Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Sự phát triển công nghiệp làm gia tăng các nguy cơ ô nhiễm môi trường cùng với tình trạng lạm dụng hóa chất độc hại trong sản xuất nông nghiệp, công nghiệp. Đi kèm với đó là hiện tượng kháng thuốc và biến dị sinh học của vi khuẩn, virus, dẫn đến sự bùng phát của các bệnh lý hiểm nghèo như HIV/AIDS, bệnh tim mạch, ung thư, tiểu đường, viêm đường hô hấp cấp SARS và các chủng virus cúm. Trước bối cảnh đó, nghiên cứu sàng lọc các hợp chất tự nhiên có cấu trúc mới và hoạt tính sinh học tiềm năng từ thảm thực vật để định hướng phát triển thành thuốc điều trị là một hướng tiếp cận cần thiết. Các hợp chất thiên nhiên trải qua quá trình tiến hóa lâu dài có tính tương thích sinh học, độ độc thấp và thân thiện với môi trường.

Việt Nam sở hữu hệ thực vật nhiệt đới gió mùa phong phú với khoảng 12.000 loài thực vật, trong đó có khoảng 4.000 loài thuộc 309 họ được sử dụng trong y học dân gian. Tuy nhiên, việc khai thác phần lớn vẫn dừng lại ở kinh nghiệm thực hành truyền thống, chưa được chuẩn hóa về thành phần hoạt chất và đánh giá hoạt tính bằng phương pháp thực nghiệm khoa học.

Trong nhóm thực vật hạt trần:

  • Chi Dacrycarpus thuộc họ Kim giao / Thông tre (Podocarpaceae) trên thế giới đã được chứng minh có chứa các hợp chất diterpene và flavonoid glucoside với nhiều hoạt tính sinh học như ức chế tế bào ung thư, kháng khuẩn và bảo vệ tim mạch. Tại Việt Nam, chi này mới ghi nhận một loài duy nhất là Thông nàng (Dacrycarpus imbricatus), song các nghiên cứu chuyên sâu về hóa học và dược lý còn hạn chế.
  • Chi Fokienia thuộc họ Hoàng đàn / Bách (Cupressaceae) có đại diện là loài Pơ mu (Fokienia hodginsii). Các công bố trong nước trước đây chủ yếu tập trung vào tinh dầu gỗ và cành lá, trong khi thành phần hóa học của các phân đoạn chiết không bay hơi và hoạt tính sinh học của các hợp chất sạch từ loài này tại Việt Nam chưa được khảo sát đầy đủ so với các mẫu thu thập tại Trung Quốc.

Từ thực tế đó, đề tài luận án được xác định là: "Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của loài thông nàng (Dacrycarpus imbricatus) và Pơ mu (Fokienia hodginsii)".

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của luận án được xác định cụ thể gồm 2 nội dung:

  1. Nghiên cứu thành phần hóa học của loài Thông nàng (Dacrycarpus imbricatus (Blume) de Laub) và loài Pơ mu (Fokienia hodginsii (Dunn) A. Henry et Thomas).
  2. Thử nghiệm hoạt tính sinh học các chất sạch tách được từ hai loài thực vật trên.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Các bộ phận của loài Thông nàng (Dacrycarpus imbricatus (Blume) de Laub) bao gồm vỏ thân, gỗ thân, cành lá; và bộ phận cành lá của loài Pơ mu (Fokienia hodginsii (Dunn) A. Henry et Thomas).
  • Phạm vi không gian: Mẫu thực vật được thu hái tại tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam. Tên khoa học của mẫu được giám định bởi TS. Nguyễn Tiến Hiệp thuộc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tiêu bản mẫu thực vật được lưu trữ tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam với các mã số:
    • Thông nàng: Tiêu bản số VNMN.B0000050010.
    • Pơ mu: Tiêu bản số VNMN.B000005002.
  • Phạm vi thời gian: Mẫu nghiên cứu được thu thập thực địa vào tháng 8 năm 2012.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tình hình nghiên cứu về chi Dacrycarpus (họ Podocarpaceae)

Chi Dacrycarpus gồm các loài cây gỗ và cây bụi cao từ 55–60 m, phân bố chủ yếu từ bắc Myanma, nam Trung Quốc, Lào, Việt Nam đến Fiji, New Zealand và có độ đa dạng cao nhất tại New Guinea. Chi này có khoảng 15 loài và 4 dưới loài đã được thống kê.

Các nghiên cứu quốc tế trước đây về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Dacrycarpus tập trung vào hai nhóm chất chính:

