Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Việt Nam là quốc gia nhiệt đới sở hữu nguồn tài nguyên thực vật phong phú với nhiều loài cây thuốc có giá trị dược liệu cao. Việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài cây thuốc cổ truyền đóng vai trò quan trọng nhằm cung cấp các căn cứ khoa học sáng tỏ kinh nghiệm điều trị dân gian, đồng thời định hướng tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm.

Trên thế giới, các loài thực vật thuộc chi Tử châu (Callicarpa L., họ Cỏ roi ngựa - Verbenaceae) đã được khảo sát nhiều về thực vật học, dược lý và hóa thực vật. Các nghiên cứu quốc tế đã ghi nhận sự có mặt của nhiều nhóm hợp chất, đặc biệt là diterpenoid và triterpenoid thể hiện hoạt tính sinh học đa dạng như kháng viêm, kháng khuẩn, bảo vệ thần kinh, chống oxy hóa và ức chế tế bào ung thư. Tuy nhiên, tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu hệ thống về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Callicarpa còn rất hạn chế, chủ yếu dừng lại ở việc khảo sát sơ bộ hoạt tính diệt ấu trùng muỗi của tinh dầu. Do đó, luận án tiến sĩ với đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Nàng nàng (Callicarpa candicans) và loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla) ở Việt Nam" được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu này.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 03 mục tiêu nghiên cứu cụ thể được đánh số như sau:

  1. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ lá loài Nàng nàng (Callicarpa candicans) và Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla) thu hái ở Việt Nam.
  2. Nghiên cứu thành phần hóa học trong tinh dầu loài Nàng nàng (Callicarpa candicans) và loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla).
  3. Đánh giá hoạt tính gây độc trên một số dòng tế bào ung thư: gan (Hep-G2), biểu mô phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) của các hợp chất sạch phân lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lá, thân cành, hoa và quả của hai loài thực vật gồm loài Nàng nàng (Callicarpa candicans (Burm. f.)) và loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla Vahl), thuộc chi Callicarpa, họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae).
  • Phạm vi không gian (địa bàn thu mẫu): Các mẫu thực vật được thu hái tại huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên, Việt Nam. Mẫu tiêu bản thực vật đã được TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) định loại tên khoa học và lưu giữ với các số hiệu: CA20171001.HN (loài Nàng nàng) và CA20171002.HN (loài Tử châu lá to).
  • Phạm vi thời gian: Mẫu nghiên cứu được thu hái thực địa vào tháng 10 năm 2017.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu thực vật học và phân loại

Theo tổng quan tài liệu trong luận án, họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) tại Việt Nam được tác giả Vũ Xuân Phương (2007) xây dựng khóa định loại và mô tả gồm 26 chi với khoảng 140 loài và 21 thứ. Đối với riêng chi Callicarpa, các tài liệu phân loại có số lượng thống kê khác nhau:

  • Tác giả Võ Văn Chi thống kê chi Callicarpa tại Việt Nam có 14 loài.
  • Tác giả Phạm Hoàng Hộ thống kê chi Callicarpa có 26 loài.
  • Các nhà thực vật học thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật thống kê có 21 loài, phân bố rải rác từ Bắc vào Nam (Tuyên Quang, Lạng Sơn, Sơn La, Bắc Kạn, Phú Thọ, Bắc Giang, Thái Nguyên, Ba Vì, Nghệ An, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Kon Tum, Đắk Lắk, Gia Lai, Bình Dương, Đồng Nai).

