Chương 1 SINH HỌC TẾ BÀO Bài 1 HỌC THUYẾT TẾ BÀO CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TẾ BÀO MỤC TIÊU 1. Nêu được nội dung cơ bản của học thuyết tế bào. Trình bày được các phương pháp nghiên cứu tế bào. LƯỢC SỬ HÌNH THÀNH TẾ BÀO HỌC - HỌC THUYẾT TẾ BÀO Tế bào là đơn vị cơ bản của sự sống.
Với kính hiển vi tự tạo độ phóng đại 30 lần, Robert Hooke (1665) là người đầu tiên quan sát mô bần thực vật, các mô bần thực vật được cấu tạo bởi các xoang nhỏ; ông gọi các xoang nhỏ có thành bao quanh là tế bào. Antonie Van Leeuwenhoek (1674) với kính hiển vi độ phóng đại 270 lần đã mô tả tế bào động vật. Đến thế kỷ XIX nhờ sự hoàn thiện của kỹ thuật hiển vi và các ngành khoa học khác đã làm nền tảng cho học thuyết tế bào của Mathias Schleiden và Theodo Schwann (1838 - 1839). Nội dung cơ bản của học thuyết tế bào này: mọi cơ thể sinh vật đều có cấu tạo tế bào.
Từ đây môn tế bào học đã trở thành một khoa học thực sự nghiên cứu cấu trúc, chức năng của tế bào. Theo quan niệm hiện đại thuyết tế bào gồm những nội dung cơ bản: - Mọi sinh vật đều gồm một hoặc nhiều tế bào, trong đó xảy ra các quá trình chuyển hóa vật chất và tồn tại tính di truyền. - Tế bào là sinh vật sống nhỏ nhất, đơn vị tổ chức cơ bản của mọi cơ thể. - Tất cả tế bào đều được sinh ra từ tế bào có trước.
Cấu trúc cơ bản của tế bào gồm 3 phần: - Mọi tế bào đều được màng sinh chất bao quanh. - Mọi tế bào đều có nhân hoặc nguyên liệu chứa thông tin di truyền. - Mọi tế bào đều chứa tế bào chất. Các tế bào có cấu trúc chung, nhưng các nhóm tế bào tiến hóa theo những hướng khác nhau, cấu tạo biến đổi theo các phương thức khác nhau.
file://C:\Windows\Temp\gdssftnnqt\Chapter1.htm 05/07/2013 Page 2 of 57 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TẾ BÀO Ngày càng có nhiều phương pháp nghiên cứu cấu trúc và chức năng của tế bào. Sau đây là những nguyên tắc của một số phương pháp cơ bản. Hiển vi quang học 2.
Nguyên lý Kích thước của tế bào và các thành phần trong tế bào rất nhỏ nên phải tìm cách phóng đại chúng lên để quan sát được. Phương pháp hiển vi quang học là phương pháp nhờ vào khả năng phóng đại của các thấu kính được sắp xếp thành kính hiển vi mà người sáng lập là Robert Hooke (1665). Khả năng phóng đại của kính là từ vài trăm lần đến vài nghìn lần. Kích thước qua kính hiển vi quang học gọi là kích thước hiển vi, đơn vị hiển vi là micromet.
Khả năng phân tách được hai điểm cạnh nhau cũng ở mức độ micromet. Về nguyên lý, muốn cho hai điểm cạnh nhau được trông thấy tách biệt nhau dưới kính hiển vi quang học thì dĩ nhiên hai điểm đó đều phải được nhìn thấy cả. Lý thuyết tán xạ cho thấy: hai hình ảnh sẽ thấy tách biệt nhau nếu hai điểm cách nhau ít nhất bằng 0 , 61 ,5 n sin n là khả năng phân tách của kính, nghĩa là khoảng cách nhỏ nhất thấy giữa hai điểm qua kính hiển vi quang học, là độ dài bước sóng ánh sáng phát ra từ mẫu vật, n là chỉ số chiết quang của môi trường giữa mẫu vật và vật kính, là góc mở của vật kính. đã xác định bởi nguồn ánh sáng thấy, muốn giảm thì chỉ còn cách tăng n sin.