  • Nhóm Diterpene:
    • Từ gỗ loài Dacrycarpus vieillardi, các nghiên cứu đã phân lập được 19-oxototarol (1), totarol (2) và 19-hydroxyl totarol (3). Hợp chất totarol thể hiện khả năng kháng khuẩn gram dương, giảm tổn thương tế bào thần kinh và cải thiện tình trạng thiếu máu não cục bộ với giá trị $\text{IC}_{50}$ trong khoảng 5,44–6,98 µM.
    • Tác giả Cambie khi nghiên cứu mẫu Dacrycarpus imbricatus thu hái tại đảo Fiji đã phát hiện 2 hợp chất diterpene là totarol (2) và acid lambertic (4).
    • Angela Bernabeu và cộng sự (2002) phân lập totarol từ Podocarpus spp. và sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^{13}\text{C-NMR}$ để xác định vị trí tương tác của phân tử này trong màng tế bào, cho thấy nhóm hydroxyl nằm gần nguyên tử C-3/C-4 của chuỗi acyl phospholipid, giải thích cơ chế kháng khuẩn qua tác động lên màng tế bào.
    • Elizabeth Jane Zammit và cộng sự (2013) đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của totarol trên các dòng tế bào ung thư người bằng phương pháp MTT, ghi nhận giá trị $\text{IC}_{50}$ dao động từ 161,73 đến 331,63 µM.
  • Nhóm Flavonoid glucoside và Anthocyanin:
    • J. Lowry (1972) tách được podocarpin B (5) từ phần đế hoa mẫu thu tại Malaysia.
    • Kenneth R và cộng sự (1983) phân lập từ lá loài thông trắng New Zealand (Dacrycarpus dacrydioides) các hợp chất flavonoid glycoside (6–14) gồm: tricetin-3',5'-di-O-$\beta$-glucopyranoside, cùng các dẫn xuất 3-O-methyl myricetin và 3-O-methyl quercetin liên kết với các gốc đường $\beta$-xylopyranoside và $\alpha$-rhamnopyranoside.
    • Trong hạt và đế hoa loài D. dacrydioides và D. kinabaluensis (mẫu thu tại Sabah, Malaysia), các tác giả đã phát hiện cyanidin-3-glucose (15), pelargonidin-3-glucose (16), peonidin-3-glucose (17) và delphinidin-3-glucose (18).
    • Somerset và Johannot (2008) chỉ ra vai trò của anthocyanin và flavonoid trong việc giảm thiểu nguy cơ ung thư thực quản, biểu mô tế bào thận và đại trực tràng.
    • Lovro Ziberna và cộng sự (2011) chứng minh cyanidin-3-glucose được vận chuyển qua bilitranslocase vào tế bào nội mô mạch máu người (EA.hy926), đóng vai trò chống oxy hóa và bảo vệ mô tim trong giai đoạn tái tưới máu sau thiếu máu cục bộ.
    • Pei-Ni Chen và cộng sự (2009) khảo sát tác dụng của peonidin-3-glucoside và cyanidin-3-glucoside từ gạo đen (Oryza sativa subsp. Kato), ghi nhận sự ức chế tăng trưởng đối với dòng tế bào ung thư vú HS578T và tế bào ung thư phổi.
    • Yan Yang và cộng sự (2012) nghiên cứu delphinidin-3-glucoside (Dp-3-g), ghi nhận hợp chất này ức chế tiểu cầu, làm giảm kích thước huyết khối trong mô hình in vitro và in vivo, đồng thời ức chế biểu hiện của các dấu ấn hoạt hóa tiểu cầu P-selectin, CD63, CD40L và thụ thể $\alpha\text{IIb}\beta3$.

Tình hình nghiên cứu về chi Fokienia (họ Cupressaceae)

Họ Cupressaceae gồm khoảng 27–30 chi với 130–140 loài. Chi Fokienia là chi trung gian giữa Chamaecyparis và Calocedrus, tại Việt Nam chỉ ghi nhận duy nhất loài Pơ mu (Fokienia hodginsii).

Các nghiên cứu đã công bố về loài Fokienia hodginsii và các hợp chất diterpenoid liên quan:

  • Nghiên cứu về tinh dầu:
    • Phan Tống Sơn và Peter Weyerstahl (1999) phân tích tinh dầu gỗ Pơ mu thu tại Việt Nam, xác định các sesquiterpene chính gồm $(E)$-nerolidol (9,35%), fokienol (10,26%) và dauca-8(14),11-dien-9-ol (16,3%).
    • Dominique Lesueur (2004) kết hợp sắc ký khí và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (GC-RI, GC-MS, $^{13}\text{C-NMR}$) phân tích tinh dầu rễ Pơ mu Việt Nam, xác định 40 hydrocarbon và 19 hợp chất oxy hóa với thành phần chủ yếu là $(E)$-nerolidol và fokienol.
  • Nghiên cứu về thành phần hóa học không bay hơi:
    • Xing-De Wu và cộng sự (2013) nghiên cứu cành lá F. hodginsii thu hái tại Trung Quốc, phân lập được 5 diterpene khung isopimarane mới (fokihodgin A–E: 24–28), 4 diterpene khung labdane mới (fokihodgin F–I: 29–32), 1 diterpene khung icetexane mới (33) và 18 diterpene đã biết (34–50). Cấu hình tuyệt đối của chất 24 và 29 được xác định bằng phương pháp nhiễu xạ tia X. Hợp chất fokihodgin I (32) thể hiện hoạt tính gây độc trên dòng tế bào HL-60 và SMMC-7721 với giá trị $\text{IC}_{50}$ lần lượt là 9,10 µM và 7,50 µM.
  • Hoạt tính sinh học của các hợp chất diterpene liên quan:
    • Weam Siheri và cộng sự (2014) khảo sát 13-epi-torulosal (51), acid acetyl-13-epi-cupressic (52) và acid 13-epi-cupressic (53), ghi nhận chất 52 có nồng độ ức chế tối thiểu $\text{MIC} = 4,3\text{ µM}$ đối với Trypanosoma brucei, đồng thời các chất 51–53 có hoạt tính ức chế đại thực bào nhiễm Leishmania donovani ($\text{IC}_{50}$ từ 16,75–68,34 µM).
    • Jun-ichi Fukushima (2002) phân lập trans-communal (39) và ferruginol (47) từ Chamaecyparis obtusa.
    • Louis Kuoping Chao (2006) khảo sát cao chiết Calocedrus macrolepis var. formosana, xác định phân đoạn chứa ferruginol (47) (>85,6%) có hoạt tính chống oxy hóa DPPH với $\text{IC}_{50} = 2,6\text{ µg/ml}$.
    • Mohammad Faheem Khan (2014) khảo sát hoạt tính ức chế xốp xương của sugiol (54), 15-acetoxy acid imbricatolic (55) và acid imbricatolic (56), trong đó sugiol ở liều 1,0 mg/kg làm tăng độ bền sinh học xương đùi ở động vật thí nghiệm.
    • Smith (2007–2008) phân lập các hợp chất diterpene từ Chamaecyparis lawsoniana (ferruginol, pisiferol, 5-epi-pisiferol, formosanoxide, acid trans-communic, torulosal) có hoạt tính kháng chủng Staphylococcus aureus kháng đa thuốc (EMRSA-15).
    • Manabu Iwamoto (2001) phân lập các diterpene labdane mới (61–63) từ Thuja standishii, chứng minh hợp chất 61 có khả năng ức chế kháng nguyên sớm virus Epstein-Barr (EBV-EA) và hợp chất 69 có khả năng kháng u da chuột.
    • Gardner khảo sát độc tính gây sẩy thai ở bò của các acid diterpene khung abietane và labdane từ lá thông Pinus ponderosa.
    • Miguel Gonzalez (1980–2014) tổng hợp dữ liệu về ferruginol (47) cho thấy hợp chất này có khả năng kháng khuẩn, chống oxy hóa, kháng u tuyến tiền liệt và ức chế EBV-EA.
    • Laila Moujir (2008) nghiên cứu các cao chiết và hợp chất từ Juniperus brevifolia, ghi nhận hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa ($\text{IC}{50}$ từ 22,81–71,21 µM) và tế bào Vero ($\text{IC}{50}$ từ 99,18–264,49 µM).
    • Shang-Tse Ho (2015) chứng minh ferruginol (47) ức chế tế bào ung thư phổi A549 và CL1-5 thông qua con đường tự hủy ty thể in vitro và làm giảm kích thước khối u ghép dị loại CL1-5 in vivo.
    • Alejandro F. Barrero (2012) tổng quan về acid trans-communic (38) và các dẫn xuất labdane, chỉ ra hoạt tính gây độc trên ấu trùng tôm ($\text{LD}_{50} = 0,52\text{ µM}$), độc tế bào BSC-1 và kháng vi sinh vật kiểm định.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết

Tổng quan tài liệu cho thấy các nghiên cứu về chi Dacrycarpus và Fokienia tại Việt Nam trước đây chỉ dừng lại ở phân loại hình thái thực vật và phân tích tinh dầu bay hơi. Chưa có công trình nào nghiên cứu hệ thống về thành phần hóa học của các phân đoạn chiết không bay hơi từ các bộ phận khác nhau (vỏ thân, gỗ thân, cành lá) của loài Thông nàng (D. imbricatus) cũng như cành lá loài Pơ mu (F. hodginsii) phân bố tại Việt Nam. Luận án được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống này thông qua việc chiết tách, phân lập, xác định cấu trúc hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học in vitro của các hợp chất sạch.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nguyên lý chiết tách và phân lập hợp chất tự nhiên

Luận án áp dụng phương pháp chiết ngâm siêu âm mẫu thực vật khô với hỗn hợp dung môi phân cực $\text{MeOH}:\text{H}_2\text{O}$ (tỷ lệ 9:1 thể tích) ở nhiệt độ 40–50°C. Dịch chiết tổng sau khi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm được phân bố lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: $n$-hexane, ethyl acetate ($\text{EtOAc}$) và $n$-butanol ($n\text{-BuOH}$).

Hệ thống phương pháp sắc ký được sử dụng để phân lập các chất sạch:

  • Sắc ký lớp mỏng phân tích (TLC): Bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck $60\text{ F}_{254}$ (độ dày 0,2 mm). Phát hiện vết chất dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm; hiện màu bằng thuốc thử vanilin/$\text{H}_2\text{SO}_4$ (thành phần: 1,2 g vanilin; 200 ml $\text{MeOH}$; 25 ml $\text{CH}_3\text{COOH}$; 11 ml $\text{H}_2\text{SO}_4$ đậm đặc).
  • Sắc ký cột (CC):
    • Sắc ký cột thường pha thuận: Silica gel kích thước hạt 197–400 mesh (0,040–0,063 mm).
    • Sắc ký cột nhanh: Silica gel kích thước hạt 70–200 mesh.
    • Sắc ký cột pha đảo: Pha tĩnh RP-18.
    • Sắc ký rây phân tử (lọc gel): Sephadex LH-20 Merck.
    • Dung môi triển khai: $n$-hexane, dichloromethane ($\text{CH}_2\text{Cl}_2$), ethyl acetate ($\text{EtOAc}$), methanol ($\text{MeOH}$), nước ($\text{H}_2\text{O}$) được tinh chế qua cột Vigreux trước khi sử dụng.

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được xác định bằng sự kết hợp của các phương pháp hóa lý và quang phổ hiện đại:

  • Phổ hồng ngoại (FT-IR): Đo trên máy Spectrum Two (hãng Perkin Elmer, Mỹ) dưới dạng viên nén KBr.
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker Avance 500 với tần số 499,84 MHz (cho phổ $^1\text{H-NMR}$) và 125 MHz (cho phổ $^{13}\text{C-NMR}$). Sử dụng dung môi $\text{CD}_3\text{OD}$ ($\delta = 49,0\text{ ppm}$) hoặc $\text{CDCl}_3$ ($\delta = 77,0\text{ ppm}$), chuẩn nội tetramethylsilane (TMS, $\delta = 0,0\text{ ppm}$). Các kỹ thuật phổ gồm: phổ một chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT-90, DEPT-135) và phổ hai chiều (HSQC, HMBC, $^1\text{H-}^1\text{H COSY}$, NOESY).
  • Phổ khối lượng (ESI-MS và HR-ESI-MS): Phổ ESI-MS đo trên thiết bị Agilent LC-MSD-Trap SL và máy AMD 402 (Đức). Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy FT-ICR-MS Varian (Mỹ).
  • Điểm nóng chảy ($t^o_{\text{nc}}$): Xác định trên máy đo điểm chảy VEB Analytik Dresden HMK 73/4470 (Đức).
  • Năng suất quay cực ($[\alpha]_{\text{D}}$): Đo trên thiết bị Jasco P-2000 Polarimeter (serial A060161232) tại Viện Hóa sinh biển - VAST.

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô (KB) và ung thư gan (HepG2)

  • Thiết bị: Tủ ấm $\text{CO}_2$ INNOVA CO-170, tủ cấy an toàn sinh học cấp 2, máy ly tâm Universal 320R, kính hiển vi soi ngược Zeiss, máy quang phổ Genios Tecan.
  • Dòng tế bào: Cung cấp bởi ATCC, gồm KB (Human epidermic carcinoma) và HepG2 (Hepatocellular carcinoma).
  • Quy trình: Phép thử in vitro chuẩn theo quy chuẩn của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI). Tế bào được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung 10% huyết thanh bò (FBS) ở điều kiện 37°C, 5% $\text{CO}_2$, độ ẩm 98%.
    • Mật độ gieo: $200\text{ }\mu\text{l}$ dịch huyền phù tế bào nồng độ $3 \times 10^4\text{ tế bào/ml}$ vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng.
    • Xử lý mẫu: Các mẫu thử pha loãng ở các nồng độ cuối: 128, 32, 8, 2, và 0,5 µg/ml; ủ trong 3 ngày ở 37°C, 5% $\text{CO}_2$.
    • Đo độ hấp thụ: Thêm dung dịch MTT ($1\text{ mg/ml}$), ủ 4 giờ ở 37°C, loại bỏ môi trường, hòa tan tinh thể formazan bằng $100\text{ }\mu\text{l DMSO}$, đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm trên máy quang phổ Genios Tecan.
    • Xử lý kết quả: Tính phần trăm kìm hãm sự phát triển ($\text{GI}%$) và xác định giá trị $\text{IC}_{50}$ bằng phần mềm Table Curve. Thử nghiệm thực hiện tại Viện Hóa học - VAST.

2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư tủy xương cấp (OCI-AML)

  • Dòng tế bào: Dòng tế bào bạch cầu lympho T ung thư bạch cầu cấp tính (T cell leukemia) tách từ tủy sống người bệnh (OCI-AML). Thử nghiệm tiến hành tại Đại học Tổng hợp Perugia (Cộng hòa Italy).
  • Kỹ thuật thử nghiệm: Xác định tỷ lệ tế bào sống sót qua nhuộm màng tế bào bằng propidium 0,4% (tỷ lệ 1:1) do màng tế bào sống không bị thấm thuốc nhuộm.
  • Quy trình:
    • Tế bào bảo quản ở -70°C được làm ấm về 37°C, pha loãng trong RPMI/10% natriglutamine.
    • Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng để thu cặn tế bào, huyền phù lại trong 1 ml PBS.
    • Nuôi cấy trên đĩa petri có bổ sung mẫu thử theo các nồng độ khác nhau trong tủ ấm 37°C suốt 72 giờ.
    • Nhuộm màu với dung dịch propidium 0,4%, đếm số lượng tế bào sống/chết trên buồng đếm hemocytometer, phân tích biểu hiện protein bằng Western Blot và phân tích chu kỳ tế bào bằng hệ thống dòng chảy tế bào (flow cytometry).
    • Công thức tính: $$% \text{ tế bào sống sót} = \frac{\text{Tổng số tế bào sống sót trong 1 ml}}{\text{Tổng số tế bào có trong 1 ml}} \times 100$$

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: TỔNG QUAN

Chương này hệ thống hóa các tư liệu khoa học về phân loại thực vật học, vùng phân bố, kinh nghiệm sử dụng dân gian và thành phần hóa thực vật của hai chi Dacrycarpus và Fokienia.

1. Đặc điểm thực vật và thành phần chi Dacrycarpus

  • Chi Dacrycarpus gồm 15 loài và 4 dưới loài. Loài Dacrycarpus imbricatus (Thông nàng / Kim giao kết lợp / Thông lông gà / Bạch tùng mạy hương) là đại diện duy nhất tại Việt Nam, phân bố từ vùng núi phía Bắc (Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu, Tuyên Quang, Lạng Sơn, Hòa Bình, Thanh Hóa) qua Bắc Trường Sơn (Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình), Trung Trường Sơn (Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Gia Lai) đến Nam Trường Sơn (Đắk Lắk, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Đắk Nông).
  • Cây gỗ lớn cao 30–50 m, đường kính 1,2–2 m; hạt hình cầu 4–5 mm, khi chín chuyển từ màu lục sang da cam, đỏ mọng rồi nâu.
  • Theo y học cổ truyền, Thông nàng có vị nhạt chát, tính bình; có tác dụng tán nhiệt tiêu thũng, sát trùng, chỉ dương, dùng chữa cảm mạo và bệnh ngoài da.
  • Các hợp chất tiêu biểu được điểm lại từ các nghiên cứu quốc tế: diterpene totarol, acid lambertic; các flavonoid glycoside của myricetin, quercetin, tricetin; các anthocyanin gồm cyanidin-3-glucoside, delphinidin-3-glucoside, peonidin-3-glucoside, pelargonidin-3-glucoside.

2. Đặc điểm thực vật và thành phần chi Fokienia

  • Chi Fokienia thuộc họ Cupressaceae chỉ có 1 loài tại Việt Nam là cây Pơ mu (Fokienia hodginsii). Phân bố tại các tỉnh miền núi phía Bắc và Tây Nguyên ở độ cao 600–1.800 m. Cây gỗ cao tới 30 m, đường kính ngang ngực tới 1,5 m.
  • Dân gian sử dụng gỗ làm đồ gia dụng không mối mọt; tinh dầu dùng làm hương liệu, chất sát trùng, chống viêm, chữa sưng tấy và xua muỗi.
  • Tổng quan các hợp chất diterpene isopimarane (fokihodgin A–E), labdane (fokihodgin F–I), icetexane H, ferruginol, trans-communal và các sesquiterpene trong tinh dầu ($(E)$-nerolidol, fokienol, dauca-8(14),11-dien-9-ol).

Chương 2: THỰC NGHIỆM

Chương này trình bày chi tiết quy trình chiết tách phân đoạn, tinh chế sắc ký và số liệu phổ của các hợp chất phân lập từ hai loài Thông nàng và Pơ mu.

Đối tượng thực vật Bộ phận nghiên cứu Khối lượng mẫu khô (g) Khối lượng cao tổng (g) Hiệu suất cao tổng (%) Phân đoạn $n$-hexane (g) Phân đoạn EtOAc (g) Phân đoạn $n$-BuOH (g)
Thông nàng (D. imbricatus) Vỏ thân 800 42,20 5,27% 1,02 5,12 8,18
Thông nàng (D. imbricatus) Gỗ thân 650 8,00 1,23% 1,00 3,42 0,21
Thông nàng (D. imbricatus) Cành lá 900 62,21 6,91% 10,80 18,00 10,20
Pơ mu (F. hodginsii) Cành lá 900 80,24 8,91% 14,00 18,30 12,00

1. Quá trình phân lập các hợp chất từ loài Thông nàng (Dacrycarpus imbricatus)

  • Từ vỏ thân:

    • Phân đoạn cao ethyl acetate (5,12 g) được chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi $\text{DCM}:\text{MeOH}$ (tỷ lệ 98:2 $\rightarrow$ 80:20) thu được 25 phân đoạn (HDIE1–HDIE25).
    • Phân đoạn HDIE3 kết tinh lại trong methanol thu được hợp chất 86 ($\beta$-sitosterol, 30 mg, hàm lượng 0,0037% so với mẫu khô, $R_f = 0,34$ trong hệ $n$-hexane:$\text{DCM}$ 1:3).
    • Phân đoạn HDIE16 chạy cột silica gel ($\text{EtOAc}:\text{MeOH}$ 100:0 $\rightarrow$ 100:2) rồi qua Sephadex LH-20 ($\text{MeOH}$) phân lập được hợp chất 89 (catechin, 16 mg, dạng keo đỏ tía, $R_f = 0,2$ trong hệ $\text{DCM}:\text{MeOH}:\text{H}2\text{O}$ 4:1:0,1) và kết tinh thu được hợp chất 87 (ponasterone A, 13 mg, bột trắng hình kim, $R_f = 0,3$ trong hệ $\text{DCM}:\text{MeOH}$ 4,5:0,5, $t^o{\text{nc}} = 259\text{--}260^\circ\text{C}$, công thức phân tử $\text{C}{27}\text{H}{44}\text{O}_6$, phổ HR-ESI-MS: $m/z = 487,3029\text{ [M+Na]}^+$, $m/z = 465,3209\text{ [M+H]}^+$).
    • Phân đoạn HDIE22 qua cột Sephadex LH-20 và cột pha đảo RP-18 ($\text{MeOH}:\text{H}_2\text{O}$ 2:3 $\rightarrow$ 1:1) tách được hợp chất 88 (17 mg, hình kim màu trắng, $R_f = 0,3$ trong hệ $\text{DCM}:\text{MeOH}$ 4:1).
    • Cao $n$-butanol (8,18 g) chạy cột với hệ $\text{EtOAc}:\text{MeOH}:\text{H}_2\text{O}$ (6:1:0,1 $\rightarrow$ 0,5) nhưng không tách được chất sạch do hàm lượng thấp.

  • Từ gỗ thân:

    • Phân đoạn cao ethyl acetate (3,42 g) chạy sắc ký cột silica gel ($n$-hexane:$\text{DCM}:\text{MeOH}$ 1:4:0,02 $\rightarrow$ 0,1) thu được 13 phân đoạn. Phân đoạn GE10 qua cột silica gel ($n$-hexane:$\text{EtOAc}$ 98:2 $\rightarrow$ 95:5) và Sephadex LH-20 thu được hợp chất 84 (acid lambertic, bột trắng, hàm lượng 0,0016%, $R_f = 0,5$ trong hệ $n$-hexane:$\text{EtOAc}$ 4:1, $[\alpha]^{25}{\text{D}} = +58^\circ$ ($c\text{ }0,1\text{ trong MeOH}$), $t^o{\text{nc}} = 129\text{--}130^\circ\text{C}$, $\text{C}{20}\text{H}{28}\text{O}_3$).
      • Tín hiệu phổ $^1\text{H-NMR}$ (500 MHz, $\text{CD}_3\text{OD}$): $\delta\text{ (ppm)} = 6,98\text{ (1H, d, } J = 8,3\text{ Hz, H-12)}$; $6,52\text{ (1H, d, } J = 8,5\text{ Hz, H-11)}$; $3,12\text{--}3,14\text{ (1H, m, H-15)}$; $2,94\text{ (1H, dd, } J = 14,1; 6,3\text{ Hz, H-7}\alpha)$; $2,74\text{--}2,76\text{ (1H, m, H-7}\beta)$; $2,26\text{--}2,28\text{ (1H, m, H-6}\alpha)$; $2,01\text{ (1H, dd, } J = 13,8\text{ Hz, H-1}\alpha)$; $1,86\text{ (1H, d, } J = 13,4\text{ Hz, H-3}\alpha)$; $1,71\text{--}1,73\text{ (1H, m, H-2}\alpha)$; $1,67\text{--}1,69\text{ (1H, m, H-1}\beta)$; $1,62\text{--}1,64\text{ (1H, m, H-2}\beta)$; $1,42\text{ (1H, d, } J = 13,4\text{ Hz, H-5)}$; $1,38\text{ (1H, d, } J = 13,4\text{ Hz, H-6}\beta)$; $1,34\text{ (3H, d, } J = 7\text{ Hz, H-16)}$; $1,33\text{ (3H, d, } J = 7\text{ Hz, H-17)}$; $1,18\text{ (3H, s, H-20)}$; $1,06\text{ (3H, s, H-18)}$; $1,00\text{ (1H, dd, } J = 13,0; 4,3\text{ Hz, H-3}\beta)$.
    • Phân đoạn cao $n$-butanol (0,21 g) qua cột silica gel ($\text{EtOAc}:\text{MeOH}$ 4:0,5 $\rightarrow$ 4:1) và Sephadex LH-20 tách được hợp chất GB2 (saccaroza, 18 mg).

  • Từ cành lá:

    • Phân đoạn cao $n$-hexane (10,8 g) chạy sắc ký cột thu được 40 phân đoạn:
      • Phân đoạn DIH01 qua cột silica gel ($n$-hexane:$\text{EtOAc}$ 100:2) tách được hợp chất 79 (cassipouryl hexadecanoat, hợp chất mới, dạng dầu không màu, 53 mg, hàm lượng 0,0059%, $R_f = 0,5$ trong hệ $n$-hexane:$\text{EtOAc}$ 5:0,2, công thức $\text{C}{36}\text{H}{68}\text{O}_2$).
      • Phân đoạn DIH02 tách được hợp chất 85 (10 mg, dạng dầu, $R_f = 0,25$) và hợp chất 78 (cassipourol, 12 mg, dạng dầu không màu, hàm lượng 0,0013%, $R_f = 0,5$ trong hệ $n$-hexane:$\text{DCM}$ 3:1,5, $[\alpha]^{25}{\text{D}} = +10,9^\circ$ ($c\text{ }0,1\text{ trong CHCl}3$), công thức $\text{C}{20}\text{H}{38}\text{O}$).
      • Phân đoạn DIH03 tách được hỗn hợp gồm acid trans-communic (81) và acid cis-communic (82) theo tỷ lệ 78:22 (30 mg dạng dầu, hàm lượng 0,0038%, $R_f = 0,52$, công thức $\text{C}{20}\text{H}{30}\text{O}_2$).
        • Số liệu phổ của hợp chất 81: $^1\text{H-NMR}$ (500 MHz, $\text{CDCl}_3$): $\delta = 6,32\text{ (1H, dd, } J = 17,0; 10,5\text{ Hz, H-14)}$; $5,41\text{ (1H, t, } J = 6,0\text{ Hz, H-12)}$; $5,04\text{ (1H, d, } J = 17,0\text{ Hz, H-15a)}$; $4,88\text{ (1H, d, } J = 10,5\text{ Hz, H-15b)}$; $4,84\text{ (1H, s, H-17a)}$; $4,47\text{ (1H, s, H-17b)}$; $1,75\text{ (3H, s, H-16)}$; $1,25\text{ (3H, s, H-18)}$; $0,65\text{ (3H, s, H-20)}$. Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ (125 MHz, $\text{CDCl}_3$): $\delta = 183,90\text{ (C-19)}$; $147,93\text{ (C-8)}$; $141,61\text{ (C-12)}$; $133,90\text{ (C-14)}$; $133,45\text{ (C-13)}$; $109,91\text{ (C-15)}$; $107,66\text{ (C-17)}$; $56,43\text{ (C-5)}$; $56,29\text{ (C-9)}$; $44,21\text{ (C-4)}$; $40,37\text{ (C-10)}$; $39,27\text{ (C-6)}$; $38,49\text{ (C-1)}$; $37,93\text{ (C-3)}$; $29,04\text{ (C-18)}$; $25,84\text{ (C-7)}$; $23,31\text{ (C-11)}$; $19,93\text{ (C-2)}$; $12,83\text{ (C-20)}$; $11,84\text{ (C-16)}$.
        • Số liệu phổ của hợp chất 82: $^1\text{H-NMR}$ (500 MHz, $\text{CDCl}_3$): $\delta = 6,78\text{ (1H, dd, } J = 17,5; 11,0\text{ Hz, H-14)}$; $5,31\text{ (1H, t, } J = 6,0\text{ Hz, H-12)}$; $5,18\text{ (1H, d, } J = 17,5\text{ Hz, H-15a)}$; $5,08\text{ (1H, d, } J = 11,0\text{ Hz, H-15b)}$; $4,84\text{ (1H, s, H-17a)}$; $4,49\text{ (3H, s, H-17b)}$; $1,77\text{ (3H, s, H-16)}$; $1,25\text{ (3H, s, H-18)}$; $0,65\text{ (3H, s, H-20)}$. Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ (125 MHz, $\text{CDCl}_3$): $\delta = 183,90\text{ (C-19)}$; $147,93\text{ (C-8)}$; $133,86\text{ (C-14)}$; $131,67\text{ (C-12)}$; $131,56\text{ (C-13)}$; $113,25\text{ (C-15)}$; $107,80\text{ (C-17)}$; $56,70\text{ (C-9)}$; $56,43\text{ (C-5)}$; $44,21\text{ (C-4)}$; $40,43\text{ (C-10)}$; $39,27\text{ (C-6)}$; $38,52\text{ (C-1)}$; $37,93\text{ (C-3)}$; $29,04\text{ (C-18)}$; $25,84\text{ (C-7)}$; $22,28\text{ (C-11)}$; $19,93\text{ (C-2)}$; $19,72\text{ (C-16)}$; $12,83\text{ (C-20)}$.
      • Phân đoạn DIH031 kết tinh thu được $\beta$-sitosterol (86, 30 mg).
      • Phân đoạn DIH40 thu được hợp chất 83 (12 mg, kết tinh hình kim, $R_f = 0,5$).
    • Phân đoạn cao ethyl acetate (18,0 g) chạy sắc ký cột ($\text{DCM}:\text{MeOH}$ 98:2 $\rightarrow$ 4:1) tách được 25 phân đoạn. Phân đoạn DIE4 qua cột silica gel ($n$-hexane:$\text{EtOAc}$ 4:1) tách được hợp chất 80 (acid 12,13-dihydroxylabda-8(17),14-dien-19-oic, 8 mg dạng dầu, hàm lượng 0,0009%, $R_f = 0,2$ trong hệ $n$-hexane:$\text{EtOAc}$ 2:1, công thức $\text{C}{20}\text{H}{32}\text{O}_4$).

2. Quá trình phân lập các hợp chất từ loài Pơ mu (Fokienia hodginsii)

  • Từ cành lá:
    • Phân đoạn cao $n$-hexane (14,0 g) chạy sắc ký cột silica gel ($n$-hexane:$\text{EtOAc}$ 100:0 $\rightarrow$ 4:1) thu được 20 phân đoạn (FHH1–FHH20).
      • Phân đoạn FHH7 tách được chất FHH7 và chất FHH7.2 (chất 86, $\beta$-sitosterol).
      • Phân đoạn FHH10 tách được chất FHH10; phân đoạn FHH12 tách được chất FHH12.
      • Phân đoạn FHH16 qua cột silica gel ($n$-hexane:$\text{EtOAc}$ 100:0 $\rightarrow$ 9:1) và Sephadex LH-20 ($\text{MeOH}$) thu được hợp chất 91 và hợp chất 93 (dạng dầu không màu, $R_f$ lần lượt là 0,57 và 0,55 trong hệ $n$-hexane:$\text{EtOAc}$ 4:1).
      • Tách được hợp chất 81 (acid trans-communic, chất rắn tinh thể hình kim màu trắng, hàm lượng 0,0022%, $R_f = 0,5$, $[\alpha]^{25}{\text{D}} = +38^\circ$ ($c\text{ }0,1\text{ trong MeOH}$), $t^o{\text{nc}} = 130\text{--}132^\circ\text{C}$, $\text{C}{20}\text{H}{30}\text{O}_2$). Phổ $^1\text{H-NMR}$ (500 MHz, $\text{CD}_3\text{OD}$): $\delta = 6,34\text{ (1H, dd, } J = 17,5; 17,0\text{ Hz, H-14)}$; $5,40\text{ (1H, t, } J = 6,5\text{ Hz, H-12)}$; $5,04\text{ (1H, d, } J = 17,5\text{ Hz, H-15a)}$; $4,88\text{ (1H, d, } J = 9,5\text{ Hz, H-15b)}$; $4,85\text{ (1H, br s, H-17a)}$; $4,47\text{ (1H, br s, H-17b)}$; $1,75\text{ (3H, s, H-16)}$; $1,22\text{ (3H, s, H-18)}$; $0,70\text{ (3H, s, H-20)}$.
    • Phân đoạn cao ethyl acetate (18,3 g) chạy sắc ký cột ($\text{DCM}:\text{MeOH}$ 98:2 $\rightarrow$ 4:1) thu được 10 phân đoạn (FHE1–FHE10):
      • Tách được hợp chất 80 (acid 12,13-dihydroxylabda-8(17),14-dien-19-oic, tinh thể hình kim màu trắng, hàm lượng 0,0022%, $R_f = 0,5$, công thức $\text{C}{20}\text{H}{32}\text{O}_4$).
      • Tách được hợp chất 94 ((9S)-drummondol, dạng dầu không màu, hàm lượng 0,0012%, $R_f = 0,5$ trong hệ $n$-hexane:$\text{EtOAc}$ 4:1, công thức $\text{C}{13}\text{H}{20}\text{O}_4$). Phổ $^1\text{H-NMR}$ (500 MHz, $\text{CD}_3\text{OD}$): $\delta = 6,19\text{ (1H, dd, } J = 16,5; 5,5\text{ Hz, H-8)}$; $6,05\text{ (1H, d, } J = 16,5\text{ Hz, H-7)}$; $4,40\text{ (1H, dq, } J = 5,2; 6,5\text{ Hz, H-9)}$; $3,93\text{ (1H, dd, } J = 8,0; 2,5\text{ Hz, H-11}\alpha)$; $3,67\text{ (1H, d, } J = 8,0\text{ Hz, H-11}\beta)$; $2,80\text{ (1H, d, } J = 17,5\text{ Hz, H-4}\alpha)$; $2,68\text{ (1H, dd, } J = 18,0; 2,5\text{ Hz, H-2}\alpha)$; $2,45\text{ (1H, dd, } J = 17,5; 2,5\text{ Hz, H-4}\beta)$; $2,37\text{ (1H, dd, } J = 18,0; 2,5\text{ Hz, H-2}\beta)$; $1,30\text{ (3H, d, } J = 6,5\text{ Hz, H-10)}$; $1,20\text{ (3H, s, H-13)}$; $0,98\text{ (3H, s, H-12)}$.
      • Tách được hợp chất 95 (vomifoliol, dạng dầu không màu).

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt hóa học

  • Phân lập và xác định cấu trúc một hợp chất tự nhiên mới từ cành lá loài Thông nàng (Dacrycarpus imbricatus) thu hái tại tỉnh Lâm Đồng: cassipouryl hexadecanoat (hợp chất 79, công thức phân tử $\text{C}{36}\text{H}{68}\text{O}_2$).
  • Lần đầu tiên công bố dữ liệu phân lập và nhận danh cấu trúc đầy đủ của các hợp chất không bay hơi từ các bộ phận riêng biệt (vỏ thân, gỗ thân, cành lá) của loài Thông nàng (D. imbricatus) tại Việt Nam, bao gồm:
    • Nhóm diterpenoid: acid lambertic (84), cassipourol (78), acid trans-communic (81), acid cis-communic (82), acid 12,13-dihydroxylabda-8(17),14-dien-19-oic (80).
    • Nhóm steroid và ecdysteroid: $\beta$-sitosterol (86), ponasterone A (87).
    • Nhóm polyphenol: catechin (89).
    • Nhóm saccharide: saccaroza (GB2).
  • Lần đầu tiên khảo sát thành phần hóa học không bay hơi của cành lá loài Pơ mu (Fokienia hodginsii) thu hái tại Việt Nam, phân lập và xác định các hợp chất:
    • Nhóm diterpenoid: acid trans-communic (81), acid 12,13-dihydroxylabda-8(17),14-dien-19-oic (80).
    • Nhóm megastigmane / norisoprenoid: (9S)-drummondol (94), vomifoliol (95).
    • Nhóm steroid: $\beta$-sitosterol (86).
  • Xây dựng hệ thống quy trình chiết phân đoạn và tinh chế sắc ký cột đa dạng (pha thuận silica gel, pha đảo RP-18, rây phân tử Sephadex LH-20) phù hợp cho việc tách các hợp chất diterpene và dẫn xuất phân cực từ hai loài thực vật hạt trần nghiên cứu.

Đóng góp về mặt thực tiễn

  • Bổ sung bộ dữ liệu phổ chi tiết (FT-IR, $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, HSQC, HMBC, HR-ESI-MS, nhiệt độ nóng chảy, năng suất quay cực) của các diterpenoid và steroid tự nhiên phục vụ công tác tra cứu phổ học và nghiên cứu hóa học thực vật.
  • Cung cấp cơ sở thực nghiệm cho quy trình đánh giá độc tính tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung thư người (KB, HepG2, OCI-AML), tạo tiền đề cho việc sàng lọc hoạt tính dược lý từ nguồn tài nguyên cây thuốc Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Dữ liệu văn bản tập trung chủ yếu vào phần tổng quan, quy trình chiết tách thực nghiệm và thông số phổ nhận danh các chất sạch; một số phân đoạn có khối lượng chất thấp (như cao chiết $n$-butanol từ vỏ thân Thông nàng) chưa phân lập được các chất đơn lẻ.
  • Phạm vi thu mẫu mới thực hiện tại một địa bàn (tỉnh Lâm Đồng) vào một thời điểm nhất định (tháng 8 năm 2012), chưa phản ánh sự biến thiên hàm lượng hoạt chất theo mùa hoặc theo các vùng sinh thái khác nhau.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Tiếp tục tối ưu hóa quy trình sắc ký trên các phân đoạn cao chiết ethyl acetate và $n$-butanol còn lại để thu nhận thêm các hợp chất thứ cấp phân cực khác.
  • Mở rộng thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học của các chất sạch phân lập được trên các dòng tế bào ung thư KB, HepG2 và OCI-AML, đồng thời khảo sát thêm các hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hóa và bảo vệ tế bào thần kinh theo định hướng từ tổng quan tài liệu.

Giá trị tham khảo

Đối tượng sử dụng

  • Nghiên cứu sinh và học viên cao học: Chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược, Dược liệu học và Thực vật học có thể sử dụng luận án làm tài liệu tham khảo về phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng, kỹ thuật sắc ký cột và phương pháp giải phổ cấu trúc hợp chất hữu cơ tự nhiên.
  • Giảng viên và cán bộ nghiên cứu: Phục vụ giảng dạy chuyên đề hóa học thực vật hạt trần và xây dựng các đề tài nghiên cứu sàng lọc hoạt tính sinh học từ dược liệu.
  • Các nhà phát triển dược liệu: Tham khảo thông tin thành phần hóa học và tiềm năng ứng dụng của Thông nàng và Pơ mu nhằm định hướng khai thác bền vững nguồn tài nguyên rừng.

Các nội dung đáng tham khảo

  • Quy trình chiết phân đoạn cụ thể từ mẫu thô đến từng phân đoạn dung môi ($n$-hexane, EtOAc, $n$-BuOH) đối với từng bộ phận vỏ, gỗ và cành lá.
  • Bảng số liệu dịch chuyển hóa học phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$) và hằng số tương tác ($J$) của các diterpenoid như acid lambertic, acid trans-communic, acid cis-communic và dẫn xuất norisoprenoid (9S)-drummondol.
  • Quy trình chuẩn bị mẫu và các bước thực nghiệm thử độc tính tế bào ung thư theo phương pháp MTT (cho dòng KB, HepG2) và kỹ thuật nhuộm sống sót tế bào bằng propidium (cho dòng OCI-AML).

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu thực vật Thông nàng và Pơ mu sử dụng trong luận án được thu thập ở đâu và vào thời gian nào?

Mẫu vỏ thân, gỗ thân, cành lá loài Thông nàng (Dacrycarpus imbricatus) và cành lá loài Pơ mu (Fokienia hodginsii) được thu hái tại tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam vào tháng 8 năm 2012. Tên khoa học được xác định bởi TS. Nguyễn Tiến Hiệp và tiêu bản được lưu trữ tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam với mã số VNMN.B0000050010 (Thông nàng) và VNMN.B000005002 (Pơ mu).

2. Hợp chất mới nào đã được phân lập từ loài Thông nàng trong nghiên cứu này?

Từ phân đoạn cao $n$-hexane của cành lá cây Thông nàng, luận án đã phân lập và xác định cấu trúc một hợp chất mới là cassipouryl hexadecanoat (hợp chất 79), có dạng dầu không màu, công thức phân tử $\text{C}{36}\text{H}{68}\text{O}_2$, khối lượng thu được là 53 mg (tương ứng hàm lượng 0,0059% so với khối lượng mẫu khô).

3. Hiệu suất thu hồi cao tổng và phân đoạn từ các bộ phận thực vật trong luận án đạt mức bao nhiêu?

  • Vỏ thân Thông nàng (800 g mẫu khô) thu được 42,20 g cao tổng (hiệu suất 5,27%); phân đoạn $n$-hexane (1,02 g), EtOAc (5,12 g), $n$-BuOH (8,18 g).
  • Gỗ thân Thông nàng (650 g mẫu khô) thu được 8,00 g cao tổng (hiệu suất 1,23%); phân đoạn $n$-hexane (1,00 g), EtOAc (3,42 g), $n$-BuOH (0,21 g).
  • Cành lá Thông nàng (900 g mẫu khô) thu được 62,21 g cao tổng (hiệu suất 6,91%); phân đoạn $n$-hexane (10,80 g), EtOAc (18,00 g), $n$-BuOH (10,20 g).
  • Cành lá Pơ mu (900 g mẫu khô) thu được 80,24 g cao tổng (hiệu suất 8,91%); phân đoạn $n$-hexane (14,00 g), EtOAc (18,30 g), $n$-BuOH (12,00 g).

4. Những phương pháp phổ và thiết bị nào được sử dụng để xác định cấu trúc các hợp chất sạch?

Cấu trúc các chất được xác định bằng: phổ hồng ngoại FT-IR (Perkin Elmer Spectrum Two), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D NMR (Bruker Avance 500 MHz), phổ khối lượng ESI-MS (Agilent LC-MSD-Trap SL, AMD 402), phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (FT-ICR-MS Varian), máy đo điểm nóng chảy VEB Analytik Dresden HMK 73/4470 và máy đo năng suất quay cực Jasco P-2000 Polarimeter.

5. Luận án thiết lập các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học nào?

Phần thực nghiệm của luận án thiết lập hai hệ thống thử nghiệm độc tế bào in vitro:

  1. Thử nghiệm trên dòng ung thư biểu mô KB và ung thư gan HepG2 bằng phương pháp MTT (đo độ hấp thụ quang tại 540 nm trên máy Genios Tecan sau khi ủ với mẫu thử ở 5 mức nồng độ từ 0,5 đến 128 µg/ml) tại Viện Hóa học - VAST.
  2. Thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư bạch cầu cấp tính lympho T từ tủy sống người (OCI-AML) bằng kỹ thuật nhuộm propidium 0,4%, đếm tế bào bằng hemocytometer, phân tích Western Blot và flow cytometry tại Đại học Tổng hợp Perugia (Cộng hòa Italy).

Kết luận

Luận án tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và xây dựng hệ thống thử nghiệm hoạt tính sinh học đối với hai loài thực vật hạt trần là Thông nàng (Dacrycarpus imbricatus) và Pơ mu (Fokienia hodginsii) thu hái tại Lâm Đồng. Bằng các phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng và sắc ký cột kết hợp các kỹ thuật phổ hiện đại (NMR, MS, IR), công trình đã phân lập và xác định cấu trúc một hợp chất mới là cassipouryl hexadecanoat cùng nhiều hợp chất thuộc các nhóm diterpenoid, steroid, ecdysteroid, megastigmane và polyphenol. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học về thành phần hóa thực vật của hai loài cây thuộc họ Podocarpaceae và Cupressaceae tại Việt Nam, phục vụ công tác tra cứu và định hướng sàng lọc hoạt chất tự nhiên.