Tổng quan luận án

Việc nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng và định hướng điều trị các bệnh nan y, đặc biệt là ung thư, là hướng nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Việt Nam sở hữu hệ sinh thái thực vật phong phú với khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, trong đó có gần 5.000 loài được sử dụng trong y học cổ truyền. Trong số các họ thực vật bản địa, họ Gai (Urticaceae) và họ Dương đầu (Olacaceae) phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền Bắc, với nhiều loài có rễ và các bộ phận khác được sử dụng trong dân gian để chữa cảm cúm, sốt cao, sởi, ho hen, lở loét, mẩn ngứa, thanh nhiệt, giải độc hoặc rắn cắn.

Trong khuôn khổ Dự án Hợp tác Quốc tế Việt – Pháp "Nghiên cứu hóa thực vật của thảm thực vật Việt Nam", khảo sát hoạt tính sinh học sơ bộ đã chỉ ra rằng dịch chiết ethyl acetate (EtOAc) từ lá loài Pilea aff. martinii có khả năng ức chế 100% sự phát triển của dòng tế bào ung thư biểu mô người KB ở nồng độ 1 µg/mL; dịch chiết quả loài Boehmeria holosericea Blume ức chế 25% ở cùng nồng độ 1 µg/mL; và dịch chiết vỏ cây Anacolosa poilanei Gagnep. cũng thể hiện khả năng ức chế tế bào ung thư KB rất mạnh. Mặc dù vậy, các dữ liệu về thành phần hóa học của chi Pilea và chi Anacolosa trên thế giới còn rất hạn chế. Đặc biệt, tại thời điểm thực hiện đề tài, chưa có công trình nào trên thế giới và tại Việt Nam công bố về hóa thực vật của hai loài Pilea aff. martinii và Anacolosa poilanei, cũng như chưa có công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Boehmeria holosericea thu hái tại Việt Nam.

Xuất phát từ thực tế đó, luận án tiến sĩ với đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài Pilea aff. martinii, Boehmeria holosericea Blume, Anacolosa poilanei Gagnep." được thực hiện tại Bộ môn Hóa Hữu cơ, Viện Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội phối hợp với Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu làm rõ thành phần hoá học chủ yếu của lá loài Pilea aff. martinii, quả loài Boehmeria holosericea Blume thuộc họ Gai (Urticaceae) và vỏ loài Anacolosa poilanei Gagnep. thuộc họ Dương đầu (Olacaceae) nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào, tạo cơ sở khoa học cho việc định hướng sử dụng và ứng dụng 3 loài thực vật trên.

Nhiệm vụ nghiên cứu

Luận án thực hiện 3 nội dung chính được đánh số theo văn bản:

  1. Phân lập các hợp chất từ lá loài Pilea aff. martinii, quả loài Boehmeria holosericea Blume thuộc họ Gai (Urticaceae) và vỏ loài Anacolosa poilanei Gagnep. thuộc họ Dương đầu (Olacaceae) bằng các phương pháp sắc ký;
  2. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý hiện đại;
  3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được trên một số dòng tế bào ung thư người.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng thực vật:
    • Lá cây Pilea aff. martinii (họ Urticaceae), thu hái tại Quản Bạ, tỉnh Hà Giang vào tháng 06 năm 2008 (mã số tiêu bản VN-1909).
    • Quả cây Boehmeria holosericea Blume (tên tiếng Việt: Gai toàn tơ, Gai dại; họ Urticaceae), thu hái tại Bình Gia, tỉnh Lạng Sơn vào tháng 10 năm 2004 (mã số tiêu bản VN-1392).
    • Vỏ cây Anacolosa poilanei Gagnep. (tên tiếng Việt: Xinh, Xun; họ Olacaceae), thu hái tại Sa Pa, tỉnh Lào Cai vào tháng 06 năm 2003 (mã số tiêu bản VN-1124).
    • Toàn bộ các mẫu cây được TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học; các mẫu tiêu bản được lưu giữ và bảo quản tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
  • Phạm vi khoa học: Chiết xuất, phân lập các chất thứ cấp sạch; xác định cấu trúc hóa học và cấu hình tuyệt đối bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại; thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên 4 dòng tế bào ung thư người gồm ung thư biểu mô KB (CCL-17TM), ung thư gan Hep-G2 (HB-8065TM), ung thư phổi LU-1 (HTB-57TM) và ung thư vú MCF-7 (HTB-22TM).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tình hình nghiên cứu về chi Pilea (họ Urticaceae)