Tổng quan về sử dụng trong y học dân gian

Nhiều loài trong chi Callicarpa được ghi nhận sử dụng trong y học cổ truyền tại nhiều quốc gia châu Á, Bắc Mỹ và châu Đại Dương. Bảng tổng hợp dưới đây tóm tắt kinh nghiệm sử dụng một số loài tiêu biểu theo ghi nhận của luận án:

Tên loài Bộ phận sử dụng Quốc gia / Vùng lãnh thổ Công dụng dân gian được ghi nhận
C. americana Vỏ, lá, rễ, cành, quả Bắc Mỹ / Mỹ Sốt, sốt rét, thấp khớp, phù thủng, kiết lỵ, đau bụng, ung thư da
C. arborea Vỏ, vỏ quả Ấn Độ, Nepal Bệnh ngoài da, giảm sốt, khó tiêu
C. bodinieri Lá Trung Quốc Trị vết thương
C. cana Toàn cây Papua New Guinea Chống đông
C. candicans Lá Quần đảo Palau, Malaysia Ngộ độc cá, điều hòa kinh nguyệt
C. cathayana Lá Trung Quốc Trị vết thương
C. flavida Vỏ Philippines Đau răng
C. formosana Toàn cây, phần trên mặt đất Đài Loan Thấp khớp, nhiễm trùng răng miệng, rối loạn dạ dày và ruột
C. japonica Lá Nhật Bản Chất độc cá
C. lanata Lá, rễ tươi Ấn Độ, Bangladesh Giun sán, sốt, sốt rét, nhai như lá trầu
C. macrophylla Rễ, lá, quả tươi, hạt Ấn Độ, Nepal, Trung Quốc Sốt, đau đầu, thấp khớp, ho, loét miệng, rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, kiết lỵ, bỏng
C. nudiflora Phần trên mặt đất Trung Quốc Cầm máu, kháng viêm
C. pilosissima Phần trên mặt đất Đài Loan / Trung Quốc Bệnh lao
C. rubella Vỏ, lá, thân Ấn Độ, Trung Quốc Khối u ruột già, vết thương, bỏng

Tổng quan thành phần hóa học thực vật chi Callicarpa

Nghiên cứu quốc tế đã phân lập và xác định hơn 200 hợp chất từ chi Callicarpa, thuộc các nhóm chính:

  • Monoterpenoid: Hợp chất iridoid như nudifloside, linearoside từ C. nudiflora có hoạt tính ức chế tế bào ung thư máu K562; các chất 4-terpineol, 6-O-trans-cinnamoylphlorigidoside B từ C. formosana.
  • Sesquiterpenoid: Phân lập ở nhiều loài như C. japonica, C. integerrima, C. macrophylla, C. pedunculata; các chất điển hình gồm β-caryophyllene, aromadendrene II, 7-epi-α-selinene, dendrolasin.
  • Diterpenoid: Rất đa dạng với các khung abietane, phyllocladane, clerodane, labdane, totarane, pimarane và isopimarane (như pedunculatic acid A, B; kochianic acid A, B; macrophypene A; hardwickiic acid; calliterpenone-17-acetate). Hợp chất 12-deoxy-11,12-dihydro-seco-hinokiol methyl ester từ C. pilosissima thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis H37Rv.
  • Triterpenoid: Gồm các khung ursane, oleane và lupane (như ursolic acid, oleanolic acid, pomolic acid, myrianthic acid, sericoside, betulinic acid).
  • Flavonoid: Khung flavon, flavonol và dạng glycoside (như penduletin, apigenin, luteolin, cynaroside, genkwanin), thể hiện các hoạt tính giảm đau, cầm máu, kháng viêm.
  • Phenylethanoid và phenylpropanoid: Các hợp chất glycoside như acteoside, forsythoside B, sesamin có tác dụng bảo vệ thần kinh, chống oxy hóa, kháng viêm.

Tình hình nghiên cứu trong nước và khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Ở Việt Nam, các nghiên cứu trước đây chỉ khảo sát thành phần tinh dầu lá của các loài Callicarpa thu hái tại miền Trung bằng phương pháp sắc ký khí - khối phổ (GC-MS) và thử nghiệm diệt bọ gậy muỗi Aedes aegypti, trong đó tinh dầu C. candicans thể hiện giá trị $LC_{50}$ sau 48 giờ là 2,1 và 3,8 µg/ml. Luận án lựa chọn thực hiện nghiên cứu chuyên sâu và có hệ thống đầu tiên về cả thành phần tinh dầu, các nhóm hoạt chất không bay hơi và hoạt tính sinh học (gây độc tế bào ung thư in vitro, kháng vi sinh vật kiểm định) của hai loài C. candicans và C. macrophylla thu hái tại Thái Nguyên.


Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung phân tích và quy trình xử lý mẫu

Luận án áp dụng các nguyên lý hóa học các hợp chất tự nhiên thực nghiệm để chiết xuất, tách phân đoạn, phân lập và xác định cấu trúc phân tử:

  • Xử lý và chiết mẫu: Mẫu lá sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 60 °C đến khối lượng không đổi, sau đó nghiền nhỏ. Chiết ngâm mẫu với methanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết tổng được cô cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ dưới 50 °C để thu cặn cô tổng. Cặn cô được phân tán vào nước và chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexane và ethyl acetate để thu các cặn chiết tương ứng.

Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học

  • Phương pháp phân lập:
    • Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng tráng sẵn silica gel $60\text{ F}{254}$ ($0,25\text{ mm}$, Merck) và bản pha đảo $\text{RP-18 F}{254\text{S}}$ ($0,25\text{ mm}$, Merck). Hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc phun thuốc thử vanilin – $\text{H}_2\text{SO}_4\text{ 5%}$ trong methanol và sấy nóng.
    • Sắc ký cột pha thuận (CC) sử dụng chất nhồi silica gel 60, cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm (230 – 400 mesh, Merck).
    • Sắc ký rây phân tử với pha tĩnh Sephadex LH-20 (Merck).
    • Sắc ký cột pha đảo sử dụng YMC RP-18 cỡ hạt 30 – 50 µm (Fujisilica Chemical Ltd.).
  • Phương pháp xác định cấu trúc:
    • Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) đo trên máy Agilent 1200 TRAP.
    • Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) đo trên máy FT-ICR-Mass spectrometer tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đo trên máy Bruker Avance 500 MHz, sử dụng chất chuẩn nội tetramethylsilane (TMS), các dung môi $\text{DMSO-}d_6$, $\text{CD}_3\text{OD}$ và $\text{CDCl}_3$. Thực hiện phổ 1 chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT) và 2 chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY).
    • Điểm nóng chảy xác định trên thiết bị Kofler micro-hotstage.
    • Độ quay cực ($[\alpha]_D^t$) đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY.

Phương pháp chiết xuất và phân tích tinh dầu

  • Chiết xuất tinh dầu:
    • Phương pháp 1: Chưng cất lôi cuốn hơi nước bằng bộ cất tinh dầu vi lượng (thời gian 3–4 giờ, kiểm soát nhiệt độ nước ngưng dưới 40 °C).
    • Phương pháp 2: Chưng cất lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng (công suất lò 450 W, thời gian 60 phút).
    • Tinh dầu thu được được làm khan bằng $\text{Na}_2\text{SO}_4$ trong 1 giờ và bảo quản ở 4 °C trong lọ thủy tinh tối màu.
  • Phân tích thành phần tinh dầu (GC-MS): Thực hiện trên máy GC Agilent Technologies HP7890A kết nối đầu dò khối phổ HP5975C; cột mao quản HP-5MS ($60\text{ m} \times 0,25\text{ mm} \times 0,25\text{ µm}$). Nhiệt độ buồng tiêm 250 °C, buồng chuyển khối phổ 280 °C. Chương trình nhiệt: bắt đầu ở 60 °C, tăng lên 240 °C với tốc độ 4 °C/phút. Khí mang Heli với tốc độ dòng 1 ml/phút. Thể tích tiêm 1 µl. Điện áp ion hóa 70 eV, dòng phát xạ 40 mA, dải quét khối lượng $m/z\text{ 35–450}$.

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

  • Phương pháp đánh giá độc tính tế bào bằng Sulforhodamine B (SRB):
    • Thực hiện theo quy trình của Skehan & cs. (1990) và Likhiwitayawuid & cs. (1993) trên 03 dòng tế bào ung thư người: Hep-G2 (ung thư gan), Lu-1 (ung thư biểu mô phổi), MCF-7 (ung thư vú).
    • Nuôi cấy trong môi trường DMEM hoặc MEME bổ sung $10%\text{ BCS}$, L-Glutamine, kháng sinh. Thử nghiệm trên đĩa 96 giếng ở các dải nồng độ 100; 20; 4; 0,8 µg/ml. Chất chuẩn đối chứng dương là Ellipticine; đối chứng âm là DMSO 10%. Đo mật độ quang (OD) tại bước sóng 515 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad).
    • Đánh giá tỷ lệ sống sót của tế bào (CS%) và tính giá trị $\text{IC}{50}$ bằng chương trình TableCurve. Mẫu thử có $\text{IC}{50} < 20\text{ µg/ml}$ (đối với cặn chiết thô) hoặc $\text{IC}_{50} \le 4\text{ µg/ml}$ (đối với chất tinh khiết) được xác định là có hoạt tính.
  • Phương pháp đánh giá độc tính tế bào bằng MTT:
    • Thử nghiệm trên các dòng tế bào: Hep-G2 (ung thư gan), A549 (ung thư biểu mô phổi), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt). Mật độ tế bào $1,5 \times 10^5\text{ tế bào/giếng}$. Chất chuẩn đối chứng dương là Ellipticine hoặc Paclitaxel (Taxol). Đo mật độ quang ở bước sóng $\lambda = 540/720\text{ nm}$ trên thiết bị Infinite F50 (Tecan, Thụy Sỹ).
  • Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định:
    • Thực hiện theo phương pháp pha loãng trên phiến vi lượng 96 giếng của McKane & Kandel (1996) trên 08 chủng kiểm định:
      • Vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923).
      • Vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtilis (ATCC 11774), Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC 11632).
      • Nấm sợi: Aspergillus niger (439), Fusarium oxysporum (M42).
      • Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754), Saccharomyces cerevisiae (SH 20).
      • Chất chuẩn đối chứng dương: Streptomycin (cho vi khuẩn Gram (+)), Tetracyclin (cho vi khuẩn Gram (-)), Nystatin hoặc Amphotericin B (cho nấm sợi và nấm men). Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày tổng quan về tính cấp thiết của việc nghiên cứu nguồn hoạt chất sinh học tự nhiên từ thực vật Việt Nam, cơ sở lựa chọn đề tài nghiên cứu trên hai loài Callicarpa candicans và Callicarpa macrophylla, cùng 03 mục tiêu nghiên cứu cụ thể của luận án.

Chương 1. Tổng quan

Hệ thống hóa toàn diện các dữ liệu khoa học đã công bố về:

  • Đặc điểm thực vật học và vị trí phân loại của chi Callicarpa thuộc họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) tại Việt Nam và trên thế giới.
  • Kinh nghiệm và công dụng của các loài Callicarpa trong y học dân gian tại các nước châu Á, Bắc Mỹ, châu Đại Dương.
  • Thành phần hóa thực vật đã được nghiên cứu trên thế giới với hơn 200 hợp chất thuộc các lớp monoterpenoid, sesquiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid, flavonoid, phenylethanoid và phenylpropanoid.
  • Tác dụng dược lý và hoạt tính sinh học đã chứng minh: kháng viêm và điều hòa miễn dịch, cầm máu, bảo vệ thần kinh và chống mất trí nhớ, hoạt tính chống trực khuẩn lao, giảm đau, chống oxy hóa, kháng khuẩn và diệt côn trùng.
  • Tổng quan các công trình nghiên cứu trong nước và định vị nội dung nghiên cứu của luận án.

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết về:

  • Nguồn gốc mẫu thực vật (lá, thân cành, hoa, quả của C. candicans và C. macrophylla thu hái tại huyện Đại Từ, Thái Nguyên vào tháng 10/2017).
  • Quy trình xử lý mẫu, ngâm chiết siêu âm và chiết phân bố lỏng - lỏng thu nhận các cặn chiết n-hexane, ethyl acetate và nước.
  • Kỹ thuật phân lập hợp chất bằng sắc ký TLC, cột silica gel, Sephadex LH-20, pha đảo RP-18.
  • Kỹ thuật xác định cấu trúc phân tử qua phổ HR-ESI-MS, ESI-MS, phổ NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY), điểm nóng chảy và độ quay cực.
  • Quy trình chưng cất tinh dầu (chưng cất vi lượng và vi sóng) cùng thông số phân tích sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS.
  • Quy trình thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro theo phương pháp SRB và MTT trên các dòng tế bào Hep-G2, Lu-1, MCF-7, PC-3, A549; quy trình thử nghiệm kháng vi sinh vật kiểm định xác định giá trị MIC trên 8 chủng vi khuẩn, nấm sợi và nấm men.

Chương 3. Thực nghiệm

Mô tả chi tiết các bước tiến hành thực nghiệm chiết xuất và phân lập hoạt chất từ mẫu thực vật:

  • Xử lý lá Tử châu lá to (C. macrophylla): Từ 3500 g lá khô sấy ở 60 °C, ngâm chiết 5 lần với methanol trong bể siêu âm ở nhiệt độ phòng. Cất loại dung môi thu được 195 g cặn methanol tổng. Cặn tổng được phân tán vào nước và chiết phân đoạn thu được: 45 g cặn n-hexane (CMH), 25 g cặn ethyl acetate (CME) và 110 g cặn nước (CMW).
  • Phân lập từ cặn n-hexane (CMH): Lấy 40 g cặn CMH chạy sắc ký cột silica gel với gradient dung môi n-hexane – ethyl acetate (100:0 → 0:100) thu được 10 phân đoạn ($\text{CMH}1$ – $\text{CMH}{10}$).
    • Từ phân đoạn $\text{CMH}1$ (2,8 g), qua cột silica gel và tinh chế trên Sephadex LH-20 rửa giải bằng methanol kết tinh trong acetone thu được hợp chất mới callimacrophylla B (M8) (10,1 mg; bột màu trắng, điểm nóng chảy 162 °C, $R_f = 0,69$ trong hệ hexane/EtOAc 4:1, HR-ESI-MS cho pic ion phân tử $m/z\text{ 499,3786 }[\text{M}+\text{H}]^+$, công thức phân tử $\text{C}{32}\text{H}_{51}\text{O}_4$).
    • Từ phân đoạn $\text{CMH}_2$ (3,2 g), phân tách qua cột silica gel thu được hợp chất 3β-hydroxyolean-12-ene (M2) (10,3 mg; tinh thể màu trắng, $R_f = 0,53$).
    • Từ phân đoạn $\text{CMH}_4$ (1,1 g), phân tách qua cột silica gel và kết tinh trong acetone thu được β-amyrin (M3) (12,7 mg; tinh thể màu vàng nhạt, $R_f = 0,46$).
    • Từ phân đoạn $\text{CMH}_5$ (2,8 g), phân tách qua cột silica gel thu được β-sitosterol (M4) (20,0 mg; bột màu trắng, điểm nóng chảy 138–140 °C, $R_f = 0,33$) và spinasterol (M5) (11,2 mg; tinh thể màu trắng, $R_f = 0,30$).
    • Từ phân đoạn $\text{CMH}_6$ (1,5 g), phân tách qua cột silica gel và kết tinh lại thu được ursolic acid (M6) (15,5 mg; bột màu trắng, điểm nóng chảy 283–285 °C, $R_f = 0,53$) và oleanolic acid (M10) (8,5 mg; bột màu trắng, điểm nóng chảy 306–308 °C, $R_f = 0,54$).
  • Phân lập từ cặn ethyl acetate (CME): Lấy 20 g cặn CME sắc ký cột silica gel rửa giải bằng hệ $\text{CH}_2\text{Cl}_2\text{ : MeOH}$ (100:1 → 1:100) thu được 6 phân đoạn ($\text{CME}_1$ – $\text{CME}_6$).
    • Phân đoạn $\text{CME}_1$ (1,5 g) qua cột pha đảo RP-18 rửa giải bằng $\text{MeOH – H}_2\text{O}$ (3:7) và kết tinh lại trong acetone thu được hợp chất diterpenoid ent-1β-acetoxy-7α,14β-dihydroxykaur-16-en-15-one (M7) (12,5 mg; tinh thể màu trắng, $R_f = 0,63$).
    • Phân đoạn $\text{CME}_2$ (2,0 g) qua cột silica gel thu được daucosterol (M9) (16,5 mg).
    • Phân đoạn $\text{CME}_3$ (1,2 g) thu được hợp chất mới callimacrophylla A (M1) (10,8 mg).
    • Phân đoạn $\text{CME}_5$ (1,6 g) thu được hợp chất M11 (15,0 mg).
  • Phân lập từ lá cây Nàng nàng (C. candicans): Thực hiện quy trình chiết xuất và phân lập tương tự thu nhận các hợp chất diterpenoid seco-hinokiol (C5), methyl seco-hinokiol (C6); triterpenoid 2α-hydroxy-ursolic acid (C7), 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8); flavonoid 5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon (C1), 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3), genkwanin (C9), cynaroside (C10).

Chương 4. Kết quả và thảo luận

Chương này tập trung trình bày và biện luận chi tiết các kết quả nghiên cứu:

  • Thành phần hóa học tinh dầu: Xác định các hợp chất bay hơi trong tinh dầu lá, hoa loài Nàng nàng (C. candicans) và tinh dầu lá loài Tử châu lá to (C. macrophylla) thu được từ hai phương pháp chưng cất thông qua dữ liệu sắc ký GC-MS.
  • Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập: Biện luận chi tiết cấu trúc phân tử dựa trên tương tác phổ NMR và HR-ESI-MS của:
    • Nhóm diterpenoid: callimacrophylla A (M1 - hợp chất mới), ent-1β-acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7), seco-hinokiol (C5), methyl seco-hinokiol (C6).
    • Nhóm triterpenoid: callimacrophylla B (M8 - hợp chất mới), 3β-hydroxyolean-12-ene (M2), β-amyrin (M3), oleanolic acid (M10), ursolic acid (M6), 2α-hydroxy-ursolic acid (C7), 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8).
    • Nhóm steroid: spinasterol (M5), β-sitosterol (M4), daucosterol (M9).
    • Nhóm flavonoid: 5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon (C1), 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3), genkwanin (C9), cynaroside (C10).
  • Đánh giá hoạt tính sinh học:
    • Hoạt tính sinh học của tinh dầu từ lá Nàng nàng và Tử châu lá to.
    • Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các cao chiết thô và các phân đoạn từ hai loài trên các dòng tế bào ung thư.
    • Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất sạch phân lập được đối với các dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), ung thư biểu mô phổi (Lu-1, A549), ung thư vú (MCF-7) và ung thư tuyến tiền liệt (PC-3).

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học

  1. Phát hiện các hợp chất mới: Luận án đã phân lập và lần đầu tiên xác định cấu trúc của 02 hợp chất mới từ tự nhiên là:
    • Callimacrophylla A (M1): Hợp chất mới thuộc nhóm diterpenoid phân lập từ cặn ethyl acetate của lá loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla).
    • Callimacrophylla B (M8): Hợp chất mới thuộc nhóm triterpenoid phân lập từ cặn n-hexane của lá loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla), có công thức phân tử $\text{C}{32}\text{H}{51}\text{O}_4$ ($m/z\text{ 499,3786 }[\text{M}+\text{H}]^+$).
  2. Bổ sung dữ liệu hóa thực vật: Phân lập và xác định đầy đủ cấu trúc hóa học của nhiều hợp chất thuộc các lớp chất diterpenoid, triterpenoid, steroid và flavonoid từ lá của hai loài Callicarpa macrophylla và Callicarpa candicans thu hái tại Việt Nam.
  3. Dữ liệu thành phần tinh dầu: Cung cấp dữ liệu chi tiết về thành phần hóa học tinh dầu lá và hoa của loài Nàng nàng (C. candicans) cũng như tinh dầu lá của loài Tử châu lá to (C. macrophylla) được phân tích bằng GC-MS.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và dược lý

  1. Cung cấp dữ liệu sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các cặn chiết và các hợp chất sạch phân lập được trên các dòng tế bào Hep-G2, Lu-1, MCF-7, PC-3, A549, góp phần cung cấp cơ sở khoa học khẳng định giá trị dược liệu của chi Callicarpa.
  2. Cung cấp dữ liệu về hoạt tính sinh học của tinh dầu và khả năng kháng vi sinh vật kiểm định đối với các chủng vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương, nấm men và nấm sợi.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Mẫu thực vật nghiên cứu chỉ được thu hái tại một địa điểm địa lý xác định (huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên) vào một thời điểm duy nhất (tháng 10 năm 2017), chưa tiến hành khảo sát sự biến đổi thành phần hóa học theo mùa vụ, sinh cảnh hoặc các vùng địa lý khác nhau.
  • Quá trình phân lập hoạt chất tập trung chủ yếu trên bộ phận lá cây, chưa tiến hành phân lập sâu trên các bộ phận khác như vỏ thân, thân cành, rễ hoặc quả.
  • Các thử nghiệm hoạt tính sinh học mới dừng lại ở mức độ sàng lọc in vitro trên các dòng tế bào ung thư và vi sinh vật kiểm định, chưa thực hiện các thử nghiệm cơ chế phân tử chuyên sâu hay thử nghiệm in vivo trên động vật.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên các bộ phận khác (thân, vỏ, rễ, quả) của loài Nàng nàng (C. candicans) và Tử châu lá to (C. macrophylla).
  • Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động gây độc tế bào và khả năng ức chế khối u ở mức độ in vivo đối với các hợp chất sạch có hoạt tính tiềm năng, đặc biệt là các hợp chất mới callimacrophylla A và callimacrophylla B.
  • Khảo sát biến thiên hàm lượng hoạt chất chính và thành phần tinh dầu theo các mùa trong năm và giữa các vùng sinh thái khác nhau tại Việt Nam.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao đối với:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Dược học, Thực vật học: Cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về chiết tách phân đoạn, kỹ thuật sắc ký phân lập (TLC, CC, Sephadex LH-20, RP-18) và bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1D và 2D-NMR), phổ khối lượng phân giải cao phục vụ giải cấu trúc phân tử các hợp chất terpenoid và flavonoid.
  • Các nhà khoa học trong lĩnh vực sàng lọc dược liệu: Tham khảo phương pháp và thông số đánh giá hoạt tính sinh học in vitro theo phương pháp SRB, MTT trên các dòng tế bào ung thư và phương pháp vi lượng đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.
  • Các viện nghiên cứu và cơ sở sản xuất dược liệu: Sử dụng dữ liệu thành phần hóa học và tinh dầu để định danh hóa học, xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và định hướng khai thác nguồn cây thuốc chi Callicarpa tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án nghiên cứu trên những loài thực vật nào và mẫu được thu thập ở đâu?

Luận án nghiên cứu trên 02 loài thực vật thuộc chi Callicarpa (họ Cỏ roi ngựa - Verbenaceae) gồm loài Nàng nàng (Callicarpa candicans (Burm. f.)) và loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla Vahl). Toàn bộ mẫu thực vật được thu hái tại huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên vào tháng 10 năm 2017, được TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam) giám định và lưu giữ tiêu bản với ký hiệu CA20171001.HN và CA20171002.HN.

2. Các hợp chất mới được phát hiện và công bố trong luận án là gì?

Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 02 hợp chất mới từ loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla):

  • Callimacrophylla A (M1): Hợp chất mới thuộc nhóm diterpenoid phân lập từ phân đoạn ethyl acetate.
  • Callimacrophylla B (M8): Hợp chất mới thuộc nhóm triterpenoid phân lập từ phân đoạn n-hexane, có dạng bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 162 °C, công thức phân tử $\text{C}{32}\text{H}{51}\text{O}_4$ xác định qua pic phổ HR-ESI-MS $m/z\text{ 499,3786 }[\text{M}+\text{H}]^+$.

3. Quy trình chiết tách cặn từ lá cây Tử châu lá to được thực hiện như thế nào và thu được khối lượng các cặn là bao nhiêu?

Từ 3500 g lá khô sấy ở 60 °C, mẫu được ngâm chiết 5 lần với methanol bằng sóng siêu âm ở nhiệt độ phòng. Sau khi cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ dưới 50 °C, thu được 195 g cặn methanol tổng. Phân tán cặn tổng vào nước rồi chiết phân bố lỏng - lỏng thu được:

  • Cặn n-hexane (CMH): 45 g.
  • Cặn ethyl acetate (CME): 25 g.
  • Cặn nước (CMW): 110 g.

4. Hoạt tính gây độc tế bào được đánh giá trên những dòng tế bào ung thư nào và bằng các phương pháp nào?

Hoạt tính gây độc tế bào in vitro được đánh giá qua 02 phương pháp:

  • Phương pháp SRB: Đánh giá trên 03 dòng tế bào ung thư người gồm Hep-G2 (ung thư gan), Lu-1 (ung thư biểu mô phổi) và MCF-7 (ung thư vú), sử dụng chất đối chứng dương là Ellipticine và đo mật độ quang tại 515 nm.
  • Phương pháp MTT: Đánh giá trên các dòng tế bào Hep-G2 (ung thư gan), A549 (ung thư biểu mô phổi) và PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt), sử dụng chất đối chứng dương là Ellipticine hoặc Paclitaxel (Taxol) và đo mật độ quang tại bước sóng 540/720 nm.

5. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thử nghiệm trên các chủng nào và tiêu chí đánh giá ra sao?

Thử nghiệm được tiến hành theo phương pháp pha loãng trên phiến vi lượng 96 giếng trên 08 chủng vi sinh vật chuẩn:

  • Vi khuẩn Gram (-): E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 25923).
  • Vi khuẩn Gram (+): B. subtilis (ATCC 11774), S. aureus subsp. aureus (ATCC 11632).
  • Nấm sợi: A. niger (439), F. oxysporum (M42).
  • Nấm men: C. albicans (ATCC 7754), S. cerevisiae (SH 20). Tiêu chí đánh giá là xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), sử dụng chất đối chứng dương gồm Streptomycin, Tetracyclin, Nystatin và Amphotericin B.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả đã thực hiện một nghiên cứu thực nghiệm toàn diện về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài thực vật Callicarpa candicans và Callicarpa macrophylla thu hái tại Thái Nguyên, Việt Nam. Công trình đã phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc của nhiều hợp chất thuộc các nhóm diterpenoid, triterpenoid, steroid và flavonoid, trong đó phát hiện 02 hợp chất mới từ tự nhiên là callimacrophylla A và callimacrophylla B. Đồng thời, các kết quả phân tích thành phần tinh dầu bằng GC-MS và dữ liệu đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư, kháng vi sinh vật kiểm định đã cung cấp những đóng góp khoa học có giá trị, làm cơ sở dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu phát triển dược liệu từ chi Callicarpa trong tương lai.