/mol}$) bị loại do vi phạm tiêu chí hóa lý.
• Dự đoán ADMET: Trong 50 hợp chất, có 34 chất bị loại do dự đoán gây độc tim (ức chế kênh hERG II), gây đột biến (AMES) hoặc có $\text{LD}_{50} < 2\text{ mol/kg}$. 16 hợp chất còn lại được xác nhận an toàn và tiếp tục được đánh giá về hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ.
• Lựa chọn 5 hợp chất tối ưu: Dựa trên tương tác liên kết và thông số dược động học vượt trội, 5 hợp chất tiềm năng nhất được lựa chọn bao gồm: Silydianin, 11-Hydroxytephrosin, Sanggenol L, Sanggenon N và Kuwanon E.

Chương 4: Bàn luận

Chương này tập trung phân tích sâu ý nghĩa sinh học và phương pháp luận:

• Phân tích 5 hợp chất tiềm năng:
  • Silydianin: Thành phần flavonolignan từ phức hợp Silymarin của cây Cúc gai (Silybum marianum). Điểm docking đạt $-8,8\text{ kcal/mol}$, hấp thu qua ruột cao ($91,339%$), an toàn không độc tính gan/tim, liên kết hydro với Asn658, Asp767, tạo tương tác $\pi\text{-anion}$ với Glu559 và $\pi\text{-cation}$ với Arg590.
  • 11-Hydroxytephrosin: Hợp chất rotenoid phân lập từ các loài Derris cuneifolia, Millettia brandisiana... Điểm docking $-8,7\text{ kcal/mol}$, hấp thu qua ruột $90,683%$, tính thấm màng Caco2 đạt $0,916$, tạo liên kết hydro với Arg590, His752. Dự đoán có ức chế CYP3A4.
  • Sanggenol L, Sanggenon N và Kuwanon E: Ba hợp chất polyphenol phân lập từ vỏ rễ cây Dâu tằm (Morus alba). Cả ba đều có ái lực mạnh với HMGCR ($\Delta G$ từ $-8,5$ đến $-8,7\text{ kcal/mol}$), hấp thu qua ruột tốt ($> 88%$), liên kết đa dạng với các acid amin Glu559, Asp690, Arg590, Lys735, Ser684.
• Bàn luận về phương pháp in silico: Ưu thế của AutoDock Vina trong việc chấm điểm năng lượng; tầm quan trọng của việc kiểm soát sai số bằng việc lặp lại thí nghiệm 3 lần; phân tích sự tương quan giữa mô hình tính toán và thực nghiệm sinh học; chỉ rõ hạn chế của việc sử dụng phối tử cứng/protein bán cứng và sự cần thiết phải kiểm chứng bằng thử nghiệm in vitro/in vivo.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình sàng lọc ảo phân tầng kết hợp giữa docking phân tử, quy tắc Lipinski và dự đoán ADMET để tìm kiếm các chất ức chế HMGCR từ tự nhiên.

Phối tử / Hợp chất	Năng lượng liên kết ($\Delta G$, kcal/mol)	Hấp thu ruột HIA (%)	Thấm màng Caco2 ($\log P_{\text{app}}$)	Độc tính AMES / hERG / Gan	Các acid amin tương tác chính tại vị trí hoạt động
Silydianin	-8,8	91,339	0,518	Không / Không / Không	Asn658, Asp767, Glu559, Arg590, Leu853, Leu857, Met657
11-Hydroxytephrosin	-8,7	90,683	0,916	Không / Không / Không	Arg590, His752, Glu559, Leu853, Met657, Met655, Cys561
Sanggenol L	-8,7	88,224	0,505	Không / Không / Không	Ser684, Asp690, Lys735, Asn658, Arg590, Glu559, Leu853, Met655
Sanggenon N	-8,6	89,142	0,951	Không / Không / Không	Asp690, Asn658, Lys692, Glu559, Arg590, Met655, Leu853, Met657
Kuwanon E	-8,5	88,598	0,779	Không / Không / Không	Glu559, Lys735, Asn755, Asp690, Arg590, Leu857, Val683, His752, Leu853, Ala856
Atorvastatin (Chứng)	-8,3	-	-	-	Ser684, Lys692, Arg590, Lys735, Ser661, Ser565, Asn686, Ala751, Leu853, Asp690
Rosuvastatin (Chứng)	-8,1	-	-	-	Ser684, Arg590, Asp690, Ser661, Ser565, Asn686, Asn755, Glu559, Ala751, Leu853
Pitavastatin (Chứng)	-8,1	-	-	-	Ser684, Arg590, Lys692, Ser661, Leu853, Cys561, His752, Leu562
Fluvastatin (Chứng)	-8,0	-	-	-	Ser684, Lys692, Arg590, Asn755, Lys735, Ser661, Ala856, Leu853
Lovastatin (Chứng)	-7,4	-	-	-	His752, Asn755, Leu857, Val683, Ala856
Pravastatin (Chứng)	-7,1	-	-	-	Ser684, Lys692, Arg590, Asp690, Lys735, Leu857, Leu853, Val683
Simvastatin (Chứng)	-7,1	-	-	-	Lys692, Arg590, Leu853, His752