Trong số này góc mở bị giới hạn bởi nhiều sai lệch rất khó điều chỉnh, còn lại là chỉ số chiết quang n. Nhưng n không được cao hơn chỉ số chiết quang của các thấu kính trong vật kính nên người ta chỉ nâng n giữa mẫu vật và vật kính bằng một chất dầu gọi là dầu bách hương để đạt chỉ số chiết quang tối đa mong muốn bằng chỉ số chiết quang của thấu kính. Kính hiển vi quang học cho tới nay vẫn dừng ở độ phóng đại lý thuyết là 3000 với bộ thấu kính: thị kính 20x, trung gian 1,5x, vật kính 100x. Trong thực tế thì độ phóng đại này không dùng vì tối và độ phóng đại thường dùng được với ánh sáng thấy là 1000 lần, với khoảng cách phân biệt được là 0,2 micromet.
Những kính thật tốt dùng để nghiên cứu có thể soi đạt ở độ phóng đại 1500 lần. Với kính hiển vi quang học ta có thể xem được tế bào sống và tế bào đã định hình. Phương pháp làm tiêu bản và quan sát tế bào đã được định hình và nhuộm Tiêu bản hiển vi có nhiều loại, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu và phương pháp hiển vi được sử dụng khi quan sát. Các phương pháp làm tiêu bản hay được sử dụng: làm tiêu bản giọt ép, làm tiêu bản vết bôi, làm tiêu bản dấu quét, lát cắt.
Sau khi trên phiến kính có mẫu vật, tiến hành định hình và nhuộm. Định hình: nhằm mục đích giết nhanh tế bào để cố định tất cả các cấu trúc của nó có hình dạng giống như lúc sống không bị phá hủy. Có nhiều chất và hỗn hợp định hình với các cơ chế cũng như tác dụng khác nhau. Tùy thuộc vào từng đối tượng và mục đích mà cần lựa chọn chất và thời gian định hình phù hợp.
Để định hình, người ta dùng sức nóng hay đông lạnh, hay các hóa chất như alcol, các muối kim loại nặng như platin clorua, thủy ngân biclorua, các acid như acid axetic, acid picric, acid cromic, acid formic. Mẫu vật tế bào sau khi định hình, nếu dày quá thì phải cắt thành những lát mỏng khoảng vài micromet, sau đó nhuộm bằng các chất màu thích hợp. file://C:\Windows\Temp\gdssftnnqt\Chapter1.htm 05/07/2013 Page 3 of 57 Nhuộm: có nhiều loại thuốc nhuộm khác nhau. Theo nguồn gốc: nhóm có nguồn gốc thực vật, nhóm có nguồn gốc động vật, nhóm thuốc nhuộm tổng hợp.
Theo bản chất hóa học: thuốc nhuộm acid, thuốc nhuộm base, thuốc nhuộm trung tính. Khi nhuộm có thể dùng một loại thuốc nhuộm (nhuộm đơn) hay hai loại trở lên (nhuộm kép, nhuộm phức). Thuốc nhuộm thường được pha trong cồn hay trong nước cất tùy mục đích. Đối với mỗi đối tượng cần lựa chọn loại thuốc nhuộm, thời gian nhuộm, phương pháp nhuộm thích hợp.
Phương pháp quan sát tế bào sống Muốn xem tế bào sống phải đặt tế bào trong môi trường lỏng giống hay gần giống với môi trường sống tự nhiên của nó. Một số bộ phận của tế bào sống có chỉ số chiết quang bằng nhau nên quan sát theo phương pháp bình thường không thể thấy được, nhưng khi cải biến chút ít bằng các phụ kiện để tạo thành kính hiển vi nền đen hay kính hiển vi đối pha thì có thể thấy rõ ràng hơn các bộ phận khác nhau. Để quan sát những bào quan và những vật thể trong tế bào có cấu trúc tương tự cấu trúc của tinh thể, người ta dùng kính hiển vi phân cực. Tế bào xem sống cũng có thể nhuộm sống để tăng độ chiết quang của các phần khác nhau.
Chất màu nhuộm phải loãng, không độc hoặc ít độc. Các phẩm nhuộm thường dùng là đỏ trung tính, xanh janus, lục trypan, lục methyl, đỏ trypan. Hiển vi đối pha: là phương tiện được dùng rộng rãi trong việc quan sát tế bào mô sống. Hiển vi đối pha dựa trên nguyên tắc các cấu trúc sinh học có tính chất chiết quang, có khả năng biến đổi pha của tia sáng đi qua.
Các biến đổi này khác nhau ở những phần có chỉ số chiết quang và độ dày khác nhau, ở những phần có chỉ số khúc xạ cao hơn thì ánh sáng bị giữ chậm lại tạo nên sự lệch pha. ở một số bộ phận của tế bào sống có chỉ số chiết quang gần bằng nhau thì sự khác biệt này chưa đủ để có thể phân biệt hình ảnh dưới hiển vi thường. Trong hiển vi đối pha người ta đặt các bản pha là bản mỏng trong suốt có gắn với một gờ nối hình vòng có dạng và kích thước trùng với màn chắn hình vòng của tụ quang. Bản pha được đặt ở mặt phẳng tiêu cự sau vật kính, do vậy sự lệch pha nhỏ cũng được chuyển thành sự sai khác về biên độ làm cho chúng ta có thể quan sát bằng mắt được hay chụp ảnh.
Hiển vi giao thoa: nguyên tắc cũng tương tự như hiển vi đối pha. Hiển vi phân cực: trong kính hiển vi phân cực có bộ phận phân cực, kính phân cực, kính phân tích giúp ta quan sát rõ một số thành phần trong tế bào mà cấu tạo có sự phân cực, không cùng hướng. Hiển vi nền đen: loại kính hiển vi này có vị trí của bộ phận tụ quang khác với hình hiển vi thường, ánh sáng đi vào vật kính là tia tán xạ, ta có thể quan sát các hình ảnh của vật trên nền tối. Hiển vi huỳnh quang: nguồn sáng của kính hiển vi huỳnh quang là đèn thủy ngân tạo ra các tia tím, nhờ hệ thống gương lọc ánh sáng và gương tán sắc đặc biệt sẽ phản chiếu lên bản quan sát những tia bước sóng ngắn.
Các tia đó có tác dụng gây ra hiện tượng huỳnh quang và làm cho bản quan sát phát ra những tia sáng huỳnh quang có bước sóng dài hơn. Độ dài bước sóng bức xạ huỳnh quang luôn luôn dài hơn độ dài bước sóng bức xạ gây ra nó. Một số vật có khả năng phát huỳnh quang. Tuy nhiên một số chất chỉ phát sáng sau khi được nhuộm huỳnh quang.
Ví dụ: người ta sử dụng quinacrin và một số dẫn xuất để phát hiện các băng huỳnh quang trên nhiễm sắc thể và vật thể giới Y ở tế bào lúc gian kỳ. Trong nghiên cứu cấu trúc phân tử, sự vận chuyển qua màng, xác định vị trí trung thể trong tế bào, để nghiên cứu hoạt động ADN, ARN ta có thể đưa hợp chất huỳnh quang vào cơ thể sống và sử dụng phương pháp này để nghiên cứu. file://C:\Windows\Temp\gdssftnnqt\Chapter1.htm 05/07/2013 Page 4 of 57 2. Hiển vi điện tử Kính hiển vi điện tử giúp ta thấy được hình ảnh của mẫu vật trên một màn huỳnh quang hoặc trên bản phim chụp ảnh.
Về nguyên lý cũng tương tự như kính quang học phải có các chùm tia. ở đây không phải là ánh sáng mà là chùm tia điện tử. Các chùm tia điện tử có bước sóng vô cùng ngắn được khuyếch đại bởi các thấu kính điện hoặc từ để cuối cùng đập lên một màn huỳnh quang hoặc phim ảnh cho hình ảnh của mẫu vật. Độ phóng đại của kính điện tử rất lớn tới 5 vạn hoặc 10 vạn lần.
Khoảng cách phân biệt được tính bằng angstrom.