Họ Gai (Urticaceae) có khoảng 48 chi và hơn 1.000 loài trên thế giới, trong đó tại Việt Nam đã ghi nhận 21 chi. Chi Pilea là chi lớn nhất và đa dạng nhất trong họ Urticaceae với khoảng 600–715 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới. Theo Võ Văn Chi và Phạm Hoàng Hộ, Việt Nam có 18 loài thuộc chi Pilea.

Về mặt hóa học, trên thế giới trước đây mới chỉ có 4 loài thuộc chi này được nghiên cứu gồm P. cavaleriei subsp. crenata, P. cavaleriei, P. mongolica và P. microphylla. Các nghiên cứu đã phân lập được các lớp chất chính:

  • Terpenoid: 31 hợp chất, chủ yếu là sesquiterpene khung humulane (như 8-O-(p-coumaroyl)-5β-hydroperoxy-1(10)E,4(15)-humuladien-8α-ol) và triterpene khung oleanane (friedelin, acid oleanolic, acid ursolic, acid epi-oleanoic, acid oxo-oleanoic).
  • Flavonoid: 5 hợp chất (quercetin-3-O-rutinoside, apigenin-7-O-rutinoside, quercetin, luteolin-7-O-glucoside...).
  • Lignan: 18 hợp chất từ loài Pilea cavaleriei subsp. crenata, chủ yếu thuộc nhóm furan và neolignan glycoside (lariciresinol, armandiside, citrusin A, citrusin B...).
  • Alkaloid và dị vòng chứa nitơ: Loài Pilea cavaleriei subsp. cavaleriei là loài duy nhất từng được công bố chứa alkaloid với cấu trúc đơn giản như 3-carboxaldehyde indole, acid 3-indol carboxylic, pilealkaloid A, 4-methyl-(1,2,3)-triazole, uracil, nicotinamide.
  • Dẫn xuất phenolic và chất khác: 22 hợp chất gồm acid benzoic, acid gallic, acid protocatechuic, acid 3-O-caffeoylquinic.

Về hoạt tính sinh học, Hak Cheol Kwon và cộng sự (1997) công bố hai triterpene từ P. mongolica (acid epi-oleanoic và acid oxo-oleanoic) có khả năng gây độc tế bào trên 5 dòng tế bào ung thư người (A549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF498, HCT15) với giá trị ED50 tương ứng 3,2–8,1 mg/mL và 0,7–6,8 µg/mL. Năm 2009, các hợp chất humulane sesquiterpene từ P. crenata được chứng minh ức chế tế bào ung thư bạch cầu tủy mãn tính, ung thư dạ dày, ung thư vú và ức chế tụ cầu vàng Staphylococcus aureus với MIC 45,0 µg/mL. Năm 2010, Amir Modarresi Chahardehi và cộng sự xác định dịch chiết methanol của P. microphylla có hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa với EC50 81,32 µg/mL. Năm 2011, Bansal và cộng sự chỉ ra phân đoạn phenolic từ P. microphylla có khả năng bẫy gốc tự do DPPH, ABTS và bảo vệ DNA tế bào trước tác nhân bức xạ. Đối với loài Pilea martinii (mô tả năm 1913 bởi H. Léveillé dưới tên Boehmeria martini, sau đó năm 1929 Handel-Mazzetti chuyển sang chi Pilea), chưa từng có công trình hóa thực vật nào được công bố.

Tình hình nghiên cứu về chi Boehmeria (họ Urticaceae)

Chi Boehmeria gồm khoảng 100 loài, ở Việt Nam có 10 loài. Các nghiên cứu trên thế giới đã xác định sự có mặt của:

  • 9 hợp chất triterpenoid (acid ursolic, acid 2α-hydroxyursolic, acid tormentic, acid maslinic, acid betulinic từ B. nivea).
  • 12 hợp chất flavonoid (quercetin, genistein, rutin, astragalin, kaempferol-3-O-rutinoside từ B. nivea, B. rugulosa, B. macrophylla, B. holosericea).
  • 8 hợp chất alkaloid, tiêu biểu là các alkaloid có khung phenanthroquinolizidine và phenanthroindolizidine (boehmeriasin A, boehmeriasin B, cryptopleurine, julandine, hydroxycryptopleurine, 3,4-dimethoxy-ω-(2’-piperidyl)acetophenone).
  • Các hợp chất phenolic (emodin, eugenyl β-rutinoside, acid trans-p-hydroxycinnamic, acid cinnamic).

Về hoạt tính, boehmeriasin A từ B. siamensis thể hiện độc tính mạnh trên 12 dòng tế bào ung thư (GI50 từ 0,2 đến 100 ng/mL). Cai và cộng sự phân lập (-)-cryptopleurine và (-)-(15R)-hydroxycryptopleurine từ rễ B. pannosa, chứng minh tác dụng ức chế yếu tố phản ứng thiếu oxy (HRE) trong tế bào ung thư dạ dày AGS với IC50 lần lượt là 8,7 và 48,1 nM. Nghiên cứu của Yan J và cộng sự chỉ ra acid cinnamic ức chế tế bào ung thư vú MDA-MB-231 ở pha G1. Flavonoid từ B. rugulosa thể hiện hoạt tính hạ đường huyết và kháng khuẩn, kháng nấm ở 25 µg/mL. Tuy nhiên, đối với loài Boehmeria holosericea Blume, tài liệu công bố năm 1975 mới chỉ dừng lại ở việc phân lập 3 flavonoid (rutin, astragalin, kaempferol-3-O-rutinoside); tại Việt Nam chưa có bất kỳ nghiên cứu nào về thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài này.

Tình hình nghiên cứu về chi Anacolosa (họ Olacaceae)

Họ Olacaceae gồm 25 chi, khoảng 200 loài; tại Việt Nam có 6 chi và 13 loài. Chi Anacolosa có khoảng 15–22 loài, phân bố vùng nhiệt đới, trong đó Việt Nam có 4 loài (A. clarkii, A. griffithii, A. moiorum, A. poilanei). Trước luận án này, trên thế giới mới chỉ có 2 công trình công bố về hóa học của chi:

  • Năm 2012, Mélanie Bourjot và cộng sự nghiên cứu lá loài Anacolosa pervilleana Baill. (thu thập tại Madagascar), phân lập được 7 hợp chất gồm 4 acid acetylenic (chất mới anacolosin, acid octadeca-9,11,13-triynoic, acid (13E)-octadec-13-en-9,11-diynoic, acid octadec-13-en-11-ynoic), 2 triterpenoid (lupenone, β-amyrone) và 1 glycoside cyanogen (sambunigrin). Các acid acetylenic thể hiện khả năng ức chế virus Dengue 2 (DENV RdRp với IC50 < 3 µM) và virus West-Nile (WNV RdRp với IC50 từ 10,5 đến 25,0 µM).
  • Năm 2014, Alimboioguen và cộng sự phân lập từ lá Anacolosa frutescens (Blume) Blume tại Philippines hai triterpene là acid 3-acetyleuritolic và α-amyrin.

Chưa có công trình nào về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của loài Anacolosa poilanei Gagnep. được công bố trên thế giới và ở Việt Nam.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết

  1. Chưa có công trình nghiên cứu hóa thực vật và hoạt tính sinh học trên thế giới và tại Việt Nam đối với lá loài Pilea aff. martinii và vỏ cây Anacolosa poilanei.
  2. Chưa có công trình nào nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Boehmeria holosericea tại Việt Nam.
  3. Cần làm sáng tỏ cấu trúc các hợp chất thứ cấp, đặc biệt là nhóm alkaloid phức tạp và triterpenoid, cùng việc xác định cấu hình tuyệt đối và kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào ung thư người của chúng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Quy trình xử lý mẫu và chiết xuất

  • Mẫu thực vật sau thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng râm, sấy ở 40–45°C và nghiền thành bột mịn.
  • Thử định tính alkaloid bằng thuốc thử Mayer.
  • Chiết xuất alkaloid tổng số cho lá Pilea aff. martinii và quả Boehmeria holosericea bằng phương pháp ngâm chiết kiềm hóa/acid hóa chuyên biệt; chiết phân đoạn bằng dung môi có độ phân cực tăng dần đối với vỏ cây Anacolosa poilanei.

