Luận án tiến sĩ: Mối liên quan giữa nồng độ folat, homocystein huyết thanh và đa hình gen MTHFR ở phụ nữ bất thường sinh sản - Trịnh Thị Quế, Trường Đại học Y Hà Nội

Nghiên cứu mối liên quan giữa folat, homocystein và gen MTHFR. Phân tích tác động của các yếu tố di truyền và dinh dưỡng đến sức khỏe tim mạch.

• Tác giả: Trịnh Thị Quế
• Người hướng dẫn: TS. Đoàn Thị Kim Phượng
• Trường học: Trường Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa sinh Y học
• Đề tài: Nghiên cứu mối liên quan giữa nồng độ folat, homocystein huyết thanh và một số đa hình gen MTHFR ở phụ nữ có bất thường sinh sản
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ y học
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về mối liên quan giữa folat homocystein huyết thanh và đa hình gen MTHFR

Folat là vitamin nhóm B đóng vai trò thiết yếu trong quá trình chuyển hóa homocystein (Hcy) thành methionin. Enzyme methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) xúc tác bước chuyển hóa quan trọng này, biến 5,10-methylenetetrahydrofolate thành 5-methyltetrahydrofolate dạng hoạt động của folat. Đa hình gen MTHFR, đặc biệt là biến dị C677T và A1298C, làm giảm hoạt tính enzym, dẫn đến tích lũy homocystein trong máu. Nồng độ Hcy huyết thanh tăng cao được gọi là tăng homocystein máu, một yếu tố nguy cơ của nhiều bệnh lý tim mạch và bất thường sinh sản. Mối liên quan giữa nồng độ folat, Hcy và đa hình gen MTHFR đã được nhiều nghiên cứu quốc tế ghi nhận. Phụ nữ mang đa hình C677T có mức folat huyết thanh thấp hơn khoảng 22% và Hcy cao hơn so với nhóm không mang biến dị. Nghiên cứu tại Việt Nam trên phụ nữ có bất thường sinh sản đã khẳng định mối liên quan này trong bối cảnh di truyền của người Việt.

1.1. Vai trò sinh hóa của folat và homocystein trong cơ thể

Folat tham gia trực tiếp vào quá trình tổng hợp DNA, sửa chữa gen và phân bào. Folat hoạt động ở dạng 5-methyltetrahydrofolate cung cấp nhóm methyl cho phản ứng chuyển homocystein thành methionin. Methionin sau đó được chuyển thành S-adenosylmethionine (SAM), chất cho nhóm methyl chính trong cơ thể. Khi folat thiếu hụt, phản ứng methyl hóa bị gián đoạn, homocystein không được chuyển hóa kịp thời dẫn đến tăng nồng độ trong máu. Tăng homocystein máu gây độc tế bào nội mô mạch máu, tăng nguy cơ huyết khối và ảnh hưởng xấu đến sự phát triển phôi thai.

1.2. Đặc điểm đa hình gen MTHFR và phân bố trong quần thể

Gen MTHFR nằm trên nhiễm sắc thể 1p36.3, gồm 11 exon. Hai biến dị điểm phổ biến nhất là C677T (rs1801133) ở exon 4 và A1298C (rs1801131) ở exon 7. Biến dị C677T thay alanin bằng valin ở vị trí 222, làm giảm 35% hoạt tính enzym ở thể đồng hợp tử TT. Biến dị A1298C thay glutamat bằng alanin, giảm hoạt tính enzym ở mức độ nhẹ hơn. Tần số alen T ở người châu Á dao động 30-40%, trong khi ở người châu Âu khoảng 30-35%. Ở Việt Nam, nghiên cứu cho thấy tần số mang alen T khoảng 35% ở phụ nữ có bất thường sinh sản.

II. Phân tích tác động của đa hình gen MTHFR lên nồng độ folat và homocystein

Nhiều nghiên cứu quy mô lớn đã chứng minh sự ảnh hưởng rõ rệt của đa hình gen MTHFR đến nồng độ folat và Hcy huyết thanh. Yang và cộng sự năm 2008 nghiên cứu trên 6.793 người cho thấy nhóm mang đa hình MTHFR có Hcy huyết thanh cao hơn đáng kể và folat huyết thanh thấp hơn so với nhóm không mang biến dị. Cụ thể, người mang đa hình C677T có mức folat huyết thanh thấp hơn 22%. Alessio và cộng sự cũng ghi nhận biến dị 677T và A1298C liên quan có ý nghĩa thống kê với tăng Hcy huyết thanh. Tuy nhiên, nồng độ folat không có khác biệt đáng kể giữa các nhóm đa hình trong một số nghiên cứu, gợi ý vai trò độc lập của yếu tố di truyền. Tác động của đa hình MTHFR còn phụ thuộc vào lượng folat bổ sung từ chế độ ăn. Khi folat đầy đủ, ảnh hưởng của biến dị C677T lên Hcy giảm đáng kể. Ngược lại, khi folat thiếu hụt, tác động của đa hình gen trở nên rõ rệt hơn nhiều, tạo điều kiện cho tăng homocystein máu nặng.

2.1. Cơ chế giảm hoạt tính enzym MTHFR do đa hình gen

Biến dị C677T tạo ra dạng protein nhiệt độ không ổn định. Ở nhiệt độ cơ thể bình thường, enzym mang alen T có hoạt tính thấp hơn alen C do cấu trúc không gian bị thay đổi. Ở thể đồng hợp tử TT, hoạt tính MTHFR giảm 35-40% so với thể CC. Biến dị A1298C ảnh hưởng đến vùng điều hòa allosteric của enzym, làm giảm khả năng gắn với S-adenosylmethionine. Khi cả hai biến dị cùng tồn tại (thể kép heterozygous), hoạt tính enzym giảm tương đương đồng hợp tử TT, dẫn đến rối loạn chuyển hóa folat và tích lũy Hcy.

2.2. Mối liên quan giữa đa hình MTHFR với bất thường sinh sản

Tăng homocystein máu ở phụ nữ mang đa hình gen MTHFR là yếu tố nguy cơ của nhiều bất thường sinh sản. Thai chết lưu là một biểu hiện nghiêm trọng, được định nghĩa là thai chết trong tử cung. Cơ chế bao gồm rối loạn methyl hóa DNA phôi thai, tổn thương tế bào nội mô mạch máu rau thai và tăng nguy cơ huyết khối vi mạch. Nồng độ Hcy cao cũng ảnh hưởng đến quá trình phân bào và sửa chữa DNA, gây bất thường nhiễm sắc thể ở phôi. Nghiên cứu trên phụ nữ Việt Nam có thai chết lưu cho thấy tần số mang alen T cao hơn nhóm đối chứng khỏe mạnh.

III. Phương pháp nghiên cứu mối liên quan giữa folat homocystein và đa hình gen MTHFR

Phương pháp nghiên cứu mối liên quan giữa folat, Hcy và đa hình gen MTHFR bao gồm nhiều kỹ thuật sinh học phân tử và hóa sinh hiện đại. Đo nồng độ folat và Hcy huyết thanh được thực hiện bằng phương pháp miễn dịch hóa phát quang (chemiluminescent immunoassay) trên hệ thống máy tự động. Phát hiện đa hình gen MTHFR sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism) hoặc giải trình tự Sanger. Mẫu máu được thu thập từ đối tượng nghiên cứu, tách chiết DNA bằng bộ kit thương mại. Đoạn DNA chứa vị trí đa hình được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu, sau đó cắt bằng enzyme hạn chế tương ứng. Sản phẩm phân tách trên gel agarose để xác định kiểu gen CC, CT hoặc TT. Giải trình tự Sanger được sử dụng để xác nhận kết quả, dựa trên nguyên tắc sử dụng dideoxynucleotide để dừng sao chép DNA tại các vị trí cụ thể.

3.1. Kỹ thuật PCR RFLP trong phát hiện đa hình gen MTHFR

PCR-RFLP là phương pháp phổ biến để phát hiện đa hình điểm C677T và A1298C. Đối với C677T, đoạn DNA 198bp được khuếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme HinfI: alen C không có vị trí cắt tạo một vạch 198bp, alen T tạo vị cắt mới cho vạch 175bp và 23bp. Kiểu gen CT cho ba vạch 198bp, 175bp và 23bp. Phương pháp này có độ nhạy và đặc hiệu cao, chi phí thấp, phù hợp với nghiên cứu quy mô lớn.

3.2. Đo nồng độ folat và homocystein huyết thanh

Nồng độ folat huyết thanh được đo bằng phương pháp cạnh tranh miễn dịch hóa phát quang, sử dụng kháng thể kháng folat gắn chất phát quang. Nồng độ bình thường của folat huyết thanh từ 3,1-17,5 ng/mL. Homocystein huyết thanh đo bằng phương pháp miễn dịch hóa phát quang trên hệ thống Architect. Giá trị bình thường của Hcy huyết thanh ở phụ nữ từ 5-15 µmol/L. Tăng homocystein máu được định nghĩa khi Hcy huyết thanh trên 15 µmol/L. Các chỉ số này được đo đồng thời trên mẫu máu lấy lúc đói để đảm bảo độ chính xác.

IV. Kết luận và ứng dụng lâm sàng trong sàng lọc đa hình gen MTHFR

Nghiên cứu đã khẳng định mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa nồng độ folat, homocystein huyết thanh và đa hình gen MTHFR ở phụ nữ có bất thường sinh sản tại Việt Nam. Phụ nữ mang đa hình C677T có nồng độ Hcy huyết thanh cao hơn và folat thấp hơn so với nhóm không mang biến dị. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, đồng thời cung cấp dữ liệu cụ thể về tần số alen trong quần thể người Việt. Ứng dụng lâm sàng của phát hiện này rất quan trọng trong lĩnh vực sản phụ khoa và tư vấn di truyền. Sàng lọc đa hình gen MTHFR trước mang thai giúp xác định nhóm phụ nữ có nguy cơ cao tăng homocystein máu. Bổ sung acid folic liều cao ở phụ nữ mang alen T là chiến lược dự phòng hiệu quả. Tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng có tiền sử bất thường sinh sản nên bao gồm xét nghiệm gen MTHFR.

4.1. Sàng lọc và dự phòng tăng homocystein máu ở phụ nữ mang thai

Sàng lọc đa hình gen MTHFR nên được xem xét cho phụ nữ có tiền sử thai chết lưu, sảy thai liên tiếp hoặc tiền sử gia đình có bệnh lý tim mạch sớm. Phụ nữ mang alen T của gen MTHFR cần được bổ sung acid folic liều cao 4-5mg/ngày thay vì liều dự phòng thông thường 0,4mg. Bổ sung thêm vitamin B6 và B12 hỗ trợ chuyển hóa Hcy. Nồng độ Hcy huyết thanh nên được theo dõi định kỳ trước và trong thai kỳ. Các can thiệp này giúp giảm nguy cơ bất thường sinh sản liên quan đến tăng homocystein máu.

4.2. Hướng nghiên cứu tương lai và giới hạn

Nghiên cứu tương lai cần mở rộng quy mô mẫu, bao gồm nhiều nhóm bệnh lý sản phụ khoa khác nhau. Nghiên cứu mối tương tác giữa đa hình gen MTHFR với các gen khác trong pathway chuyển hóa folate như MTR, MTRR và CBS. Đánh giá ảnh hưởng của đa hình MTHFR lên nồng độ folat trong hồng cầu, chỉ số phản ánh tình trạng folat dài hạn tốt hơn folat huyết thanh. Xây dựng bảng tần số alen MTHFR cho từng vùng miền tại Việt Nam phục vụ tư vấn di truyền chính xác.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 3 TỔNG QUAN 1. Tổng quan về bất thường sinh sản Bất thường sinh sản bao gồm vô sinh và bất thường thai sản. Bất thường thai sản thường biểu hiện ở các dạng bệnh lý như sẩy thai sớm hoặc sẩy thai muộn, thai chết lưu, thai trứng, chửa ngoài tử cung, thai chậm phát triển trong tử cung, đẻ non, sơ sinh nhẹ cân, thai già tháng, dị tật bẩm sinh, chết sơ sinh,. Vô sinh Định nghĩa: Vô sinh là bệnh của hệ thống sinh dục nam hoặc nữ được xác định là không đạt dược mục đích mang thai sau 12 tháng quan hệ tình dục thường xuyên không được bảo vệ.19 Vô sinh nam chiếm khoảng 20% các cặp vợ chồng vô sinh.

Thăm dò các nguyên nhân vô sinh ở nam giới cũng rất hạn chế, xét nghiệm tinh dịch đồ gần như là thăm dò duy nhất để đánh giá khả năng sinh sản của nam giới.20 Vô sinh nữ được chia làm 2 nhóm: nguyên phát và thứ phát:20 - Vô sinh nguyên phát (vô sinh I): hai vợ chồng chưa bao giờ có thai, mặc dù đã sống với nhau trên một năm và không dùng biện pháp tránh thai nào. - Vô sinh thứ phát (vô sinh II): hai vợ chồng trước kia đã có con hoặc đã có thai, nhưng sau đó không thể có thai lại mặc dù đang sống với nhau trên một năm và không dùng biện pháp tránh thai nào. Các bất thường thai sản 1. Sẩy thai Có nhiều quan niệm về sẩy thai khác nhau tùy theo từng nước, chủ yếu khác nhau về quy định đối với thời gian mang thai.

Theo Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG), sẩy thai là hiện tượng kết thúc quá trình thai nghén một cách tự nhiên trước khi thai nhi đạt tới độ tuổi có thể sống bên ngoài tử cung; đó là sự 4 trục xuất hoặc tống ra của phôi thai hoặc thai nhi có trọng lượng < 500 gam (tương ứng với tuổi thai < 22 tuần).21 Theo hướng dẫn của Bộ Y tế về các dịch vụ chăm sóc sức khỏe sinh sản của Việt Nam, sẩy thai là trường hợp thai và rau bị tống ra khỏi buồng tử cung trước 22 tuần (kể từ ngày đầu của kỳ kinh cuối)1 và hướng dẫn chẩn đoán và điều trị các bệnh sản phụ khoa, sẩy thai là hiện tượng kết thúc thai nghén trước khi thai có thể sống được. Với khái niệm này, sẩy thai được định nghĩa là trường hợp thai bị tống ra khỏi buồng tử cung trước 22 tuần hay cân nặng của thai dưới 500g.22 Như vậy, đối với thời gian mang thai, Việt Nam áp dụng định nghĩa của TCYTTG. Sẩy thai được chia ra các thể lâm sàng như sau:23 - Sẩy thai hoàn toàn: người bệnh có dấu hiệu của có thai và đã sẩy hoàn toàn ra ngoài. Siêu âm buồng tử cung sạch.

- Sẩy thai không hoàn toàn: người bệnh có dấu hiệu của có thai và đang sẩy thai. Sau khi thấy thai ra rồi vẫn còn đau bụng, còn ra máu kéo dài. Khám cổ tử cung mở và tử cung còn to. Siêu âm có hình ảnh âm vang không đồng nhất trong buồng tử cung.

- Sẩy thai đã chết: người bệnh có dấu hiệu của có thai. Có dấu hiệu của thai chết lưu: giảm nghén, ra máu đen kéo dài, khám thấy tử cung nhỏ hơn tuổi thai, siêu âm thấy hình ảnh túi ối méo mó không có âm vang phôi hay có phôi thai nhưng không thấy hoạt động của tim thai. Có dấu hiệu của dọa sẩy thai, đang sẩy thai, sẩy thai hoàn toàn hay không hoàn toàn. - Sẩy thai liên tiếp: là hiện tượng có từ 2 lần sẩy thai liên tục trở lên, thai nhi bị tống xuất khỏi buồng tử cung trước 22 tuần.

Nguy cơ thay đổi tùy theo số lần sẩy thai, đã từng sinh con còn sống và có con bị dị tật hay không. Thai chết lưu Có nhiều quan niệm về thai chết lưu khác nhau tùy theo từng nước, chủ yếu khác nhau về quy định đối với thời gian mang thai và trọng lượng thai. Theo TCYTTG, thai chết lưu là thai chết trước khi bị đưa ra hoàn toàn 5 khỏi người mẹ không phân biệt thời gian mang thai.21 Ba tiêu chuẩn để chẩn đoán thai chết lưu là: trọng lượng thai, tuổi thai và chiều dài cơ thể thai. TCYTTG cũng chia làm 2 nhóm: thai chết lưu sớm bao gồm: trọng lượng thai tối thiểu 500 gam, tuổi thai ≥ 22 tuần và chiều dài thai đo từ đỉnh đầu đến gót chân ít nhất 25 cm.23 Thai chết lưu muộn có trọng lượng ≥ 1000 gam hoặc ≥ 28 tuần tuổi và chiều dài cơ thể ≥ 35cm.23 Theo Nguyễn Đức Hinh và cộng sự năm 201324 và theo hướng dẫn của Bộ Y tế về việc chẩn đoán và điều trị các bệnh sản phụ khoa, thai chết lưu trong tử cung là tất cả các trường hợp thai bị chết mà lưu trong buồng tử cung trên 48 giờ.19 Vì các mục đích so sánh và khả năng chăm sóc sơ sinh, các định nghĩa có tính pháp lý về thai chết lưu ở các quốc gia rất khác nhau, thường yêu cầu ghi nhận trường hợp thai chết lưu ở một số độ tuổi thai nào đó (12, 16, 20, 22, 24, 26 hoặc 28 tuần) và cân nặng (350, 400, 500, hoặc 1000 gam).

Ngay cả ở một nước, ví dụ ở các các tiểu bang Hoa Kỳ có nhiều định nghĩa thai chết lưu khác nhau trên cơ sở kết hợp giữa tuổi thai và trọng lượng thai. Hầu hết các tiểu bang báo cáo thai chết lưu quy định từ tuần thứ 20 và trọng lượng từ 350g trở lên, tuy nhiên một số tiểu bang báo cáo thai chết lưu ở tất cả các thời kì mang thai. Quy định về thai chết lưu ở một số nước Nước Tuổi thai Trọng lượng thai Đức 27 Không quy định ≥ 500 gam Na Uy 28 ≥ 12 tuần Không quy định Hà Lan 27 ≥ 16 tuần Không quy định Úc 28 ≥ 20 tuần Hoặc ≥ 400 gam Mỹ 25 ≥ 20 tuần ≥ 350 gam Canada 29 ≥ 20 tuần Hoặc ≥ 500 gam Pháp 27 ≥ 22 tuần Hoặc ≥ 500 gam Hungary 27 ≥ 24 tuần Hoặc ≥ 500 gam Ý 27 ≥ 180 ngày Không quy định Tây Ban Nha 27 ≥ 26 tuần Không quy định Thụy Điển 27 ≥ 28 tuần Không quy định Tại Việt Nam 6 Thai chết lưu được chia làm 2 nhóm:22  Thai chết lưu dưới 20 tuần: nhiều trường hợp không có triệu chứng làm cho phát hiện muộn, một số trường hợp người bệnh thấy bụng bé đi hoặc không to lên dù mất kinh đã lâu. - Bệnh cảnh lâm sàng hay gặp: + Người bệnh đã có dấu hiệu của có thai như chậm kinh, hCG dương tính, siêu âm đã thấy có thai và hoạt động của tim thai.

+ Ra máu âm đạo: máu ra tự nhiên, ít một, máu đỏ sẫm hay nâu đen. + Đau bụng: thường không đau bụng, chỉ đau bụng khi dọa sẩy hay đang sẩy thai lưu. - Cận lâm sàng: + Nồng đồ βhCG: thấp hơn so với tuổi thai hay tốc độ tăng của βhCG không theo qui luật của thai sống. + Siêu âm: là thăm dò có giá trị, cho chẩn đoán sớm và chính xác: hoặc có thể thấy âm vang thai rõ ràng mà không thấy hoạt động tim thai.

Hình ảnh túi ối rỗng (chỉ nhìn thấy túi ối mà không thấy âm vang thai), túi ối rỗng với bờ méo mó, không đều. Trong trường hợp nghi ngờ, nên kiểm tra lại sau 1 tuần để xem tiến triển của túi ối; hoặc có âm vang thai mà không thấy hoạt động tim thai.  Thai chết lưu trên 20 tuần: triệu chứng thường rõ ràng làm người bệnh phải đi khám ngay. - Bệnh cảnh lâm sàng: + Người bệnh không thấy thai cử động nữa, không thấy bụng to lên, thậm chí bé đi (nếu thai đã chết lâu ngày).

+ Hai vú tiết sữa non. + Ra máu âm đạo: hiếm gặp. + Đau bụng: khi chuẩn bị sẩy, đẻ thai lưu. 7 + Nếu người bệnh bị một số bệnh kèm theo như nghén nặng, tiền sản giật, bệnh tim.

thì bệnh tự thuyên giảm, người bệnh cảm thấy dễ chịu hơn. - Cận lâm sàng + Siêu âm: không thấy hoạt động của tim thai. Đầu thai méo mó, có thể thấy hiện tượng chồng khớp sọ hay dấu hiệu hai vòng ở xương sọ do da đầu bị bong ra. Nước ối ít hay hết ối.

+ Định lượng Fibrinogen trong máu: đánh giá ảnh hưởng của thai đến quá trình đông máu. Thai chậm phát triển trong tử cung 20 Khái niệm: thai nhẹ cân là khi thai đủ tháng, trọng lượng thai lúc sinh dưới 2500 gram. Trong thực tế, khái niệm thai chậm phát triển trong tử cung bao gồm trọng lượng thai tại thời điểm thăm khám và sự phát triển của thai. Để xác định thai thực sự có chậm phát triển hoặc ngừng phát triển thì phải đo kích thước và ước lượng trọng lượng thai ở ít nhất 2 lần thăm khám liên tiếp cách nhau 01 tuần.

Tiền sản giật – sản giật 20 Tiền sản giật, sản giật là biến chứng nội khoa thường gặp nhất ở phụ nữ mang thai với tỉ lệ từ 2% - 8%. Triệu chứng thường gặp là phù, tăng huyết áp và protein niệu. Đây là một trong những nguyên nhân chính gây tử vong cho mẹ và thai. Theo dõi và quản lý thai nghén, điều trị thích hợp tiền sản giật, sản giật nhằm giảm biến chứng nặng nề cho mẹ và thai.

Dọa đẻ non, đẻ non 20 Định nghĩa: theo TCYTTG, đẻ non là cuộc chuyển dạ xảy ra từ tuần thứ 22 đến trước tuần 37 của thai kỳ tính theo kinh cuối cùng. Sơ sinh non tháng có tỷ lệ tử vong và mắc bệnh cao hơn rất nhiều so với trẻ đẻ đủ tháng, nguy cơ cao bị di chứng thần kinh với tỷ lệ 1/3 trước tuần 32, giảm xuống 1/10 sau 35 tuần. Dự phòng và điều trị dọa đẻ non - đẻ non luôn là một vấn đề quan trọng đối với sản khoa, sơ sinh và toàn xã hội. Tại Việt nam, chưa có thống kê trên toàn quốc, nhưng theo những nghiên 8 cứu đơn lẻ, tỷ lệ đẻ non khoảng 8-10%.

Dị tật bẩm sinh Dị tật bẩm sinh là những bất thường về cấu trúc, chức năng bao gồm cả các rối loạn chuyển hóa có mặt lúc mới sinh. Về mặt lâm sàng, dị tật bẩm sinh có thể phát hiện ngay từ lúc sinh hoặc có thể được chẩn đoán muộn hơn.2 Dị tật bẩm sinh xảy ra khoảng 3% trẻ sơ sinh. Nếu không được can thiệp phẫu thuật khoảng 1/3 số trẻ này sẽ tử vong do các dị tật này làm trẻ không thích ứng được với đời sống bên ngoài tử cung.20 Dị tật bẩm sinh có nhiều kiểu bất thường về hình thái.