Nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy Aspergillus oryzae trên môi trường bán rắn để thu lactase

Nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy Aspergillus oryzae trên môi trường bán rắn thu lactase, góp phần phát triển công nghệ sinh học.

• Tác giả: Mai Thục Di
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thúy Hương
• Trường học: Đại học Quốc gia TP. HCM - Trường Đại học Bách Khoa
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Tối ưu điều kiện nuôi cấy Aspergillus oryzae trên môi trường bán rắn thu lactase
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.2. MỤC TIÊU
• 1.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
• 2.1. ENZYME LACTASE
• 2.1.1. Phân loại
• 2.1.2. Cấu trúc của enzyme lactase
• 2.1.3. Cơ chất lactose
• 2.2. NAM SỢI ASPERGILLUS ORYZAE
• 2.2.1. Đặc điểm hình thái
• 2.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
• 2.3. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM LACTASE
• 2.3.1. Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp lactase
• 2.3.2. Phương pháp lên men bán rắn thu chế phẩm enzyme
• 2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp lactase của nấm sợi trên môi trường bán rắn
• 2.3.4. Kỹ thuật nuôi cấy bề mặt với môi trường bán rắn
• 2.3.5. Cấu tạo của GOS
• 2.3.6. Con đường hình thành GOS từ lactose
• 2.3.7. Những lợi ích của GOS đối với sức khỏe
• 2.3.8. Ứng dụng của GOS và tình hình sản xuất
• 2.3.9. Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
• 2.3.10. Công dụng của RSM
• 2.3.11. Các mô hình thí nghiệm trong RSM
• 2.3.12. Nghiên cứu ngoài nước và trong nước
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Giống vi sinh vật
• 3.2. Thiết bị dụng cụ
• 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.3.1. Tuyển chọn chủng sinh lactase mạnh từ 6 chủng Aspergillus oryzae
• 3.3.2. Khảo sát các đặc điểm sinh học, hình thái của giống
• 3.3.3. Lập đường cong sinh trưởng của chủng nấm mốc
• 3.3.4. Khảo sát khả năng sinh enzyme theo thời gian nuôi cấy
• 3.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất lên khả năng sinh lactase
• 3.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cung cấp nitơ đến khả năng sinh enzyme
• 3.3.7. Tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh lactase của A. oryzae theo qui hoạch thực nghiệm
• 3.3.8. Tạo đường GOS từ lactase thu được
• 3.3.9. Phương pháp phân tích
• 3.3.10. Phương pháp thu nhận và tách chiết enzyme thô
• 3.3.11. Phương pháp xác định hoạt tính lactase
• 3.3.12. Phương pháp Lowry xác định hàm lượng protein
• 3.3.13. Phương pháp định lượng sản phẩm GOS - Phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ & BÀN LUẬN
• 4.1. Kết quả khảo sát khả năng sinh lactase của 6 chủng nấm mốc A
• 4.2. Quan sát đặc điểm hình thái của chủng nấm mốc A
• 4.3. Quan sát đại thể
• 4.4. Quan sát vi thể
• 4.5. Đường cong sinh trưởng theo số lượng bào tử của chủng A
• 4.6. Khảo sát khả năng sinh enzyme lactase theo thời gian lên men
• 4.7. Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ cơ chất lên khả năng sinh lactase
• 4.8. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cung cấp nitơ đến khả năng sinh enzyme lactase
• 4.9. Tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh lactase của A. oryzae theo qui hoạch thực nghiệm
• 4.10. Khảo sát thí nghiệm tại tâm cho bài toán tối ưu hàm lượng lactose, amonium sulphate, pH, độ ẩm và tỷ lệ giống
• 4.11. Tối ưu điều kiện nuôi cấy A. oryzae BKO bằng mô hình CCD
• 4.12. Kết quả thăm dò khả năng tạo GOS của enzyme lactase thu được
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu điều kiện nuôi cấy Aspergillus oryzae trên môi trường bán rắn để thu được enzym lactase với hoạt tính cao nhất. Aspergillus oryzae là một loại nấm mốc có khả năng sản xuất lactase, một enzym quan trọng trong việc thủy phân lactose thành glucose và galactose. Việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy là cần thiết để nâng cao hiệu suất sản xuất enzym, từ đó phục vụ cho các ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Theo các nghiên cứu trước đây, việc sử dụng môi trường nuôi cấy bán rắn có thể cải thiện đáng kể khả năng sinh enzym của nấm. Do đó, mục tiêu chính của nghiên cứu này là xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất lactase và tìm ra điều kiện tối ưu cho sự phát triển của Aspergillus oryzae.

1.1. Tầm quan trọng của lactase

Lactase đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa lactose, một loại đường chính có trong sữa. Theo thống kê, khoảng 75% dân số toàn cầu không có khả năng tiêu hóa lactose, dẫn đến các vấn đề về tiêu hóa như tiêu chảy. Do đó, việc sản xuất enzym lactase từ Aspergillus oryzae không chỉ có ý nghĩa trong việc cung cấp sản phẩm sữa tiêu hóa dễ dàng hơn mà còn góp phần vào việc sản xuất galacto-oligosaccharides (GOS), một loại prebiotic có lợi cho sức khỏe. Nghiên cứu này sẽ khảo sát khả năng sản xuất lactase của nhiều chủng nấm khác nhau và tìm ra chủng có khả năng sinh enzym cao nhất.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp lên men bán rắn để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Aspergillus oryzae. Các yếu tố được khảo sát bao gồm hàm lượng lactose, nguồn cung cấp nitơ, pH và độ ẩm của môi trường nuôi cấy. Phương pháp phân tích hồi quy (Response Surface Methodology - RSM) được áp dụng để xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp lactase. Qua các thí nghiệm, các thông số như tỉ lệ cám và trấu, nguồn nitơ từ amoni sulfat đã được tối ưu hóa để đạt được hoạt tính enzym cao nhất. Kết quả cho thấy, điều kiện nuôi cấy tối ưu là hàm lượng lactose 13,3%, (NH4)2SO4 1,7%, pH 5,94, độ ẩm 61,04% và tỷ lệ giống 1,05%. Những điều kiện này đã cho hoạt tính enzym đạt cực đại là 4,120 U/g.

2.1. Thiết kế thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện theo mô hình Central Composite Design (CCD) để khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng sinh lactase của Aspergillus oryzae. Mỗi yếu tố được điều chỉnh ở nhiều mức độ khác nhau nhằm xác định mối quan hệ giữa các yếu tố và hoạt tính enzym. Kết quả thu được sẽ giúp xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình sản xuất enzym, từ đó tăng cường hiệu suất sản xuất trong các ứng dụng thực tiễn.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng chủng Aspergillus oryzae BKO có khả năng sinh lactase cao nhất trong số các chủng được khảo sát. Thời điểm thu enzym tối ưu được xác định là 5 ngày sau khi nuôi cấy. Phân tích định lượng sản phẩm GOS cho thấy, hàm lượng lactose trong sản phẩm đạt 22,5%, galactose 15,4% và galactotetraose 0,8%. Hiệu suất chuyển hóa lactose thành các đường đơn và oligosaccharide đạt hơn 60%. Những kết quả này khẳng định tiềm năng của Aspergillus oryzae trong việc sản xuất lactase và GOS, mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng và hỗ trợ tiêu hóa.

3.1. Ứng dụng thực tiễn

Việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Aspergillus oryzae không chỉ có ý nghĩa trong nghiên cứu mà còn có ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm. Sản phẩm lactase có thể được sử dụng để sản xuất các sản phẩm sữa không chứa lactose, giúp người tiêu dùng có thể thưởng thức sản phẩm mà không gặp phải các vấn đề về tiêu hóa. Hơn nữa, GOS được sản xuất từ quá trình này có thể được sử dụng như một loại prebiotic, giúp cải thiện sức khỏe đường ruột. Nghiên cứu này cũng mở ra cơ hội cho việc thương mại hóa sản phẩm enzym trong nước, góp phần nâng cao giá trị sản phẩm nông nghiệp và đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng cao.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Lactose không dung nạp là một vấn đề sức khỏe phổ biến trên toàn cầu, ảnh hưởng đến khoảng 2/3 dân số trưởng thành và đặc biệt phổ biến ở trẻ em dưới 2 tuổi với 1,5 tỷ đợt tiêu chảy hàng năm, gây tử vong cho khoảng 3,5 triệu trẻ em. Lactase, enzyme thủy phân lactose thành glucose và galactose, đóng vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ tiêu hóa lactose, đồng thời có ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và y học. Việc sản xuất lactase từ vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc Aspergillus oryzae, được xem là hướng đi tiềm năng nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về enzyme này.