Phương pháp phân tích và phân lập (Sắc ký)

  • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 (Merck), độ dày 0,25 mm. Phát hiện vết chất dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử hiện màu chuyên biệt. Hệ dung môi triển khai gồm n-hexane, CH2Cl2, acetone, ethyl acetate (EtOAc), methanol (MeOH).
  • Sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC): Dùng bản mỏng silica gel điều chế, phát hiện vết chất dưới bước sóng 254/365 nm kết hợp hiện màu rìa bản, cạo lớp hấp phụ và giải hấp bằng dung môi thích hợp để thu chất tinh khiết.
  • Sắc ký cột (CC): Sử dụng pha tĩnh silica gel 60 (cỡ hạt 0,040–0,063 mm, 230–400 mesh, Merck), pha động là các dung môi đơn hoặc hỗn hợp dung môi phân cực tăng dần.
  • Sắc ký rây phân tử: Dùng pha tĩnh Sephadex LH-20, rửa giải bằng dung môi MeOH hoặc hỗn hợp CH2Cl2/MeOH.

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

  • Phổ hồng ngoại (FT-IR): Đo trên máy FTIR-IMPACT-410 bằng phương pháp bao film (thực hiện tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội).
  • Phổ khối lượng (MS): Phổ khối phun mù điện tử phân giải thấp (ESI-MS) đo trên hệ máy Agilent 1100. Phổ khối phân giải cao (ESI-HRMS) đo tại Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên (CNRS, Cộng hòa Pháp).
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker NMR Avance 500 MHz (dung môi CDCl3 hoặc CD3OD, chất nội chuẩn Tetramethylsilane - TMS) tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các kỹ thuật áp dụng gồm phổ 1D (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và phổ 2D (1H-1H COSY, NOESY, ROESY, HSQC, HMBC).
  • Phổ lưỡng sắc tròn (CD) và tính toán hóa lượng tử: Đo phổ thực nghiệm trên máy quang phổ CD Chirascan (Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Xác định cấu hình tuyệt đối bằng phương pháp so sánh phổ CD thực nghiệm với phổ CD tính toán lượng tử sử dụng phần mềm Gaussian 09.
  • Hằng số vật lý khác: Đo độ quay cực trên thiết bị Jasco P-2000 (Nhật Bản); đo điểm nóng chảy (Đnc) trên máy MEL-TEMP 3.0 (Thermo Scientific – Mỹ).

Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

Hoạt tính gây độc tế bào in vitro được đánh giá theo phương pháp MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) của Tim Mosmann (1983). Nguyên lý dựa trên khả năng của enzym dehydrogenase trong ty thể của tế bào sống khử muối MTT màu vàng thành phức hợp formazan màu tím đen. Lượng formazan tạo thành được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO) và đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng 540 nm. Hoạt tính được biểu thị bằng giá trị IC50 (nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển của tế bào).

Các phép thử nghiệm sơ bộ dịch chiết được tiến hành tại Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên (CNRS, Pháp); thử nghiệm các chất tinh khiết được tiến hành tại Phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trên 4 dòng tế bào ung thư chuẩn ATCC:

  • Ung thư biểu mô người KB (CCL-17TM)
  • Ung thư gan người Hep-G2 (HB-8065TM)
  • Ung thư phổi người LU-1 (HTB-57TM)
  • Ung thư vú người MCF-7 (HTB-22TM)

Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng DMEM hoặc MEME bổ sung 7–10% huyết thanh phôi bò (FBS).

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày tính cấp thiết, bối cảnh nghiên cứu của Dự án Hợp tác Quốc tế Việt – Pháp, mục tiêu, 3 nội dung nghiên cứu chính và ý nghĩa khoa học của đề tài.

Chương 1: Tổng quan về chi Pilea và Boehmeria họ Gai (Urticaceae) và chi Anacolosa họ Dương đầu (Olacaceae)

Tổng hợp có hệ thống các dữ liệu thực vật học, công dụng dân gian, thành phần hóa thực vật và hoạt tính sinh học của 3 chi Pilea, Boehmeria, Anacolosa. Chương này thiết lập danh mục hóa thực vật chi tiết với 83 hợp chất từ chi Pilea, 42 hợp chất từ chi Boehmeria, và 9 hợp chất từ chi Anacolosa, chỉ ra khoảng trống nghiên cứu tuyệt đối đối với hai loài Pilea aff. martinii và Anacolosa poilanei.

Chi thực vật Số loài trên thế giới Số loài tại Việt Nam Các nhóm hợp chất chính đã công bố trước luận án
Pilea 600–715 18 Terpenoid (humulane, oleanane), Flavonoid, Lignan, Dị vòng nitơ/Alkaloid đơn giản, Phenolic
Boehmeria 100 10 Triterpenoid, Flavonoid, Alkaloid (phenanthroquinolizidine, phenanthroindolizidine), Phenolic
Anacolosa 15–22 4 Acid acetylenic (anacolosin...), Triterpenoid (lupenone, β-amyrone, acid 3-acetyleuritolic), Cyanogenic glycoside

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết thông tin mẫu thực vật, tọa độ, thời gian thu hái, các quy trình chiết mẫu, phương pháp sắc ký phân lập (TLC, PTLC, CC, Sephadex LH-20), thông số kỹ thuật của các hệ thiết bị phổ nghiệm (FTIR, ESI-MS, ESI-HRMS, NMR 500 MHz, CD Chirascan, Gaussian 09), cùng quy trình thử hoạt tính gây độc tế bào MTT trên 4 dòng tế bào ung thư KB, Hep-G2, LU-1, MCF-7.

Chương 3: Phân lập các hợp chất từ hai loài Pilea aff. martinii và Boehmeria holosericea, họ Urticaceae và loài Anacolosa poilanei, họ Olacaceae

Mô tả toàn bộ quá trình thực nghiệm xử lý mẫu, sơ đồ chiết tách và các phân đoạn sắc ký:

  • Từ lá loài Pilea aff. martinii: Xử lý cặn chiết tổng và phân lập thành công 9 hợp chất ký hiệu từ PM1 đến PM9.
  • Từ quả loài Boehmeria holosericea Blume: Xử lý phân đoạn alkaloid tổng và phân lập 5 hợp chất ký hiệu từ BH1 đến BH5.
  • Từ vỏ loài Anacolosa poilanei Gagnep.: Xử lý cặn chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất ký hiệu từ AP1 đến AP7. Chương 3 ghi nhận đầy đủ hằng số vật lý (điểm nóng chảy, độ quay cực) và toàn bộ số liệu phổ (IR, MS, HRMS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY/ROESY, phổ CD) cho từng hợp chất phân lập được.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Biện luận chi tiết cấu trúc hóa học và cấu hình không gian của 21 hợp chất phân lập được từ 3 loài thực vật nghiên cứu, kết hợp phân tích hoạt tính gây độc tế bào:

1. Thành phần hóa học lá loài Pilea aff. martinii

Xác định cấu trúc của 9 hợp chất alkaloid và dị vòng nitơ, bao gồm 5 hợp chất mới:

  • PM1: Pileamartine A (hợp chất mới) – Cấu hình tuyệt đối được xác định bằng cách đối chiếu phổ CD thực nghiệm và phổ CD tính toán lượng tử (Gaussian 09).
  • PM2: Pileamartine B (hợp chất mới).
  • PM3: 1,3,6,6-tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydroisoquinolin-8-one.
  • PM4: Julandine (alkaloid khung phenanthroquinolizidine).
  • PM5: Pileamartine C (hợp chất mới).
  • PM6: Pileamartine D (hợp chất mới).
  • PM7: Cryptopleurine (alkaloid khung phenanthroquinolizidine).
  • PM8: Pileamartine E (hợp chất mới).
  • PM9: Quinine.

Luận án cũng đề xuất sơ đồ giả định quá trình sinh tổng hợp hợp chất pileamartine A (PM1) và các alkaloid liên quan trong cây Pilea aff. martinii.

2. Thành phần hóa học quả loài Boehmeria holosericea Blume

Xác định cấu trúc của 5 hợp chất:

  • BH1: Ruspolinone (alkaloid pyrrolidine).
  • BH2: Benzyl β-D-glucoside.
  • BH3: Adenine.
  • BH4: Adenosine.
  • BH5: Uridine.

3. Thành phần hóa học vỏ loài Anacolosa poilanei Gagnep.

Xác định cấu trúc của các hợp chất triterpenoid, sterol và flavonoid, bao gồm 2 hợp chất triterpenoid mới:

  • AP1: Acid 3α-p-coumaroyl-D:A-friedo-oleanan-27-oic (hợp chất mới).
  • AP2: Acid trichadenic A.
  • AP3: Acid trichadonic.
  • AP4: Acid 3α-(3,4-dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedo-oleanan-27-oic (hợp chất mới).
  • AP5: Dẫn xuất triterpenoid friedo-oleanane.
  • AP6: β-Sitosterol.
  • AP7: Amentoflavon (biflavonoid).
Ký hiệu Tên hợp chất Loại hợp chất Loài thực vật Tình trạng
PM1 Pileamartine A Alkaloid Pilea aff. martinii Hợp chất mới
PM2 Pileamartine B Alkaloid Pilea aff. martinii Hợp chất mới
PM3 1,3,6,6-tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydroisoquinolin-8-one Isoquinoline alkaloid Pilea aff. martinii Đã biết
PM4 Julandine Phenanthroquinolizidine Pilea aff. martinii Đã biết
PM5 Pileamartine C Alkaloid Pilea aff. martinii Hợp chất mới
PM6 Pileamartine D Alkaloid Pilea aff. martinii Hợp chất mới
PM7 Cryptopleurine Phenanthroquinolizidine Pilea aff. martinii Đã biết
PM8 Pileamartine E Alkaloid Pilea aff. martinii Hợp chất mới
PM9 Quinine Alkaloid Pilea aff. martinii Đã biết
BH1 Ruspolinone Pyrrolidine alkaloid Boehmeria holosericea Đã biết
BH2 Benzyl β-D-glucoside Phenolic glycoside Boehmeria holosericea Đã biết
BH3 Adenine Base purine Boehmeria holosericea Đã biết
BH4 Adenosine Nucleoside Boehmeria holosericea Đã biết
BH5 Uridine Nucleoside Boehmeria holosericea Đã biết
AP1 Acid 3α-p-coumaroyl-D:A-friedo-oleanan-27-oic Triterpenoid este Anacolosa poilanei Hợp chất mới
AP2 Acid trichadenic A Triterpenoid Anacolosa poilanei Đã biết
AP3 Acid trichadonic Triterpenoid Anacolosa poilanei Đã biết
AP4 Acid 3α-(3,4-dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedo-oleanan-27-oic Triterpenoid este Anacolosa poilanei Hợp chất mới
AP5 Dẫn xuất friedo-oleanane Triterpenoid este Anacolosa poilanei Đã biết/mới liên quan
AP6 β-Sitosterol Phytosterol Anacolosa poilanei Đã biết
AP7 Amentoflavon Biflavonoid Anacolosa poilanei Đã biết

4. Kết quả thử hoạt tính sinh học

Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất phân lập từ lá loài Pilea aff. martinii và vỏ loài Anacolosa poilanei trên 4 dòng tế bào ung thư người (KB, Hep-G2, LU-1, MCF-7), xác định các giá trị IC50 tương ứng.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về khoa học và lý luận

  1. Khám phá hóa thực vật lần đầu tiên trên thế giới đối với hai loài thực vật: Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lá loài Pilea aff. martinii và vỏ cây Anacolosa poilanei Gagnep.
  2. Bổ sung dữ liệu hóa thực vật cho loài Boehmeria holosericea: Lần đầu tiên phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất thứ cấp từ quả loài Boehmeria holosericea Blume thu hái tại Việt Nam.
  3. Phát hiện 7 hợp chất mới:
    • 5 hợp chất alkaloid mới từ lá Pilea aff. martinii: pileamartine A (PM1), pileamartine B (PM2), pileamartine C (PM5), pileamartine D (PM6), pileamartine E (PM8).
    • 2 hợp chất triterpenoid friedo-oleanane este hóa mới từ vỏ cây Anacolosa poilanei: acid 3α-p-coumaroyl-D:A-friedo-oleanan-27-oic (AP1) và acid 3α-(3,4-dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedo-oleanan-27-oic (AP4).
  4. Đóng góp về phương pháp xác định cấu hình: Ứng dụng thành công phương pháp tính toán hóa lượng tử phổ lưỡng sắc tròn (CD) bằng phần mềm Gaussian 09 kết hợp đối chiếu phổ CD thực nghiệm để xác định cấu hình tuyệt đối cho các alkaloid mới phân lập.
  5. Đề xuất sinh tổng hợp: Đưa ra sơ đồ giả định về con đường sinh tổng hợp pileamartine A (PM1) và các alkaloid liên quan trong chi Pilea.

Đóng góp thực tiễn và định hướng ứng dụng

  1. Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính gây độc tế bào của các alkaloid và triterpenoid phân lập được trên 4 dòng tế bào ung thư người (KB, Hep-G2, LU-1, MCF-7), làm cơ sở cho các định hướng nghiên cứu phát triển hoạt chất chống ung thư.
  2. Bổ sung cơ sở dữ liệu khoa học về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của nguồn tài nguyên thực vật bản địa thuộc họ Gai (Urticaceae) và họ Dương đầu (Olacaceae) tại Việt Nam.

Kiến nghị

  • Tiếp tục mở rộng nghiên cứu thành phần hóa học ở các bộ phận khác (thân, rễ) của các loài thực vật trên.
  • Tiến hành các thử nghiệm chuyên sâu về cơ chế phân tử gây độc tế bào và khảo sát độc tính in vivo đối với các hợp chất có hoạt tính cao.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Đối tượng nghiên cứu mới chỉ tập trung vào một bộ phận xác định của từng loài: lá của Pilea aff. martinii, quả của Boehmeria holosericea, và vỏ thân của Anacolosa poilanei.
  • Địa bàn thu hái mẫu mang tính cục bộ tại một số vùng núi phía Bắc Việt Nam (Hà Giang, Lạng Sơn, Lào Cai) tại một thời điểm nhất định, chưa phản ánh biến thiên thành phần hóa học theo mùa hoặc theo các vùng sinh thái khác nhau.
  • Thử nghiệm hoạt tính sinh học chỉ mới thực hiện khảo sát gây độc tế bào in vitro theo phương pháp MTT trên 4 dòng tế bào ung thư người, chưa tiến hành trên các mô hình tế bào bình thường để đánh giá độ chọn lọc hoặc thử nghiệm in vivo.

Hướng nghiên cứu tiếp

  1. Khảo sát thành phần hóa học của các bộ phận còn lại (rễ, thân gỗ, cành lá, hoa) của 3 loài thực vật nghiên cứu.
  2. Đi sâu làm rõ cơ chế tác động ở mức độ sinh học phân tử (như sự ức chế chu kỳ tế bào, cảm ứng chết theo chương trình apoptosis, ức chế tổng hợp protein tại ribosome hoặc ức chế biểu hiện gen dưới sự kiểm soát của HRE) của các alkaloid khung phenanthroquinolizidine và triterpenoid este hóa.
  3. Nghiên cứu tổng hợp toàn phần hoặc bán tổng hợp các dẫn xuất của pileamartine và các acid friedo-oleanane nhằm tối ưu hóa hoạt tính sinh học và khảo sát độc tính trên mô hình động vật.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa Dược và Thực vật học: Luận án là tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình chiết xuất, phân lập alkaloid và triterpenoid phức tạp; phương pháp giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D; và quy trình kết hợp phổ CD thực nghiệm với tính toán lượng tử (Gaussian 09) để xác định cấu hình tuyệt đối.
  • Đối với các nhà nghiên cứu dược lý và sàng lọc thuốc: Luận án cung cấp bộ số liệu thực nghiệm về độc tính tế bào của các hợp chất tự nhiên trên các dòng ung thư người KB, Hep-G2, LU-1, MCF-7.
  • Phần đáng tham khảo nhất trong tài liệu:
    • Mục 2.4 và 2.5: Phương pháp luận xác định cấu hình tuyệt đối bằng phổ CD tính toán và quy trình thử nghiệm MTT.
    • Mục 4.1 và 4.3: Biện luận cấu trúc chi tiết của các hợp chất mới dòng pileamartine (PM1, PM2, PM5, PM6, PM8) và các triterpenoid este hóa (AP1, AP4).