Các đóng góp chính:

• Chứng minh 5 hợp chất polyphenol tự nhiên (Silydianin, 11-Hydroxytephrosin, Sanggenol L, Sanggenon N, Kuwanon E) có ái lực liên kết với HMGCR cao hơn toàn bộ 7 statin đối chứng đang lưu hành trên thị trường.
• Làm sáng tỏ mạng lưới tương tác phân tử: các polyphenol này gắn kết chặt chẽ vào các acid amin xúc tác then chốt (Glu559, Arg590, Asp690, Lys735, Asp767) tương tự cơ chế của statin loại 2, thông qua hệ thống liên kết hydro, liên kết $\pi\text{-cation}$, $\pi\text{-anion}$ và lực van der Waals.
• Cung cấp cơ sở dữ liệu dự đoán ADMET chi tiết, chứng minh các hợp chất này có độ an toàn cao, không mang độc tính tim mạch và đột biến gen, mở ra hướng đi mới cho việc phát triển thuốc hạ lipid máu nguồn gốc tự nhiên.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận đã nêu rõ các hạn chế tồn tại và đề xuất định hướng phát triển:

• Hạn chế:
  • Quy mô thư viện sàng lọc ban đầu còn khiêm tốn (150 hợp chất), có thể bỏ sót nhiều polyphenol tiềm năng khác.
  • Nghiên cứu dừng lại ở mức mô phỏng in silico với cấu trúc receptor cố định (rigid protein), chưa mô phỏng động học phân tử (Molecular Dynamics) để đánh giá độ bền vững nhiệt động học theo thời gian thực.
  • Một số hợp chất (như Sanggenol L, Sanggenon N) có khả năng thấm một phần qua hàng rào máu não (BBB) và hệ thần kinh trung ương (CNS), đòi hỏi phải kiểm soát độc tính thần kinh.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Triển khai thử nghiệm thực nghiệm in vitro để định lượng hoạt tính ức chế enzym HMGCR ($\text{IC}_{50}$) của 5 hợp chất đã phát hiện.
  • Đánh giá hiệu quả hạ lipid máu và độc tính trên mô hình động vật in vivo.
  • Mở rộng thư viện sàng lọc cấu trúc tự nhiên và nghiên cứu tối ưu hóa cấu trúc (bào chế, dẫn xuất hóa) để cải thiện độ thấm Caco2 và hạn chế thâm nhập thần kinh trung ương.

Giá trị tham khảo

Công trình là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các ngành Dược học, Hóa dược, Dược lý học và Công nghệ sinh học / Tin sinh học.

Khóa luận có giá trị ứng dụng thực tiễn cao ở các phần:

• Quy trình chuẩn bị dữ liệu, thiết lập thông số docking và thẩm định re-docking trên AutoDock Vina và Discovery Studio (Chương 2).
• Phương pháp kết hợp đa tầng giữa điểm số năng lượng liên kết, bộ lọc quy tắc Lipinski và phân tích độc tính/dược động học ADMET qua pkCSM (Chương 2 và 3).
• Dữ liệu chi tiết về tọa độ tương tác không gian và danh mục acid amin liên kết của enzym HMGCR người (Chương 3 và 4).

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao khóa luận chọn Atorvastatin làm mốc năng lượng chuẩn để sàng lọc 150 polyphenol?
Trong quá trình docking 07 statin đối chứng vào HMGCR (1HWI), Atorvastatin đạt điểm số năng lượng liên kết âm nhất ($\Delta G = -8,3\text{ kcal/mol}$), vượt trội hơn các statin khác (Rosuvastatin $-8,1$; Pitavastatin $-8,1$; Fluvastatin $-8,0$; Lovastatin $-7,4$; Pravastatin $-7,1$; Simvastatin $-7,1\text{ kcal/mol}$). Do đó, mức $-8,3\text{ kcal/mol}$ của Atorvastatin được chọn làm ngưỡng chuẩn ngắt (cut-off) để chọn ra 81 hợp chất polyphenol có ái lực mạnh hơn hoặc bằng chất chuẩn tốt nhất.

2. Quy trình docking được thẩm định tính đúng đắn như thế nào?
Quy trình được thẩm định bằng phương pháp re-docking: tách phối tử đồng kết tinh fluvastatin ra khỏi phức hợp 1HWI, sau đó tiến hành dock lại fluvastatin vào vị trí hoạt động của protein với cùng thông số hộp lưới ($20 \times 20 \times 20\text{ \AA}$, tâm $16,0; 6,0; 10,0$). Kết quả tính toán bằng phần mềm Chimera cho thấy độ lệch bình phương trung bình gốc ($\text{RMSD}$) đạt $1,5\text{ \AA}$ (đáp ứng tiêu chuẩn $\text{RMSD} \le 1,5\text{ \AA}$), chứng minh quy trình và thông số docking hoàn toàn đáng tin cậy.

3. Vì sao hợp chất Ochnaflavone có năng lượng liên kết rất tốt ($-10,8\text{ kcal/mol}$) nhưng không được chọn vào danh sách tiềm năng?
Mặc dù Ochnaflavone tạo ái lực liên kết rất mạnh với HMGCR, hợp chất này không vượt qua phễu lọc quy tắc 5 tiêu chí của Lipinski (không đáp ứng đủ số tiêu chí tối thiểu về khối lượng phân tử, $\text{Log}P$, số nhóm cho/nhận liên kết hydro hoặc độ khúc xạ mol). Điều này dự báo hợp chất có sinh khả dụng và đặc tính dược động học đường uống kém, khó phát triển thành thuốc hoàn chỉnh.

4. Năm hợp chất polyphenol tiềm năng nhất được lựa chọn có nguồn gốc từ đâu và đạt điểm số docking bao nhiêu?
Năm hợp chất gồm: Silydianin (chiết xuất từ cây Cúc gai Silybum marianum, $\Delta G = -8,8\text{ kcal/mol}$), 11-Hydroxytephrosin (hợp chất rotenoid từ các loài Derris, Tephrosia..., $\Delta G = -8,7\text{ kcal/mol}$), Sanggenol L ($\Delta G = -8,7\text{ kcal/mol}$), Sanggenon N ($\Delta G = -8,6\text{ kcal/mol}$) và Kuwanon E ($\Delta G = -8,5\text{ kcal/mol}$) – cả 3 chất sau đều được phân lập từ vỏ rễ cây Dâu tằm (Morus alba).

5. Điểm nổi bật về dược động học và an toàn sinh học của Silydianin so với các đồng phân khác trong silymarin là gì?
Trong phức hợp silymarin của cúc gai, Silydianin có năng lượng docking ($-8,8\text{ kcal/mol}$) cao hơn Isosilibin ($-8,3\text{ kcal/mol}$). Dù Silibinin ($-9,3\text{ kcal/mol}$) và Silichristine ($-8,9\text{ kcal/mol}$) có điểm docking âm hơn, nhưng khi phân tích ADMET, hai chất này bị dự đoán có độc tính và khả năng hấp thu kém. Ngược lại, Silydianin có tỷ lệ hấp thu qua ruột vượt trội ($91,339%$), không ức chế enzym gan CYP, không gây độc tim (hERG), không gây đột biến (AMES) và không gây độc gan hay da.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Vũ Thị Thu Thủy đã ứng dụng thành công quy trình sàng lọc ảo in silico kết hợp giữa docking phân tử (AutoDock Vina), quy tắc Lipinski và mô hình dự đoán ADMET (pkCSM) trên đích enzym HMG-CoA reductase (1HWI). Từ thư viện 150 phân tử ban đầu, nghiên cứu đã xác định được 5 hợp chất polyphenol tự nhiên giàu tiềm năng nhất gồm Silydianin, 11-Hydroxytephrosin, Sanggenol L, Sanggenon N và Kuwanon E với năng lượng liên kết dao động từ $-8,5$ đến $-8,8\text{ kcal/mol}$, vượt trội hơn 07 statin đối chứng thương mại. Kết quả này cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học tin cậy và định hướng quan trọng cho các nghiên cứu thực nghiệm in vitro và in vivo tiếp theo nhằm phát triển các thuốc mới điều trị rối loạn lipid máu từ nguồn dược liệu tự nhiên.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về bệnh rối loạn lipid máu 1. Bệnh rối loạn lipid máu Theo hướng dẫn chẩn đoán và điều trị của Bộ Y tế, rối loạn lipid máu (RLLPM) là tình trạng bệnh lý khi có một hoặc nhiều thông số lipid bị rối loạn (tăng cholesterol toàn phần (TC) hoặc tăng triglicerid (TG), hoặc tăng LDL-cholesterol (LDL-c), hoặc giảm HDL-cholesterol (HDL-c)…). RLLPM thường được phát hiện cùng lúc với mội số bệnh lý tim mạch - nội tiết - chuyển hóa.

Đồng thời RLLPM cũng là yếu tố nguy cơ của bệnh lý này [1]. Khoảng 60-70% trường hợp RLLPM là do đột biến gen làm tăng sản xuất hoặc giảm đào thải TG, cholesterol, hoặc giảm sản xuất hoặc tăng đào thải HDL-c (RLLPM nguyên phát), và có khoảng 30-40% trường hợp là do các nguyên nhân thứ phát (RLLPM thứ phát), trong đó hay gặp nhất là do lối sống ít vận động với chế độ ăn giàu chất béo bão hòa, cholesterol và mỡ động vật [14, 58]. Các nguyên nhân thứ phát phổ biến khác có thể kể đến như: đái tháo đường, uống nhiều rượu bia, bệnh thận mạn tính, suy giáp trạng, xơ gan mật nguyên phát, sử dụng các thuốc như thiazid, chẹn β giao cảm, estrogen, progestin, glucocorticoid, thuốc chống loạn thần không điển hình (clozapine, olanzapine), tacrolimus và cyclosporine [14]. RLLPM được nghi ngờ ở những bệnh nhân có dấu hiệu đặc trưng của RLLPM trên lâm sàng như thể trạng béo phì, ban vàng, hoặc các biến chứng ở một số cơ quan như tai biến mạch máu não, bệnh mạch vành…[1].

RLLPM nguyên phát được nghi ngờ khi bệnh nhân có dấu hiệu như u vàng ở gân (tendon xanthomas), khởi phát bệnh xơ vữa động mạch sớm ( nam < 55 tuổi, nữ < 60 tuổi), tiền sử gia đình bị bệnh xơ vữa động mạch, hoặc cholesterol máu > 190 mg / dL (> 4. Chẩn đoán RLLPM bằng cách định lượng lipid huyết thanh. Các thông số thường được khảo sát gồm: cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL-c, HDL-c. Chẩn đoán xác định khi có một hoặc nhiều rối loạn như sau:  Cholesterol máu > 5,2 mmol/L (200mg/dL)  Triglycerid > 1,7 mmol/L (150mg/dL)  LDL-cholesterol > 2,58mmol/L (100mg/dL) 2 Luan van  HDL-cholesterol < 1,03mmol/L (40 mmol/L) [1] Có nhiều cách phân loại RLLPM.

Năm 1956, dựa trên đặc điểm tăng nồng độ lipid và lipoprotein máu, Fredrickson đã chia RLLPM thành 5 typ [18]. Phân loại này tương đối khó áp dụng trong thực hành lâm sàng. Phân loại của De Gennes đơn giản và dễ áp dụng trên lâm sàng hơn, chia RLLM thành 3 loại là: tăng cholesterol máu đơn thuần, tăng triglycerid máu đơn thuần và tăng lipid máu hỗn hợp [6]. Phân loại RLLPM theo Fredrickson Typ I IIa IIb III IV V Đặc điểm Cholesterol (TC) + +++ ++ ++ BT/+ ++ Triglycerid (TG) +++ BT + ++ ++ +++ Loại lipoprotein LDL, CM, CM LDL IDL VLDL tăng VLDL VLDL BT: Bình thường ++: Tăng trung bình Chú thích + : Tăng nhẹ +++: Tăng cao Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ người mắc RLLPM năm 2008 là 37% ở nam và 40% ở nữ và được cho là nguyên nhân gây ra 2,6 triệu ca tử vong trên toàn cầu (chiếm 4,5% tổng số ca tử vong) [4].

Nhiều nghiên cứu lâm sàng đã đồng thuận: RLLPM là một trong các yếu tố nguy cơ hàng đầu của bệnh tim mạch (CVD), bao gồm bệnh mạch vành (nhồi máu cơ tim), tai biến mạch máu não (đột quỵ), bệnh thấp tim, nhồi máu cơ tim (MI), đau thắt ngực ổn định (SA), đau thắt ngực không ổn định (UA), bệnh động mạch ngoại biên [28, 31, 52]. Tác động của RLLPM làm tăng nguy cơ mắc các bệnh lý tim mạch thông qua cơ chế làm xơ vữa mạch máu.