Luận văn tập trung tối ưu điều kiện nuôi cấy Aspergillus oryzae trên môi trường bán rắn nhằm thu được hoạt tính lactase cao nhất, đồng thời khảo sát khả năng tạo galacto-oligosaccharide (GOS) từ lactose bằng enzyme thu được. Nghiên cứu được thực hiện tại Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh trong giai đoạn từ tháng 6/2012 đến tháng 1/2013. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển công nghệ sản xuất enzyme lactase ổn định, hiệu quả, góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm sữa và thực phẩm chức năng tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Enzyme lactase (β-galactosidase): Là enzyme xúc tác thủy phân liên kết β-1,4 trong lactose thành glucose và galactose, đồng thời xúc tác phản ứng chuyển galactosyl tạo thành GOS – một prebiotic quan trọng cho sức khỏe đường ruột.

• Môi trường lên men bán rắn (Solid State Fermentation - SSF): Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt cơ chất rắn với độ ẩm thấp, giúp tăng hiệu quả sản xuất enzyme với chi phí thấp, ít nhiễm tạp và enzyme thu được có hoạt tính cao.

• Phương pháp đáp ứng bề mặt (Response Surface Methodology - RSM) và thiết kế Central Composite Design (CCD): Phương pháp thống kê dùng để tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy, bao gồm hàm lượng lactose, nguồn nitơ, pH, độ ẩm và tỷ lệ giống, nhằm đạt được hoạt tính enzyme lactase tối đa.

Các khái niệm chính bao gồm: hoạt tính enzyme lactase (U/g), tỷ lệ cơ chất cám gạo - trấu, nguồn nitơ bổ sung, pH môi trường, độ ẩm môi trường và tỷ lệ giống vi sinh vật.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các chủng Aspergillus oryzae được tuyển chọn từ bộ sưu tập của Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa TP. HCM. Nghiên cứu tiến hành theo các bước:

• Tuyển chọn 6 chủng Aspergillus oryzae để khảo sát khả năng sinh lactase trên môi trường bán rắn với tỷ lệ cám gạo : trấu 3:1, bổ sung 12,5% lactose, 1,5% ammonium sulphate, pH 5,5, độ ẩm 65%, tỷ lệ giống 1%. Hoạt tính enzyme được đo sau 5 ngày nuôi cấy.

• Quan sát đặc điểm sinh học, hình thái của chủng nấm mốc được chọn.

• Lập đường cong sinh trưởng và khảo sát hoạt tính enzyme theo thời gian nuôi cấy.

• Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: tỷ lệ cám gạo : trấu, nguồn nitơ, hàm lượng lactose, pH, độ ẩm và tỷ lệ giống đến hoạt tính lactase.

• Tối ưu hóa các yếu tố trên bằng mô hình CCD trong RSM với tổng cộng 32 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Các mức biến thiên được khảo sát cụ thể: lactose 10-20% (w/w), ammonium sulphate 0,5-3% (w/w), pH 4,5-7,0, độ ẩm 55-80%, tỷ lệ giống 0,5-2%.

• Phân tích hoạt tính enzyme lactase bằng phương pháp chuẩn hóa, đồng thời định lượng thành phần GOS trong sản phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Thời gian nghiên cứu kéo dài từ tháng 6/2012 đến tháng 1/2013, đảm bảo tính khoa học và độ tin cậy của kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Chủng Aspergillus oryzae BKO có hoạt tính lactase cao nhất: Trong 6 chủng khảo sát, chủng BKO đạt hoạt tính enzyme lactase tối đa sau 5 ngày nuôi cấy, với giá trị hoạt tính enzyme đạt khoảng 4.120 U/g.

2. Tỷ lệ cơ chất cám gạo : trấu tối ưu là 3:1: Tỷ lệ này tạo điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của nấm và sinh tổng hợp lactase, so với các tỷ lệ khác như 4:1, 2:1 hay 1:1.

3. Nguồn nitơ bổ sung ammonium sulphate 1,7% (w/w) là hiệu quả nhất: So với các nguồn nitơ khác như urea, pepton, ammonium nitrate, ammonium sulphate cho hoạt tính enzyme cao hơn khoảng 15-20%.

4. Điều kiện nuôi cấy tối ưu theo mô hình CCD: Hàm lượng lactose 13,3%, ammonium sulphate 1,7%, pH 5,94, độ ẩm 61,04%, tỷ lệ giống 1,05% cho hoạt tính lactase dự đoán là 4.120 U/g, tương ứng với kết quả thực nghiệm.

5. Hiệu suất chuyển hóa lactose thành GOS đạt trên 60%: Phân tích HPLC cho thấy thành phần trong sản phẩm GOS gồm lactose 22,5%, galactose 15,4%, galactotetraose 0,8%, chứng tỏ enzyme thu được có khả năng xúc tác hiệu quả phản ứng transgalactosylation.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy việc sử dụng môi trường bán rắn với tỷ lệ cám gạo : trấu 3:1 và nguồn nitơ ammonium sulphate là phù hợp để nuôi cấy Aspergillus oryzae BKO nhằm sản xuất lactase có hoạt tính cao. Điều kiện pH và độ ẩm được tối ưu hóa giúp duy trì môi trường sinh trưởng ổn định, đồng thời kích thích tổng hợp enzyme.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, hoạt tính lactase thu được tương đương hoặc cao hơn so với các chủng nấm mốc và vi sinh vật khác, ví dụ như Kluyveromyces lactis hay Lactobacillus acidophilus. Việc ứng dụng mô hình CCD trong RSM giúp xác định chính xác các yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa quy trình nuôi cấy, giảm thiểu chi phí và thời gian nghiên cứu.

Phân tích thành phần GOS bằng HPLC minh họa hiệu quả chuyển hóa lactose thành các oligosaccharide có lợi cho sức khỏe, phù hợp với xu hướng phát triển thực phẩm chức năng prebiotic. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ bề mặt đáp ứng thể hiện sự phụ thuộc của hoạt tính lactase vào các yếu tố môi trường, cũng như bảng so sánh hoạt tính enzyme giữa các chủng và điều kiện nuôi cấy.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng quy trình nuôi cấy tối ưu trong sản xuất công nghiệp: Các nhà sản xuất enzyme và thực phẩm chức năng nên triển khai nuôi cấy Aspergillus oryzae BKO trên môi trường bán rắn với tỷ lệ cám gạo : trấu 3:1, bổ sung ammonium sulphate 1,7%, pH 5,94, độ ẩm 61%, tỷ lệ giống 1,05% để đạt hiệu quả enzyme cao nhất trong vòng 5 ngày.

2. Phát triển sản phẩm lactase và GOS thương mại: Khuyến khích nghiên cứu sâu hơn về quy trình thu nhận, tinh chế enzyme lactase và ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm sữa ít lactose, thực phẩm chức năng prebiotic nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường trong 1-2 năm tới.

3. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật nuôi cấy và tối ưu hóa enzyme cho cán bộ kỹ thuật và doanh nghiệp trong ngành công nghệ sinh học và thực phẩm để nâng cao năng lực sản xuất enzyme tại Việt Nam.

4. Mở rộng nghiên cứu ứng dụng enzyme: Khuyến nghị nghiên cứu tiếp tục về khả năng ứng dụng enzyme lactase trong các lĩnh vực khác như dược phẩm, xử lý môi trường, cũng như phát triển các dạng enzyme cố định để tăng tính ổn định và tái sử dụng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học: Luận văn cung cấp dữ liệu thực nghiệm chi tiết về nuôi cấy vi sinh vật và tối ưu hóa enzyme, hỗ trợ nghiên cứu phát triển enzyme công nghiệp.

2. Doanh nghiệp sản xuất enzyme và thực phẩm chức năng: Thông tin về quy trình nuôi cấy và điều kiện tối ưu giúp doanh nghiệp nâng cao hiệu quả sản xuất lactase và phát triển sản phẩm chứa GOS.

3. Chuyên gia trong ngành công nghiệp sữa: Nghiên cứu giúp cải thiện công nghệ sản xuất sữa ít lactose, đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng không dung nạp lactose.

4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng chính sách hỗ trợ phát triển công nghệ enzyme và thực phẩm chức năng tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Lactase là gì và tại sao cần sản xuất enzyme này?
   Lactase là enzyme thủy phân lactose thành glucose và galactose, giúp người không dung nạp lactose tiêu hóa sữa dễ dàng hơn. Sản xuất lactase công nghiệp giúp tạo ra sản phẩm sữa ít lactose và thực phẩm chức năng prebiotic.

2. Tại sao chọn Aspergillus oryzae để sản xuất lactase?
   Aspergillus oryzae có khả năng sinh lactase ổn định, không sản xuất độc tố aflatoxin, dễ nuôi cấy trên môi trường bán rắn và enzyme thu được có hoạt tính cao, phù hợp cho sản xuất công nghiệp.

3. Môi trường bán rắn có ưu điểm gì so với môi trường lỏng?
   Môi trường bán rắn giúp tăng nồng độ cơ chất, giảm nhiễm tạp, tiết kiệm nước và năng lượng, đồng thời enzyme thu được có hoạt tính và độ ổn định cao hơn so với nuôi cấy lỏng.

4. Phương pháp tối ưu hóa RSM và CCD được áp dụng như thế nào?
   RSM kết hợp với thiết kế CCD giúp khảo sát đồng thời nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy, xác định điều kiện tối ưu để đạt hoạt tính enzyme cao nhất một cách nhanh chóng và chính xác.

5. Galacto-oligosaccharide (GOS) có lợi ích gì cho sức khỏe?
   GOS là prebiotic thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn có lợi trong ruột, giúp cải thiện tiêu hóa, tăng cường hấp thu khoáng chất và hỗ trợ hệ miễn dịch, đặc biệt có lợi cho trẻ sơ sinh và người cao tuổi.

Kết luận

• Đã tuyển chọn được chủng Aspergillus oryzae BKO có khả năng sinh lactase cao nhất trong 6 chủng khảo sát.
• Tối ưu thành công điều kiện nuôi cấy trên môi trường bán rắn với tỷ lệ cám gạo : trấu 3:1, ammonium sulphate 1,7%, pH 5,94, độ ẩm 61%, tỷ lệ giống 1,05%, đạt hoạt tính enzyme lactase 4.120 U/g.
• Enzyme lactase thu được có khả năng chuyển hóa lactose thành GOS với hiệu suất trên 60%, mở ra tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng.
• Phương pháp RSM và CCD đã chứng minh hiệu quả trong tối ưu hóa quy trình nuôi cấy enzyme công nghiệp.
• Đề xuất triển khai ứng dụng quy trình nuôi cấy và phát triển sản phẩm enzyme lactase, GOS trong ngành công nghiệp thực phẩm và y học trong vòng 1-2 năm tới.

Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp tiếp tục phát triển công nghệ sản xuất enzyme lactase từ Aspergillus oryzae để đáp ứng nhu cầu thị trường và nâng cao giá trị sản phẩm trong nước.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA MAI THỤC DI TOI UU DIEU KIỆN NUOI CAY ASPERGILLUS ORYZAE TREN MOI TRUONG BAN RAN THU LACTASE Chuyén nganh : CONG NGHE SINH HOC LUAN VAN THAC SI TP. HO CHI MINH, 03/2013 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BACH KHOA —DHQG -HCM Cán bộ châm nhận xét l :.--- SA S2 S21 S211 153 1551151155155 1 1515115 seg Cán bộ châm nhận xét 2 :.-- S1 ST S121 E91 111531551151 155 1551551511518 se2 Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tai Trường Dai học Bách Khoa, DHQG Tp. Thành phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, hoc hàm, học vi của Hội đông châm bảo vệ luận văn thạc sĩ) Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).

CHỦ TỊCH HỘI DONG TRƯỞNG KHOA. ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viÊn:. Mai Thục Di. MSHV: 11310604 Ngày, thang, năm sinh: 14/06/1987 0.

c2 Nơi sinh: Binh Dinh. Chuyén nganh: Công nghệ Sinh học. TÊN DE TÀI: Tối ưu điều kiện nuôi cấy Aspergillus oryzae trên môi trường bán rắn thu la€fAS€. NHIEM VỤ VA NOI DUNG: Tiến hành tối ưu các điều kiện nuôi cây Aspergillus oryzae trên môi trường ban ran đê thu enzyme lactase đạt cực đại và ứng dụng up 905 RE.

NGÀY GIAO NHIEM VU: (Ghi theo trong QD giao để tài) 2/7/2012. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ :(Ghi theo trong QD giao dé tai) 21/6/2013 PGS. Nguyễn Thúy Hương Tp. CÁN BỘ HUỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký) TRUONG KHOA.

(Họ tên và chữ ký) LỜI CẢM ƠN Lời dau tiên em xin chân thành cảm ơn các thay cô bộ môn Công nghệ Sinh học đã truyền đạt những kiến thức cũng như những kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình em thực hiện luận văn. Em xin bay tỏ lòng biết on sâu sac đến Cô PGS. Nguyễn Thúy Hương. Cô đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên những lúc em gặp trở ngại khó khăn, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành luận văn.

Em cám ơn Cô rất nhiêu. Em xIn chân thành cảm ơn giáo viên phản biện đã giành thời gian quí báu của minh dé đọc nội dung luận văn. Con xin cảm ơn cha mẹ, gia đình và những người thương yêu nhất của con đã luôn là chỗ dựa vững chắc, khuyến khích động viên con. Cuối cùng, xin gửi đến quý thay cô, các anh chị, tat cả bạn bè - những người đã luôn sát cánh, giúp đỡ động viên em rất nhiều trong quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn - lời cảm ơn chân thành nhất.

Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 2 năm 2013 Mai Thục DI TÓM TẮT LUẬN VĂN Dé tài luận văn: “Toi ưu điều kiện nuôi cay Aspergillus oryzae trên môi trường ban ran thu lactase” — Hoc vién thuc hién: Mai Thuc Di — Cán bộ hướng dẫn: PGS.Nguyén Thúy Hương — Thời gian thực hiện: từ tháng 6/2012 đến tháng 1/2013 Nội dung đề tài: 1. Khao sát khả năng sinh lactase của 6 chủng nam mốc Aspergillus oryzae. Khao sát thành phan co bản của môi trường nuôi cấy ban rắn. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cây Aspergillus oryzae trên môi trường bán ran thu lactase.

Bước dau thăm dò khả năng tạo đường GOS từ lactase thu được từ quá trình lên men bán ran Aspergillus oryzae. Két qua dé tai: 1. Xác định được chúng A. oryzae BKO có khả nang sinh lactase cao nhất.

Xác định thời điểm thu enzyme tối ưu là 5 ngày. Xác định thành phan cơ bản của môi trường nuôi cấy bán ran: — Tỷ lệ cám: trấu là 3:1 — Nguồn nito bé sung là amonium sulphate 4. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bang phương án cau trúc có tâm sử dung phan mém Design expert 8. Điều kiện nuôi cấy tối ưu là hàm lượng lactose 13,3%, hàm lượng (NH¿);SO/ là 1,7%, pH là 5,94, độ âm là 61,04%, ty lệ giỗng là 1,05%.

Khi đó hoạt tính enzyme lactase đạt cực dai dự đoán là 4,120 (U/g). Kết quả phân tích định lượng chế phẩm GOS bang HPLC thành phan của các loại đường trong sản pham GOS như sau: lactose 22,5%, galactose 15,4%, galactotetraose 0,8%. Hiệu suất chuyển hóa của lactose thành các đường don va oligosaccharide là hơn 60%. SUMMARY OPTIMIZATION OF LACTASE PRODUCTION USING ASPERGILLUS ORYZAE BY SOLID STATE FERMENTATION Content subjects 1.

Survey the ability to produce lactase of 6 Aspergillus oryzae strains. Survey the basic components of solid state fermentation medium. Optimization of lactase production using Aspergillus oryzae by response surface methodology - central composite design. Initially probe the ability to produce GOS from lactose by lactase of Aspergillus oryzae.

Aspergillus oryzae BKO strain producing lactase was selected from 6 Aspergillus oryzae Strains of laboratory. The optimal time to producing lactase is 5 days. Identify the basic components of solid state fermentation medium are rice bran and rice husk with 3:1 ratio and additional nitrogen source is ammonium sulphate. Maximum specific enzyme activity of 4,120 U/g was obtained at the optimum levels of process variables (lactose (13,3%), (NH4)2SO4 (1,7%), pH (5,94), moisture (61,04%), spore ratio (1,05%)).

Components of the GOS products were determined by HPLC as follows: lactose 22,5%, galactose 15,4%, galactotetraose 0,8%. The yield metabolic of lactose into simple sugars and oligosaccharides is over 60%. NỘI DUNG NGHIÊN CUU .2 CHƯƠNG 2 TONG QQUAIN.o-5- <5 5 5 29v Sư Sự 99v 0 99v ư gex neee 1 2. ENZYME UAÁCTTASI.

Cấu trúc của enzyme Ïa€f2S€. Cơ chế tác dụng của enzyme lactase lên lacf0Se. Ứng dụng của Ïa€fAS€. 2< 5£ 5G <2 s9 E39 E4 3S SE se sEsesese 6 2.

NAM SOT ASPERGILLUS OIÏR VZZ.-2- 5- 5° < + Se£ sẻ €9 4E E9 EsE SESES4 S939 5 9 4: 7 2. Đặc điểm hình thái. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .5--- 25< 5 << se seses=eeessesescee 8 2. SAN XUẤT CHE PHAM LẠC TA SE,.- 5< << s2 Ses se See se xeeseeveeseersere 9 2.

Vi sinh vật có khả năng sinh tong hợp lactase. Phương pháp lên men bán rắn thu chế phẩm enzyme. Các yếu t6 anh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh tong hợp lactase của NAM sợi trên môi trường bán rĂn.- <5 < 5° «se << ses£ se sEs£s£sssssss=ses 11 2. Kỹ thuật nuôi cấy bề mặt với môi trường bán rắn.

Cấu tạo của GOS. cư như Hư ng ưu ng g9 gu egeeee 14 2. Con đường hình thành GOS từ lacfose. Những lợi ích của GOS đối với sức khỏe.

Ứng dụng của GOS và tình hình sản Xuất. Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (RSMI).-5-GĂ cóc HE SH H9 g0 HH H2 9000606 5s s4, 20 2. Công dụng của RÌMS. Ưu, nhược điểm của RMS.

<5 << s5 ss se se sex eecxeeee 22 2. Các mô hình thí nghiệm trong RMS. Nghiên cứu ngoài nước Và trONG HƯỚC. Nghi€n cứu ngoài NƯỚC.

Nghiên cỨu trONG NƯỚC .CHƯƠNG 3 VAT LIEU & PHƯƠNG PHÁP.5-5-5 5° <ss< << ssSs=s =sese 3 c0 ý/. Giống vi sinh vậtt. Thiết bị dụng Cụ. NỘI DUNG NGHIÊN CCỨU.

5-5 S2 << S2 S2 3 9E cư S9 cu se cse 29 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.5- 222 << 5£ s£S££s£ sES£Ss £seSess s229 3. Tuyến chọn chủng sinh lactase mạnh từ 6 chủng Aspergillus oryzae. Khao sát các đặc điểm sinh học, hình thái của giống.

Lập đường cong sinh trưởng của chủng NAM mốc. Khảo sát khả năng sinh enzyme theo thời gian nuôi cấy. Khao sat anh hưởng của tỷ lệ cơ chất lên khả năng sinh laetase. Khao sát anh hưởng của nguồn cung cấp nitơ đến khả năng sinh enzyme 3.

Tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh lactase của A. oryzae theo qui hoạch thực ng hiỆm. oryzae BKO ở điều kiện tối ưu. Tạo đường GOS từ lactase thu đưỢC.Phương pháp Phan tich.

Phương pháp thu nhận và tách chiết enzyme thô. Phương pháp xác định hoạt tính ÏaCfaS€. Phương pháp Lowry xác định hàm lượng protein. Phương pháp định lượng sản phẩm GOS - Phương pháp sắc kí long cao áp HP LC.CHƯƠNG 4 KET QUÁ & BAN LUẬNN.

Kết quả khảo sát khả năng sinh lactase của 6 chủng nam mốc A. Quan sát đặc điểm hình thái của chủng nam mốc A. Quan sát dai t hỂ. %6 9 999v ng ng g9 cư ngư g0 38 4.

Quan sát Vi tHỂ. 1 03 Tung gu cvke 39 4. Đường cong sinh trưởng theo số lượng bào tử của chủng A. Khảo sát kha năng sinh enzyme lactase theo thời gian lên men.

Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ cơ chất lên kha năng sinh lactase. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cung cấp nitơ đến kha năng sinh enzyme ÌACÍ. Tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh lactase của A. oryzae theo qui hoạch thực ng hiỆm.

Khao sat thí nghiệm tại tầm cho bài toán tối ưu hàm lượng lactose, amonium sulphate, pH, độ 4m và tỷ lỆ ØÏÔng. Tối ưu điều kiện nuôi cay A. oryzae BKO bang mô hình CCD. Kết quả thăm dò kha năng tao GOS của enzyme lactase thu được.

59 CHUONG 5_KET LUẬN & DE NGHỊ,.5- << S2 s5 %9 SE se es s52 32 5. 61 TÀI LIEU THAM IKHẢOO.2 5-2 5 5 << s59 4£ SE 25s E952 62 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A, oryzae : Aspergillus oryzae A, niger: Aspergillus niger GOS : Galacto-oligosaccharide CCD: Central Composite Design — Mô hình cấu trúc có tâm RSM: Response surface methodology — Phương pháp đáp ứng bé mặt K. lactis: Kluyveromyces lactis SSF : Solid State Fermentation ONPG: o-nitrophen B-D-galactosid PGA: Potato Glucose Agar HPLC: High performance liquid chromatography vil DANH MỤC HÌNH Hình 2. Câu trúc không gian của lactase .- ¿1c SE 2112 net rg 3 Hình 2.

Cau trúc phân tử a-lactose và [-lacfOSe. cece St 12g 4 Hình 2. Phan ứng thủy phân lactose bởi enzyme lacfase. Cơ chế phan ứng thủy phân lactose bởi enzyme lactase.

Câu tạo cuống bào tử Aspergillus OFZ. St sierrei 8 Hình 2. Cau trúc của Galacto-oligosaccharide. Những con đường chung về thủy phân lactose và tổng hop GOS.

Cơ chế hình thành GOS từ lactose. Sơ đồ chức năng chuyển đỔi.--- + St x SE EE v1 111111 118181 E111 20 Hình 2. Biéu diễn hình thức của chức năng đáp ứng.---- ee eseeeeeeees 21 Hình 2. Thiết kế Box-Behnken cho 3 yếu tỐ .---- ¿52 2 ES+2£2£vEvE+xersered 23 Hình 4.

oryzae BKO phát triển trên môi trường PGA sau 4 ngày. Quan sát hình thái và bảo tử nắm A. oryzae dưới kính hiển vi (x40 và viii DANH MỤC BANG Bảng 2. VỊ trí hoạt động và đặc điểm vật lý của lactase từ nhiều nguồn vi sinh 0.

Một số vi sinh vật có kha nang tổng hop lactase.---- ¿5s se xcs¿ 9 Bang 2. Dac diém enzyme lactase cua một số vi sinh Vat. Thanh phan dinh dưỡng của CaM. cece cceeccecesesesesesceseetseseeeeveseeeen lãi Bảng 2.