Câu hỏi thường gặp

1. Ba loài thực vật được nghiên cứu trong luận án được thu hái tại các địa phương nào và có mã số tiêu bản là gì?

  • Lá cây Pilea aff. martinii (họ Urticaceae) thu hái tại Quản Bạ, tỉnh Hà Giang vào tháng 06/2008, tiêu bản ký hiệu VN-1909.
  • Quả cây Boehmeria holosericea Blume (họ Urticaceae) thu hái tại Bình Gia, tỉnh Lạng Sơn vào tháng 10/2004, tiêu bản ký hiệu VN-1392.
  • Vỏ cây Anacolosa poilanei Gagnep. (họ Olacaceae) thu hái tại Sa Pa, tỉnh Lào Cai vào tháng 06/2003, tiêu bản ký hiệu VN-1124. Tất cả các mẫu đều được TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam) giám định tên khoa học và lưu giữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.

2. Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc bao nhiêu hợp chất mới?

Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 7 hợp chất mới:

  • 5 hợp chất alkaloid mới từ lá loài Pilea aff. martinii: pileamartine A (PM1), pileamartine B (PM2), pileamartine C (PM5), pileamartine D (PM6), pileamartine E (PM8).
  • 2 hợp chất triterpenoid mới từ vỏ cây Anacolosa poilanei: acid 3α-p-coumaroyl-D:A-friedo-oleanan-27-oic (AP1) và acid 3α-(3,4-dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedo-oleanan-27-oic (AP4).

3. Cấu hình tuyệt đối của các hợp chất mới được xác định bằng phương pháp nào?

Cấu hình tuyệt đối của các hợp chất mới (tiêu biểu như các pileamartine) được khẳng định bằng phương pháp so sánh phổ lưỡng sắc tròn (CD) thực nghiệm đo trên máy Chirascan với phổ CD tính toán lý thuyết dựa trên mô hình tính toán hóa lượng tử bằng phần mềm Gaussian 09.

4. Hoạt tính gây độc tế bào được đánh giá bằng phương pháp nào và trên những dòng tế bào nào?

Hoạt tính gây độc tế bào được đánh giá bằng phương pháp MTT (Tim Mosmann, 1983) đo mật độ quang học ở bước sóng 540 nm để xác định giá trị IC50. Thử nghiệm được tiến hành trên 4 dòng tế bào ung thư người có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ (ATCC):

  • Ung thư biểu mô người KB (CCL-17TM)
  • Ung thư gan người Hep-G2 (HB-8065TM)
  • Ung thư phổi người LU-1 (HTB-57TM)
  • Ung thư vú người MCF-7 (HTB-22TM)

5. Nghiên cứu thành phần hóa học loài Pilea aff. martinii có ý nghĩa gì đối với việc phân loại hóa học chi Pilea?

Trước luận án này, các công bố trên thế giới cho thấy chi Pilea chỉ chứa một số ít alkaloid có cấu trúc rất đơn giản (như dẫn xuất indole, uracil, nicotinamide ở loài Pilea cavaleriei subsp. cavaleriei). Luận án đã lần đầu tiên phát hiện và xác định cấu trúc của hệ alkaloid phức tạp gồm các dẫn xuất tetrahydroisoquinoline và phenanthroquinolizidine (pileamartine A–E, julandine, cryptopleurine, quinine) trong loài Pilea aff. martinii, mở rộng đáng kể dữ liệu hóa thực vật và phân loại hóa học cho chi Pilea.

Kết luận

Luận án đã hoàn thành nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của 3 loài thực vật gồm Pilea aff. martinii, Boehmeria holosericea Blume (họ Urticaceae) và Anacolosa poilanei Gagnep. (họ Olacaceae). Tổng cộng 21 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc, trong đó phát hiện 7 hợp chất mới (5 alkaloid mới dòng pileamartine và 2 triterpenoid este hóa mới). Cấu hình tuyệt đối của các hợp chất mới được làm rõ thông qua việc kết hợp phổ CD thực nghiệm và tính toán lượng tử Gaussian 09. Các kết quả thử nghiệm sinh học trên 4 dòng tế bào ung thư người (KB, Hep-G2, LU-1, MCF-7) cung cấp luận cứ khoa học quan trọng cho việc định hướng nghiên cứu và sử dụng nguồn dược liệu thiên nhiên tại Việt Nam.