LỜI MỞ ĐẦU Công nông nghiệp ngày càng phát triển, lượng chất hữu cơ thải ra càng nhiều. Tận dụng phụ phế liệu này làm nguồn carbon để sản xuất enzym cellulase bằng cách nuôi cấy nấm sợi trên môi trường lên men bán rắn đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam. Cơ chất thường được sử dụng nhiều nhất là bã mía, bã mì, do có hàm lượng cellulose cao. Đây là cơ chất rẻ tiền và ổn định nên có tiềm năng sử dụng để sản xuất cellulase ở quy mô lớn.
Việt Nam là một nước nhiệt đới, có nền nông nghiệp khá phong phú, đa dạng và đang trên đà phát triển. Lượng phế phẩm và phụ phẩm nông nghiệp, công nghiệp cũng rất dồi dào nhưng lại không nhận được sự quan tâm đúng mức. Theo đó chất thải hữu cơ cũng tăng lên rất nhiều. Trong đó phụ liệu của ngành sản xuất tinh bột khoai mì là một ví dụ điển hình và chiếm khoảng ½ khoai nguyên liệu.
Nếu công suất nhà máy tinh bột khoai mì là 200 tấn/ ngày thì mỗi ngày nhà máy thải ra môi trường khoảng 20 tấn bã khoai mì gây ô nhiễm nghiêm trọng chính vì thế đã và đang có nhiều hướng giải quyết lượng bã khoai mì sau sản xuất như phơi khô làm thức ăn gia súc nhưng chưa khả thi do không thực sự đảm bảo nguồn dinh dưỡng, và không tận dụng triệt để nguồn phế phẩm. Nguồn phế phẩm này để lâu sẽ bị vi sinh vật tấn công gây hư hỏng tạo mùi khó chịu gây ô nhiễm môi trường và hao tốn diện tích. Trong bã khoai mì có hàm lượng cellulose cao nên ta có thể tận dụng bã khoai mì như nguồn cacbon để cảm ứng cho vi sinh vật tổng hợp enzym cellulase. Cellulase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, trong nông nghiệp enzym này dùng chế biến thức ăn cho vật nuôi, bên cạnh đó chúng còn được ứng dụng cho sản xuất phân hữu cơ.
Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase là tác nhân thủy phân nguyên liệu giàu cellulose (rơm, rạ, gỗ vụn, mạt cưa, dăm bào…) để tạo thành glucose, mật đường thay thế dần cho thủy phân bằng acid. Việc tinh sạch enzym cellulase là một trong những bước tiến quan trọng của lĩnh vực công nghệ enzym. Kỹ thuật này đã công cấp lượng enzyme sạch phục vụ cho rất nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong y học. Nắm bắt được nhu cầu của thị trường tôi tiến hành nghiên cứu việc thu nhận và tinh sạch sơ bộ enzym cellulase từ canh trường nuôi cấy Trichodema viride trên bã khoai mì.
Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài này chúng tôi cố gắng giải quyết các vấn đề sau: SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 1 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước - Chọn chủng nấm mốc thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase. - Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase. - Tách chiết enzym thô.
- Tinh sạch sơ bộ enzym thô. - Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến chế phẩm enzym sau khi tinh sạch sơ bộ. SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 2 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cellulose [16] 2.
Cấu tạo cellulose - Cellulose là polyanhydroglucose có mức độ trùng hợp khoảng 14000, có dạng hình sợi. Nhiều phân tử celluose liên kết với nhau tạo thành chùm gọi là micelle nhờ liên kết hydro. Mỗi mixen thường có khoảng 60 phân tử cellulose. Sợi cellulose không hòa tan chính là do các phân tử cellulose được xếp song song, sát lại với nhau và phía ngoài được bao bằng lớp vỏ chung có chứa sáp và pectin.1: Hàm lượng cellulose trong một số loại thực vật Stt Loài thực vật Cellulose (%) 1 Tế bào nhu mô ở lá 15-20 2 Cây một lá mầm 25-40 3 Cây hạt trần 45-50 4 Cây hạt kín 40-55 5 Sợi bông 80-95 - Nghiên cứu cấu trúc Rontgen người ta thấy rằng trong cellulose có xen kẻ các phần tinh thể và vô định hình.
Ở những phần tinh thể, các mạng cellulose kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối với hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl của carbon thứ ba của mạch khác. Những phần vô định hình thì các mạch tập hợp lại với nhau nhờ lực Van der Waals. SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 3 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước Hình 2.1: Cấu tạo của phân tử cellulose - Trong phân tử cellulose có nhiều nhóm hydroxyl tồn tại ở dạng tự do, hydro của chúng dễ dàng bị thay thế bởi một số gốc hóa học ví dụ như metyl, hoặc các gốc acetyl hình thành nên các gốc ete hoặc este của cellulose.
Mặt khác, cũng có nhiều dẫn xuất của cellulose có ý nghĩa quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp. Ví dụ như các dẫn xuất nitrocellulose, acetylcellulose trong kỹ nghệ sợi nhân tạo, da nhân tạo, kỹ nghệ chất nổ, chất dẻo. Đặc biệt trong thời gian gần đây, các dẫn xuất cellulose như carboxymetyl cellulose, dietylaminoetyl cellulose được dùng rất hiệu quả trong các phương pháp sắc ký trao đổi ion để phân chia hỗn hợp protein. - Cellulose không có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng đối với con người nhưng ngược lại ở gia súc đó là nguồn cung cấp năng lượng chính yếu vì chúng có thể tiêu hóa cellulose một cách dễ dàng nhờ vi khuẩn cộng sinh trong dạ cỏ có khả năng tiết ra enzym cellulase để phân giải cellulose thành chất dinh dưỡng.
Đặc tính của cellulose 2. Tính chất vật lý - Cellulose là chất rắn không màu, không mùi, không vị, không tan trong nước ( chỉ phồng lên nếu hấp thụ nước), không tan trong các dung môi hữu cơ, không có trạng thái nóng chảy. Khi đun trong chân không thì bị phân hủy thành glucose. SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 4 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths.
Huỳnh Quang Phước - Cellulose bị phân hủy ở nhiệt độ thường hoặc nhiệt 40-500C do sự thủy phân cellulose bởi enzym cellulase. - Cellulose bị thủy phân khi đun nóng với acid hoặc kiềm ở nồng độ khá cao. - Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose, pectin và lignin. Điều này ảnh hưởng đến sự phân hủy cellulose của enzym cellulase.
Tính chất hóa học - Cellulose có thể hòa tan trong dd [ Cu(NH3)4] (OH)2, tan trong dung dịch H2SO4 đậm đặc. - Khi tác dụng với chất oxy hóa, mạch cellulose tạo thành hỗn hợp phức tạp. Tính bền hóa học của cellulose sau khi bị oxy hóa, khi bị tẩy trắng giảm đi nhiều. - Khi bị tác dụng với kiềm đặc, cellulose tạo thành sản phẩm tương tự ancolat gọi là muối cellulose kiềm, muối này dễ bị thủy phân cho ra cellulose ở dạng hydrat cellulose, dạng này giống cellulose về thành phần nhưng kém bền hơn, hút nước hơn, dễ nhuộm hơn.
- Cellulose còn có tác dụng với anhydric acetic tạo sợi diacetat hay tác dụng với acid nitrit tạo ra nitro cellulose có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thuốc nổ. Giới thiệu sơ lược về enzym [10,11] - Pavlov đã nói: “ hoạt động của enzym là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống. Không có sự sống nào lại không có quá trình enzym”. Điều này càng làm sáng tỏ định nghĩa của Ăng- Ghen: “Sự sống đó chính là phương thức tồn tại của thể protein”.
Như vậy enzym có bản chất là protein có hoạt tính xúc tác chỉ được tạo thành trong tế bào sinh vật. - Trong cơ thể sinh vật, các phản ứng sinh hóa được xảy ra liên tục. Nhờ có phản ứng như thế các cơ thể sinh vật mới tồn tại và phát triển được. Thực hiện và điều khiển các phản ứng này lại hoàn toàn do enzym.
- Enzym có mặt trong mọi mô, mọi tế bào, nhưng mỗi tế bào, mỗi loại mô thường có những hệ thống enzym đặc biệt, và cùng một enzym có trong các mô khác nhau hoặc thậm chí ở các bộ phận khác nhau của cùng một loại tế bào cũng có thể khác nhau về lượng và có khi cả về chất. - Các loại enzym trong cơ thể được tổng hợp, hoạt động một cách rất hài hòa để sao cho các chất ban đầu được chuyển hóa đến sản phẩm cuối cùng thành một mắt xích hoàn SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 5 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước chỉnh. Sự trục trặc nào đó ở trong toàn bộ mắt xích này sẽ làm cho rối loạn cả hệ thống.
Trong khi đó điều khiển tổng hợp và hoạt động của enzym lại do gen. - Các enzym không chỉ tham gia các phản ứng xúc tác sinh hóa trong cơ thể vi sinh vật mà còn tham gia các phản ứng ngoài cơ thể do quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Quá trình trao đổi chất này được sự tham gia của các enzym tạo ra được các sản phẩm. Các sản phẩm trao đổi chất được chia thành hai loại: loại sản phẩm trao đổi chất bậc 1 (các sản phẩm phục vụ trực tiếp trong xây dựng tế bào) và loại trao đổi chất bậc 2 (các sản phẩm trao đổi chất hoặc dư thừa hoặc không tham gia trực tiếp vào quá trình xây dựng tế bào).
- Các enzym xúc tác hầu hết cho các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống. Bảo đảm cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng cân đối, theo những chiều hướng xác định. Enzym đảm bảo cho sự thay đổi thường xuyên giữa cơ thể sống và môi trường ngoài, nghĩa là đảm bảo tiên quyết cho sự tồn tại của cơ thể sống. - Enzym không những hoạt động xúc tác trong tế bào mà còn ngoài tế bào vi sinh vật, chính điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng enzym vào nhiều lĩnh vực khác của công nghiệp và đời sống.
- Enzym có hiệu suất xúc tác cực kì lớn, hoạt động xúc tác của enzym lớn gấp hàng trăm hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác. Ví dụ như trong phản ứng thủy phân saccharose nếu dùng saccharase làm xúc tác tốc độ phản ứng tăng gấp 2x1012 lần so với khi dùng acid làm chất xúc tác. - Điều quan trọng là enzym có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thể, pH môi trường gần pH sinh lý. Hơn nữa enzym lại có khả năng lựa chọn cao đối với phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng.
- Vì enzym là những chất không thể chế biến được bằng phương pháp tổng hợp hóa học nên người ta thường thu chúng từ các nguồn sinh học. Enzym có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật.