Chương 1. GIỚI THIỆU Trên thế giới, một lượng lớn dân số không có khả năng tiêu thụ lactose, dẫn đến việc họ không thể sử dụng những sản phẩm chứa lactose như sữa và những sản phẩm chế biến từ sữa (phô mai, yogurt, sữa chua…) (Bannan và cộng sự, 1996). Enzyme β-galactosidase xúc tác thủy phân lactose thành glucose và galactose tạo sản phẩm thích hợp cho những người không dung nạp lactose. Điều này không những mở ra tiềm năng trong sản xuất, tiêu thụ các sản phẩm từ sữa mà còn hỗ trợ những người này có thể sử dụng nguồn dinh dưỡng dồi dào trong sữa (protein, chất béo, vitamin và khoáng chất.
Bên cạnh đó, enzyme β-galactosidase còn có hoạt tính chuyển galactosyl giúp tổng hợp các galacto- oligosaccharide (GOS) - một prebiotic rất có lợi cho sức khỏe (Gosling và cộng sự, 2010). Ngoài ra, enzyme này còn có vai trò trong cải thiện các đặc tính kỹ thuật của thực phẩm, giúp mở rộng khả năng tận dụng nguồn whey góp phần giải quyết vấn đề về ô nhiễm môi trường. Trong số các vi sinh vật sản xuất β-galactosidase thì vi khuẩn lactic là nguồn cung cấp tiềm năng đáng được quan tâm vì điều kiện lên men dễ dàng, hoạt tính enzyme cao, ổn định và đặc biệt là tính an toàn (Vasiljevic và Jelen, 2001). - galactosidase từ vi khuẩn lactic có vai trò rất quan trọng trong ngành chế biến sữa và sản xuất phomai (Adam và cộng sự , 2004).
Mặc dù vậy, enzyme từ nguồn này vẫn chưa nhận được nhiều sự quan tâm về mặt khoa học. acidophilus là một trong những vi khuẩn lactic có hoạt tính β-galactosidase cao nhất (Klaenhammer và cộng sự, 2008). Tuy nhiên, enzyme này ở L. acidophilus là enzyme nội bào, nhạy cảm với các tác động môi trường nên quá trình xử lý phá vỡ tế bào để thu nhận enzyme một cách hiệu quả là yếu tố vô cùng quan trọng.
Nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào việc tìm ra phương pháp và các thông số xử lý tế bào L. acidophilus nhằm thu nhận β-galactosidase một cách hiệu quả nhất. Định nghĩa -galactosidase (-D-galactoside galactohydrolase, EC 3.23) thường được gọi là lactase nhờ khả năng thủy phân lactose thành các đường đơn galactose và glucose (Panesar và cộng sự, 2006). -galactosidase ngoài thủy phân lactose còn xúc tác các phản ứng chuyển nhóm galactosyl tạo thành các GOS.
Ngoài ra, enzyme này cũng liên quan đến sự chuyển hóa của các galactoside phức hợp (glycoprotein và glycolipid) (Panesar và cộng sự, 2006). Sự thủy phân lactose bằng -galactosidase (Raymond và cộng sự, 2003) 2. Cơ chế hoạt động Enzyme β-galactosidase xúc tác thủy phân tại vị trí galactosyl của β-D- galactopyranoside liên kết với các aglycon (Matthews, 2005). Đầu tiên, Glu 537 ái nhân của enzyme sẽ hình thành liên kết cộng hóa trị α-D- galactosyl với cơ chất dưới sự hỗ trợ của acid, Glu 461 hay Mg2+, đồng thời liên kết glycoside trong cơ chất bị phân giải.
Sau đó, một liên kết được hình thành giữa nhóm galactosyl và enzyme, chuyển nhóm galactosyl đến một chất nhận có khả năng cho điện tử (hình 2. Kết quả phản ứng tùy thuộc vào chất nhận galactosyl. Nếu chất nhận galactosyl là nước (R2 = H) thì sản phẩm sẽ là galactose. Nếu chất nhận galactosyl là saccharide (R2 = glucose, galactose, lactose) thì xảy ra sự chuyển vị galactosyl và tổng hợp GOS (Gosling và cộng sự, 2010).
Cơ chế hoạt động của β-galactosidase trên galactoside (Gosling và cộng sự, 2010) Sự hình thành GOS tăng khi nồng độ lactose cao hoặc giảm nồng độ nước. Sản xuất GOS đạt hiệu suất từ 2 - 32 % khi nồng độ lactose ban đầu từ 14 - 40 %(w/v). Do đó, khi sử dụng β-galactosidase thủy phân lactose trong những sản phẩm có nồng độ lactose ban đầu thấp như sữa và whey thì β-galactosidase không thể hiện hoạt tính chuyển galactosyl (Valero, 2009). Ứng dụng Enzyme -galactosidase có ứng dụng rất quan trọng trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, sinh học cũng như trong kỹ thuật và môi trường (Jurado và cộng sự, 2002).
Loại trừ lactose giúp người không dung nạp lactose Trong sữa và các sản phẩm từ sữa có chứa một lượng lớn lactose. Lượng lactose chiếm 4.5 - 5 % trong sữa bò, hơn một phần ba lượng chất khô trong sữa; xấp xỉ 20 % trong ice cream và 72 % trong chất khô của whey. Disaccharide này hình thành nên các chức năng sinh học quan trọng như thúc đẩy sự phát triển của các vi khuẩn đường ruột và cung cấp galactose, một thành phần dinh dưỡng cần thiết giúp hình thành các GOS và các galactolipid trong não (Maldonado và cộng sự, 1998). Lactose không thể được hấp thu trực tiếp mà phải qua quá trình thủy phân thành các monosaccharise bằng enzyme -galactosidase trong ruột.
Một lượng lớn dân số 13 (khoảng 75 %) không thể tiêu hóa lactose vì thiếu gen mã hóa enzyme này (Bannan và cộng sự, 1996). Đối với những người thiếu enzyme -galactosidase, khi đưa một lượng lớn lactose vào ruột có thể gây ra các triệu chứng như: đầy hơi, đau bụng, chuột rút và tiêu chảy (tình trạng lâm sàng được gọi là không dung nạp lactose) (Ruch, 2004). Tình trạng không dung nạp lactose ở người có thể giải quyết bằng nhiều cách: thủy phân trước lactose trong sữa và các sản phẩm từ sữa bằng cách sử dụng enzyme β-galactosidase hoặc điều chế enzyme β-galactosidase thành dạng viên và ăn vào trực tiếp trước khi sử dụng các sản phẩm sữa (Eisenhardt và cộng sự, 2003). Sử dụng enzyme β-galactosidase thủy phân lactose để sản xuất các sản phẩm sữa nghèo lactose sẽ hỗ trợ cho những người không dung nạp lactose có thể sử dụng nguồn dinh dưỡng dồi dào trong sữa (protein, chất béo, vitamin và khoáng chất) và giúp tăng sản lượng sữa tiêu thụ.
Hình thành GOS GOS được hình thành đồng thời trong quá trình thủy phân lactose do hoạt tính chuyển galactosyl của enzyme β-galactosidase (Rabiu và cộng sự, 2001). Những oligosaccharide như GOS có nhiều tác động tích cực đối với sức khỏe con người (Urgell và cộng sự, 2001). GOS thuộc nhóm prebiotic - thực phẩm có khả năng hỗ trợ sự phát triển của các probiotic - hệ vi sinh đường ruột có lợi cho sức khỏe con người (Bifidobacterium sp. và Lactobacillus sp).
Các oligosaccharide thường có vai trò hỗ trợ hoạt động trao đổi chất của tất cả các vi khuẩn đường ruột, tuy nhiên GOS lại chọn lọc cho vi khuẩn probiotic có tính acid. Cải thiện đặc tính kỹ thuật và cảm quan của thực phẩm Đối với sản phẩm sữa không lên men Trong ice-cream, whey và sữa cô đặc nếu hàm lượng lactose cao có thể dẫn đến sự hình thành tinh thể, gây nên cấu trúc bột, cát trong sản phẩm. Sử dụng enzyme β- galactosidase trong quá trình sản xuất những sản phẩm trên có thể làm giảm nồng độ lactose đến giá trị thích hợp, vì vậy giúp cải thiện một số đặc tính kỹ thuật và cảm quan của sản phẩm: sản phẩm mềm, mịn hơn, tiêu hóa dễ dàng hơn… (Zadow và cộng sự, 1993). 14 Đối với sản phẩm lên men từ sữa Sản xuất yogurt từ nguyên liệu sữa đã thủy phân lactose sẽ giảm được thời gian lên men nhờ sự gia tăng tốc độ sản sinh acid, vị acid cũng được cải thiện nhờ tác động của glucose và galactose, nhờ vậy sản phẩm yogurt phù hợp hơn với người tiêu dùng.
Ngoài ra, glucose và galactose còn giúp tăng vị ngọt đáng kể cho sản phẩm, do đó có thể giảm lượng chất ngọt bổ sung trong yogurt, giúp giảm năng lượng của sản phẩm (Rabiu và cộng sự, 2001). Tương tự, trong sản xuất phô mai, khi sử dụng nguyên liệu sữa đã thủy phân lactose sẽ giảm được thời gian lên men và khối đông ít bị vỡ hơn. Xử lý whey Whey là sản phẩm phụ được tạo ra trong quá trình sản xuất phô mai, thành phần chính của whey là lactose (44 - 52 g/l), ngoài ra còn có protein (6 - 8 g/l) và khoáng chất (4. Một phần whey được xử lý siêu lọc để sản xuất whey protein concentrate (WPI).
Tuy nhiên, vẫn còn một lượng lớn whey bị thải bỏ và điều này gây ra các vấn đề về môi trường. Hơn 90 % nguyên nhân làm chỉ số sinh học (BOD) tăng cao được xác định là do lactose (Khider và cộng sự, 2004). Để xử lý vấn đề lactose trong whey, giải pháp được đưa ra là sử dụng các vi sinh vật thủy phân lactose. Tuy nhiên, lượng vi sinh vật có thể trực tiếp sử dụng lactose như nguồn carbon thấp hơn so với lượng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa trực tiếp glucose và galactose.
Do đó, quá trình thủy phân sơ bộ lactose bằng β-galactosidase sẽ giúp tăng hiệu quả quá trình xử lý và có thể thu được các sản phẩm là các chế phẩm sinh học (lactate, acetate, ethanol, buthanediol.), các biopolymer và sinh khối ứng dụng vào các ngành công nghiệp khác (Coté và cộng sự, 2004). Ngoài ra, whey sau khi được xử lý enzyme còn có thể được sử dụng để sản xuất syrup và các GOS (Novalin và cộng sự, 2005). Nguồn thu nhận β-galactosidase β-galactosidase được phân bố rộng rãi trong tự nhiên theo các vai trò chức năng của nó như vai trò trong tiêu hóa, thoái hóa lysosomal, vai trò trong quá trình dị hóa. Tuy nhiên, β-galactosidase được tìm thấy phổ biến ở thực vật, ruột động vật có 15 vú và đặc biệt ở các vi sinh vật như nấm mốc, nấm men và vi khuẩn (Raymond và cộng sự, 2003).
β-galactosidase từ động, thực vật β-galactosidase từ thực vật là các glycosidase, tham gia nhiều chức năng quan trọng trong sự nảy mầm và sự chín của trái bằng cách thủy phân từng bậc các polymer chứa galactose tại đầu không khử (Brummel và Harpster, 2001). Hợp chất bị thủy phân có thể là arabinogalactan - một polymer của arabinose và galactose, thành phần giúp làm cứng thành tế bào thực vật. β-galactosidase acid từ thực vật có thể được thu nhận từ nhiều nguồn như táo, hồng vàng (Diospyros caci), lúa mạch, lúa mì, cà chua. Ở động vật, β-galactosidase có vị trí tại các vi nhung mao của tế bào nhầy trong ruột, đặc biệt là trong ruột các động vật mới sinh (Raymond và cộng sự, 2003).
β-galactosidase từ vi sinh vật β-galactosidase ở vi khuẩn và nấm men là enzyme nội bào, ở nấm mốc có thể là nội bào hoặc ngoại bào. β-galactosidase thu nhận từ các nguồn khác nhau sẽ có đặc tính và cấu trúc riêng (về trọng lượng phân tử, chiều dài chuỗi amino acid, vị trí trung tâm hoạt động, pH và nhiệt độ hoạt động tối ưu. a- β-galactosidase từ nấm mốc β-galactosidase từ nấm mốc có pH hoạt động trong khoảng acid (pH tối ưu từ 3 - 5), thường được sử dụng để thủy phân whey chua. β-galactosidase từ nấm mốc là enzyme chịu nhiệt, nhiệt độ hoạt động tối ưu khoảng 55 - 60 °C.
Sự kết hợp của pH thấp và nhiệt độ cao sẽ có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốn.