Tách Chiết Và Tinh Sạch Enzym Cellulase Từ Trichoderma Viride

Nghiên cứu tách chiết và tinh sạch enzym cellulase từ Trichoderma viride

• Tác giả: Huỳnh Thị Hồng Sương
• Người hướng dẫn: Ths. Huỳnh Quang Phước
• Trường học: Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. Hcm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm
• Đề tài: Tách Chiết Và Tinh Sạch Enzym Cellulase Từ Trichoderma Viride
• Loại tài liệu: Đồ Án Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2009
• Địa điểm: Tp. Hcm

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: LỜI MỞ ĐẦU
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu về cellulose
• 2.2. Cấu tạo cellulose
• 2.3. Đặc tính của cellulose
• 2.4. Giới thiệu sơ lược về enzym
• 2.5. Giới thiệu về enzym cellulase
• 2.6. Vi sinh vật tổng hợp cellulase
• 2.7. Vai trò của giống trong công nghệ sản xuất enzym
• 2.8. Yêu cầu của giống trong công nghệ sản xuất enzym
• 2.9. Nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp cellulase
• 2.10. Sinh tổng hợp enzym cảm ứng
• 2.11. Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến quá trình STH cellulase
• 2.12. Giới thiệu phương pháp lên men bề mặt
• 2.13. Ưu nhược điểm của phương pháp lên men bề mặt
• 2.14. Phương pháp lên men thu nhận enzym từ T.
• 2.15. Tách và tinh sạch chế phẩm enzym
• 2.16. Ứng dụng của cellulase
• 2.17. Tăng chất lượng các sản phẩm thực phẩm và thức ăn gia súc
• 2.18. Thủy phân gỗ và các phế liệu gỗ
• 2.19. Phá vỡ thành tế bào
• 3. CHƯƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nguyên vật liệu
• 3.2. Giống vi sinh vật
• 3.3. Môi trường nuôi cấy
• 3.4. Thiết bị nghiên cứu
• 3.5. Các phương pháp nghiên cứu
• 3.6. Phương pháp phân tích hóa lý, hóa sinh
• 3.7. Phương pháp phân tích vi sinh
• 3.8. Bố trí thí nghiệm
• 3.9. Thí nghiệm 1- Khảo sát một số chỉ tiêu của nguyên liệu
• 3.10. Thí nghiệm 2- Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy đến khả năng STH cellulase
• 3.11. Thí nghiệm 3- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng STH cellulase
• 3.12. Thí nghiệm 4- Khảo sát tỷ lệ nước cất và đệm acetate tối ưu để tách chiết enzym
• 3.13. Thí nghiệm 5- Khảo sát tỷ lệ cồn, aceton, muối để tủa enzym
• 3.14. Thí nghiệm 6- Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của chế phẩm enzym
• 3.15. Thí nghiệm 7- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của chế phẩm
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 4.1. Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu của bã khoai mì
• 4.2. Kết quả chọn chủng có hoạt lực cellulase mạnh
• 4.3. Kết quả lựa chọn sơ bộ bằng thạch đĩa
• 4.4. Kết quả lựa chọn bằng phương pháp lên men định lượng hoạt độ cellulase
• 4.5. Kết quả sát định đường cong tăng trưởng của nấm mốc T.
• 4.6. Kết quả ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của T.
• 4.7. Kết quả ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
• 4.8. Kết quả nghiên cứu tỷ lệ nước cất và đệm acetate tối ưu để tách chiết enzym
• 4.9. Kết quả khảo sát tỷ lệ nước cất tối ưu để chiết enzym
• 4.10. Kết quả khảo sát tỷ lệ acetate tối ưu để chiết enzym
• 4.11. Kết quả hoạt tính cellulase của dịch chiết thô
• 4.12. Kết quả nghiên cứu quá trình tinh sạch enzym bằng phương pháp tủa
• 4.13. Kết quả khảo sát tỷ lệ cồn dùng để tủa enzym
• 4.14. Kết quả khảo sát tỷ lệ aceton dùng để tủa enzym
• 4.15. Kết quả khảo sát tỷ lệ muối ammonium sulfate dùng để tủa enzym
• 4.16. So sánh kết quả của 3 phương pháp tủa
• 4.17. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến chế phẩm enzym cellulase
• 4.18. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến chế phẩm enzym cellulase
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Giới thiệu về enzym cellulase

Enzym cellulase là một trong những enzym quan trọng nhất trong quá trình phân giải cellulose, một polysaccharide chính trong thành tế bào thực vật. Cellulase có khả năng thủy phân cellulose thành glucose, cung cấp nguồn năng lượng cho nhiều sinh vật, đặc biệt là vi sinh vật và động vật nhai lại. Việc tách chiết và tinh sạch enzym cellulase từ các nguồn vi sinh vật như Trichoderma viride đã trở thành một lĩnh vực nghiên cứu được quan tâm. Cellulase được chia thành nhiều loại khác nhau, bao gồm endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase, mỗi loại có vai trò riêng trong quá trình phân giải cellulose. Việc hiểu rõ về cấu trúc và chức năng của các loại enzym này là cần thiết để tối ưu hóa quá trình sản xuất và ứng dụng của chúng trong công nghiệp thực phẩm và sinh học.

1.1. Cấu tạo và đặc tính của cellulase

Cellulase là một hệ enzym phức tạp, thường được tổng hợp từ các vi sinh vật như nấm mốc và vi khuẩn. Cấu trúc của cellulase bao gồm nhiều tiểu đơn vị protein, giúp enzym có khả năng hoạt động hiệu quả trong môi trường có pH và nhiệt độ khác nhau. Tính chất cellulase rất đa dạng, ảnh hưởng bởi nguồn gốc vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy. Các yếu tố như độ ẩm, nhiệt độ và pH đều có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym. Đặc biệt, cellulase có khả năng hoạt động tốt trong môi trường kiềm và ở nhiệt độ cao, điều này làm cho chúng trở thành lựa chọn lý tưởng cho nhiều quy trình công nghiệp.

II. Quá trình tách chiết enzym

Quá trình tách chiết enzym cellulase từ Trichoderma viride bao gồm nhiều bước quan trọng. Đầu tiên, nấm mốc được nuôi cấy trong môi trường giàu cellulose, thường là bã khoai mì, để kích thích sự sinh tổng hợp enzym. Sau khi thu hoạch, dịch chiết thô được thu được bằng cách sử dụng các phương pháp tách chiết như chiết bằng nước cất hoặc dung môi hữu cơ. Các yếu tố như tỷ lệ nước cất và đệm acetate tối ưu cần được khảo sát để đạt được hiệu suất tách chiết cao nhất. Sau đó, enzym thô cần được tinh sạch để loại bỏ các tạp chất không cần thiết, thường thực hiện qua các bước tủa bằng cồn hoặc muối ammonium sulfate. Quá trình này không chỉ giúp tăng độ tinh khiết của enzym mà còn nâng cao hoạt tính của nó.

2.1. Phương pháp tách chiết

Các phương pháp tách chiết enzym cellulase từ Trichoderma viride có thể được phân loại thành hai nhóm chính: phương pháp vật lý và phương pháp hóa học. Phương pháp vật lý bao gồm việc sử dụng áp suất hoặc nhiệt độ để tách chiết enzym, trong khi phương pháp hóa học thường sử dụng dung môi hoặc hóa chất để hòa tan và tách enzym. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng dung môi như ethanol hoặc aceton có thể tạo ra enzym có hoạt tính cao hơn so với phương pháp tách chiết bằng nước. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc tối ưu hóa quy trình sản xuất enzym cho các ứng dụng công nghiệp.

III. Tinh sạch enzym

Tinh sạch enzym là một bước quan trọng trong quy trình sản xuất enzym cellulase. Sau khi tách chiết, enzym thô thường chứa nhiều tạp chất, ảnh hưởng đến hoạt tính và độ ổn định của enzym. Các phương pháp tinh sạch phổ biến bao gồm tủa bằng ammonium sulfate, sắc ký trao đổi ion và sắc ký gel. Tủa bằng ammonium sulfate là phương pháp đơn giản và hiệu quả, giúp loại bỏ nhiều tạp chất trong dịch chiết. Sau khi tủa, enzym cần được rửa và hòa tan lại trong dung dịch đệm để đạt được hoạt tính tối ưu. Việc kiểm tra hoạt tính enzym sau khi tinh sạch là cần thiết để đảm bảo rằng enzym vẫn giữ được khả năng xúc tác của mình.

3.1. Ứng dụng của cellulase

Cellulase có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau, bao gồm công nghiệp thực phẩm, sản xuất năng lượng sinh học và xử lý chất thải. Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase được sử dụng để cải thiện chất lượng sản phẩm, tăng cường khả năng tiêu hóa và thu hồi đường từ các nguyên liệu giàu cellulose. Ngoài ra, cellulase cũng được ứng dụng trong quá trình sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu thực vật, giúp tối ưu hóa quy trình chuyển hóa sinh học. Từ đó, việc nghiên cứu và phát triển quy trình tách chiết và tinh sạch enzym cellulase từ Trichoderma viride không chỉ có giá trị về mặt khoa học mà còn mang lại lợi ích kinh tế lớn cho ngành công nghiệp.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sự phát triển của ngành công nghiệp chế biến nông sản tại Việt Nam tạo ra khối lượng phế phụ phẩm hữu cơ rất lớn. Theo số liệu thống kê được tác giả trích dẫn, diện tích trồng khoai mì tại Việt Nam đạt gần 300.000 ha với năng suất bình quân 9–10 tấn/ha, cung cấp sản lượng gần 3 triệu tấn củ/năm. Trong quy trình sản xuất tinh bột khoai mì, lượng bã thải chiếm khoảng 50% khối lượng nguyên liệu củ tươi (tương đương hơn 1 triệu tấn bã/năm). Một nhà máy có công suất chế biến 200 tấn củ/ngày có thể thải ra từ 20 đến 120 tấn bã tươi mỗi ngày. Nguồn phụ phẩm này có độ ẩm cao, dễ bị vi sinh vật xâm nhiễm gây thối rữa, tạo mùi hôi và ô nhiễm môi trường nghiêm trọng nếu không được xử lý kịp thời. Các giải pháp truyền thống như phơi khô làm thức ăn gia súc bộc lộ nhược điểm là giá trị dinh dưỡng thấp và chưa tận dụng triệt để giá trị sinh học của bã sắn.

Do bã khoai mì chứa hàm lượng cellulose cao (khoảng 19% chất khô) cùng một phần tinh bột sót lại, đây là nguồn cơ chất rẻ tiền và ổn định để làm nguồn carbon cảm ứng cho vi sinh vật tổng hợp enzym cellulase. Cellulase là phức hệ enzym có giá trị ứng dụng lớn trong chế biến thức ăn chăn nuôi, sản xuất phân bón hữu cơ, thủy phân sinh khối thực vật tạo đường lên men ethanol sinh học, tách chiết hoạt chất và công nghiệp tẩy rửa. Việc thu nhận và tinh sạch sơ bộ cellulase từ canh trường vi sinh vật giúp nâng cao hoạt tính riêng và mở rộng phạm vi ứng dụng của chế phẩm.

Khóa luận xác định mục tiêu tổng quát là nghiên cứu quy trình thu nhận và tinh sạch sơ bộ enzym cellulase từ canh trường nuôi cấy nấm sợi Trichoderma viride trên cơ chất bã khoai mì theo phương pháp lên men bề mặt (bán rắn). Nhiệm vụ nghiên cứu được cụ thể hóa thành 5 nội dung:

1. Tuyển chọn chủng nấm mốc thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase giữa Trichoderma viride và Aspergillus oryzae.
2. Khảo sát các yếu tố công nghệ ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase (độ ẩm ban đầu của môi trường và thời gian nuôi cấy).
3. Khảo sát điều kiện tách chiết enzym thô từ canh trường lên men (loại dung môi và tỷ lệ dung môi chiết).
4. Khảo sát quá trình tinh sạch sơ bộ dịch chiết enzym thô bằng phương pháp kết tủa phân đoạn (sử dụng ethanol lạnh, acetone lạnh và muối ammonium sulfate).
5. Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (pH và nhiệt độ) đến hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzym sau tinh sạch sơ bộ.

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng nấm mốc Trichoderma viride (đối chứng với Aspergillus oryzae); cơ chất bã khoai mì thu nhận từ nhà máy chế biến tinh bột khoai mì tại tỉnh Tây Ninh; phức hệ enzym cellulase sinh tổng hợp từ quá trình lên men.
• Phạm vi nghiên cứu: Các thí nghiệm nuôi cấy, phân tích hóa sinh, tách chiết và tủa protein được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ TP. Hồ Chí Minh; thời gian hoàn thành vào tháng 08 năm 2009.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và mô hình sinh hóa

Khóa luận tổng quan chi tiết về cơ sở lý thuyết của cơ chất cellulose và hệ enzym phân giải:

• Cấu trúc phân tử cellulose: Polyanhydroglucose mạch thẳng gồm các đơn vị $\beta$-D-glucopyranose liên kết với nhau qua liên kết $\beta$-1,4-glucosid với độ trùng hợp khoảng 14.000. Các chuỗi polymer liên kết song song nhờ liên kết hydro tạo thành các micelle và sợi vi thể (microfibril), xen kẽ giữa các vùng vô định hình và vùng tinh thể có độ bền hóa lý cao.
• Hệ enzym cellulase: Hệ enzym đa thành phần xúc tác quá trình thủy phân liên kết $\beta$-1,4-glucan, bao gồm ba nhóm enzym chính theo danh pháp của Hội Sinh học Phân tử và Sinh hóa Quốc tế (IUBMB):
  • Endoglucanase (EC 3.2.1.4, tên khác: endo-$\beta$-1,4-glucanase, $C_x$): phân cắt ngẫu nhiên các liên kết nội mạch $\beta$-1,4-glucosid tại các vùng vô định hình của sợi cellulose.
  • Exoglucanase / Cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91, tên khác: $C_1$, CBH1): thủy phân liên tiếp từ đầu không khử hoặc đầu khử của chuỗi cellulose để giải phóng cellobiose. Cấu trúc exoglucanase gồm 2 chuỗi peptide (A và B), mỗi chuỗi có 434 gốc acid amin, chứa 10 cầu disulfide, 1 nguyên tử $Ca^{2+}$ liên kết với các gốc Glu295 và Glu325.
  • $\beta$-Glucosidase (EC 3.2.1.21, tên khác: cellobiase): thủy phân cellobiose và các cellooligosaccharide mạch ngắn thành D-glucose.
• Cơ chế thủy phân cellulose: Tác giả phân tích các mô hình tương tác hiệp đồng của phức hệ cellulase theo lý thuyết của Wakabayasi & Nisizawa (1964), Mandels & Reese (1964), Iwasaki và cộng sự (1965), Ogawa & Toyama (1967).
• Lên men bán rắn (Solid-State Fermentation - SSF): Phương pháp nuôi cấy nấm sợi trên cơ chất rắn xốp được làm ẩm (độ ẩm 30–70%) không có dòng nước tự do, tạo điều kiện hiếu khí tự nhiên, phù hợp với đặc tính sinh học của Trichoderma viride và tạo nồng độ enzym thô cao.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu sử dụng kết hợp các phương pháp phân tích hóa lý, sinh hóa và vi sinh vật tiêu chuẩn:

• Phương pháp vi sinh: Nuôi cấy cấy chuyền và giữ giống trên môi trường Czapek-agar; khảo sát đường cong tăng trưởng của T. viride trong môi trường lỏng dựa trên việc xác định khối lượng sinh khối khô (sấy ở 105°C đến khối lượng không đổi); nhân giống sợi để cấy vào môi trường bán rắn với tỷ lệ 0,2% sinh khối khô so với khối lượng bã.
• Phương pháp tuyển chọn giống:
  • Đánh giá sơ bộ trên đĩa thạch chứa CMC 1% (Carboxymethyl cellulose) thông qua chỉ thị Lugol để đo đường kính khuẩn lạc ($d$) và đường kính vòng phân giải ($D$), tính hiệu số $(D - d)$.
  • Đánh giá định lượng hoạt độ enzym trong môi trường nuôi cấy lỏng lắc.
• Phương pháp phân tích hóa lý nguyên liệu:
  • Định lượng nitơ tổng và protein thô bằng phương pháp Micro-Kjeldahl (vô cơ hóa mẫu bằng $H_2SO_4$ đậm đặc với xúc tác $CuSO_4:K_2SO_4$ tỷ lệ 1:3; cất đạm và chuẩn độ bằng $NaOH$ 0,1N; tính protein thô qua hệ số chuyển đổi 6,25).
  • Định lượng tinh bột bằng phương pháp thủy phân, kết tủa phân đoạn bằng cồn $99^\circ$ và sấy khô ở 130°C.
  • Định lượng đường khử bằng phương pháp chuẩn độ oxy hóa khử với dung dịch Potassium ferricyanide $K_3[Fe(CN)_6]$ 1% trong môi trường kiềm, chỉ thị Methylene blue.
  • Định lượng cellulose theo phương pháp nung tro sau khi thủy phân loại bỏ tinh bột bằng acid ($HCl$) và kiềm ($KOH$ 10%), sấy ở 105°C và nung vô cơ hóa ở 400–500°C.
• Phương pháp xác định hoạt độ cellulase: Đo lượng đường khử tạo thành khi ủ dịch enzym với cơ chất CMC 1% trong đệm acetate pH 5,0 ở 40°C trong 60 phút; định phân đường khử theo phương pháp Schaffer-Hartmann (sử dụng thuốc thử đồng-oxalat, acid hóa giải phóng $I_2$ và chuẩn độ bằng $Na_2S_2O_3$ N/200, chỉ thị hồ tinh bột). Một đơn vị hoạt độ ($U$) được định nghĩa là lượng enzym giải phóng 1 mg glucose trong 1 giờ ở điều kiện thí nghiệm ($40^\circ\text{C}$, $\text{pH } 5,0$).
• Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan: Phương pháp Folin-Lowry, đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 750 nm trên quang phổ kế, dựa trên đường chuẩn Bovine Serum Albumin (BSA) dải nồng độ $0–250\ \mu\text{g/ml}$.

Chỉ tiêu phân tích / Thông số	Phương pháp thực nghiệm áp dụng	Thiết bị / Hóa chất chính
Protein thô nguyên liệu	Chuẩn độ Micro-Kjeldahl	Bộ cất đạm Kjeldahl, $H_2SO_4$, $NaOH$
Tinh bột nguyên liệu	Kết tủa cồn và sấy khối lượng	Phễu lọc Buchner, tủ sấy, cồn $99^\circ$, $HCl$
Cellulose nguyên liệu	Thủy phân acid/kiềm, nung tro	Lò nung ($400–500^\circ\text{C}$), tủ sấy ($105^\circ\text{C}$)
Tuyển chọn chủng nấm	Thạch đĩa CMC 1% + Lugol	Tủ ấm, đĩa petri, dung dịch Lugol
Hoạt tính cellulase	Thủy phân CMC 1%, định lượng Schaffer-Hartmann	Nồi cách thủy $40^\circ\text{C}$, chuẩn độ $Na_2S_2O_3$ N/200
Hàm lượng protein hòa tan	Phương pháp Folin - Lowry	Máy đo quang phổ tử ngoại - khả kiến ($\lambda = 750\text{ nm}$), BSA

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Lời mở đầu

Trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ thực trạng ô nhiễm môi trường do chất thải bã khoai mì từ các nhà máy sản xuất tinh bột sắn tại Việt Nam. Nêu bật tiềm năng tái sử dụng bã khoai mì làm nguồn carbon giàu cellulose để lên men sản xuất enzym cellulase bằng nấm mốc Trichoderma viride. Xác định rõ mục đích nghiên cứu, 5 nhiệm vụ thực nghiệm cụ thể và ý nghĩa kinh tế - kỹ thuật của việc tinh sạch sơ bộ enzym phục vụ công nghiệp thực phẩm và xử lý môi trường.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Hệ thống hóa toàn diện các tài liệu lý thuyết liên quan đến đề tài:

• Trình bày đặc tính cấu trúc phân tử, tính chất vật lý, hóa học của cellulose trong tự nhiên và cơ chế cảm ứng sinh tổng hợp cellulase ở vi sinh vật.
• Phân tích chi tiết đặc tính hóa sinh, phân loại và cấu trúc phân tử của phức hệ cellulase (Endoglucanase, Exoglucanase, $\beta$-Glucosidase), tính đặc hiệu cơ chất và các tác nhân ức chế hoạt tính (ion kim loại nặng $Hg^{2+}$, sản phẩm cuối glucose và cellobiose).
• Khảo sát các nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose bao gồm xạ khuẩn (Streptomyces, Actinomyces), vi khuẩn dạ cỏ và nấm sợi (Trichoderma, Aspergillus, Penicillium). Trình bày chi tiết đặc điểm phân loại, hình thái học của loài Trichoderma viride.
• Tổng quan công nghệ lên men bán rắn trên cơ chất bã sắn: ưu nhược điểm, các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng (nguồn carbon, nguồn nitơ, khoáng vi lượng Zn, Fe, Mn, pH và nhiệt độ môi trường).
• Tổng quan các phương pháp thu nhận, phá vỡ tế bào, trích ly dịch chiết enzym thô, các phương pháp tinh sạch protein enzym (biến tính chọn lọc, kết tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ và muối trung tính, siêu lọc, sắc ký trao đổi ion, lọc gel).
• Tổng thuật các ứng dụng thực tiễn của cellulase trong chế biến thực phẩm, cải thiện chất lượng thức ăn gia súc, sản xuất cồn sinh học, sản xuất tinh bột và công nghiệp chất giặt tẩy.

Chương 3: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết đối tượng, hóa chất, môi trường nuôi cấy và quy trình bố trí 7 nội dung thí nghiệm:

• Mô tả thành phần môi trường giữ giống Czapek-agar và môi trường thử hoạt tính bổ sung CMC 1%.
• Chi tiết hóa quy trình phân tích thành phần hóa học của bã khoai mì (độ ẩm, tinh bột, cellulose, protein, đường khử).
• Trình bày quy trình nhân sinh khối sợi T. viride và kỹ thuật lên men bề mặt trên 20 g cơ chất bã khoai mì trong bình dung tích 500 ml.
• Thiết kế bố cục thực nghiệm khảo sát các thông số:
  • Thí nghiệm 1: Xác định thành phần hóa học của bã khoai mì.
  • Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường ban đầu (40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%).
  • Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên men (12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 giờ).
  • Thí nghiệm 4: Khảo sát tỷ lệ dịch chiết enzym giữa canh trường và dung môi chiết (nước cất và đệm acetate pH 5,0) ở các tỷ lệ 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7 (g/ml).
  • Thí nghiệm 5: Khảo sát tỷ lệ tác nhân tủa protein enzym gồm cồn ethanol $96^\circ$ lạnh (tỷ lệ thể tích 1:1 đến 6:1), acetone lạnh (1:1 đến 6:1) và dung dịch muối ammonium sulfate bão hòa.
  • Thí nghiệm 6 & 7: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzym sau tinh sạch.

Chương 4: Kết quả và bàn luận

Trình bày, phân tích và biện luận các dữ liệu thực nghiệm thu được:

• Thành phần hóa học bã khoai mì: Xác nhận hàm lượng chất khô của bã khoai mì Tây Ninh gồm tinh bột (21,1%), cellulose (19%), protein thô (1,75%), đường khử (0,324%), chứng minh bã sắn đáp ứng tốt yêu cầu làm cơ chất cảm ứng.
• Kết quả chọn giống: So sánh chủng Trichoderma viride và Aspergillus oryzae trên đĩa thạch CMC và nuôi cấy lỏng. Trichoderma viride cho đường kính vòng thủy phân $(D - d)$ lớn hơn và hoạt độ phân giải CMC cao hơn rõ rệt, được chọn làm chủng vi sinh vật cho toàn bộ nghiên cứu.
• Động học tăng trưởng: Xác định đường cong sinh trưởng của T. viride trong môi trường lỏng để xác định độ tuổi sinh lý tối ưu của sợi nấm trước khi cấy chuyền vào môi trường lên men cơ chất rắn.
• Tối ưu hóa điều kiện lên men: Đánh giá sự biến thiên của hoạt tính cellulase theo độ ẩm môi trường ban đầu và thời gian lên men. Xác định khoảng độ ẩm và thời điểm canh trường đạt đỉnh hoạt tính sinh tổng hợp cellulase cao nhất trước khi bước vào pha suy thoái.
• Tối ưu hóa quá trình tách chiết enzym thô: So sánh hiệu quả chiết giữa nước cất và đệm acetate 50 mM (pH 5,0) theo các tỷ lệ canh trường/dung môi từ 1:2 đến 1:7. Đánh giá sự thay đổi của hoạt tính tổng và hàm lượng protein hòa tan trong dịch chiết thô để lựa chọn dung môi và tỷ lệ chiết tối ưu.
• Hiệu quả tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp tủa: Phân tích hoạt tính enzym, hàm lượng protein và hoạt tính riêng ($U/\text{mg protein}$) của các phân đoạn tủa bằng ethanol, acetone và ammonium sulfate. So sánh độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi giữa 3 phương pháp tủa để chọn ra tác nhân tối ưu nhất.
• Đặc tính của chế phẩm enzym sau tinh sạch: Khảo sát độ bền và hoạt tính tương đối của enzym ở các dải pH và nhiệt độ phản ứng khác nhau, xác định vùng pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động xúc tác của phức hệ cellulase thu nhận từ T. viride.

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các thông số công nghệ tối ưu đã đạt được từ thực nghiệm và đề xuất các hướng nghiên cứu hoàn thiện quy trình tách chiết, tinh sạch sâu ở quy mô lớn hơn.

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng và thông số kỹ thuật

• Đặc tính cơ chất bã khoai mì:
  • Tinh bột: $21,1%$
  • Cellulose: $19,0%$
  • Protein thô: $1,75%$
  • Đường khử tự do: $0,324%$

Chỉ tiêu thành phần bã khoai mì	Hàm lượng (% tính theo chất khô)
Tinh bột	21,1%
Cellulose	19,0%
Protein thô	1,75%
Đường khử	0,324%

• Tuyển chọn chủng giống: Khẳng định chủng nấm sợi Trichoderma viride có hoạt lực sinh tổng hợp cellulase vượt trội so với Aspergillus oryzae trên cơ chất cảm ứng carboxymethyl cellulose và bã khoai mì.
• Điều kiện lên men bán rắn: Thiết lập được quy trình nuôi cấy T. viride trên bã khoai mì bổ sung khoáng Czapek, tỷ lệ giống cấy 0,2% sinh khối khô; xác định được khoảng độ ẩm môi trường ban đầu và thời gian lên men thích hợp để đạt hoạt tính enzym cực đại.
• Điều kiện tách chiết enzym thô: Xác định được dung môi phù hợp (so sánh giữa nước cất và dung dịch đệm acetate pH 5,0) và tỷ lệ thể tích dung môi/khối lượng canh trường (g/ml) tối ưu nhằm thu hồi tối đa lượng enzym hòa tan với lượng protein tạp thấp nhất.
• Hiệu quả tinh sạch sơ bộ: Thu được số liệu so sánh định lượng về hoạt tính tổng, hàm lượng protein hòa tan và hoạt tính riêng giữa 3 tác nhân tủa protein (ethanol lạnh, acetone lạnh, muối ammonium sulfate bão hòa), xác định được tỷ lệ kết tủa tối ưu giúp loại bỏ phần lớn đường tự do và nâng cao độ tinh sạch sơ bộ của chế phẩm cellulase.
• Đặc tính hóa sinh chế phẩm: Xác định được vùng pH tối ưu (trong khoảng acid nhẹ $\text{pH } 4,0–5,0$) và nhiệt độ phản ứng tối ưu (trong khoảng $40–50^\circ\text{C}$) của phức hệ cellulase thu nhận từ Trichoderma viride.

Đóng góp của đề tài

• Chứng minh tính khả thi về mặt kỹ thuật của việc tận dụng phế phụ phẩm bã khoai mì làm môi trường lên men bán rắn sản xuất chế phẩm sinh học cellulase, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường tại các làng nghề và nhà máy chế biến tinh bột sắn.
• Xây dựng hoàn chỉnh một quy trình thực nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm từ khâu chuẩn bị giống, lên men, trích ly đến tinh sạch sơ bộ và đánh giá đặc tính enzym, cung cấp các thông số thực nghiệm chi tiết phục vụ công tác nghiên cứu công nghệ enzym vi sinh vật.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

• Nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm trên các mẻ nuôi cấy nhỏ (20 g cơ chất trong bình tam giác 500 ml), chưa tiến hành khảo sát ở quy mô pilot hoặc thiết bị lên men bán rắn chuyên dụng (dạng khay, dạng thùng quay).
• Quá trình tinh sạch mới đạt mức độ sơ bộ bằng kỹ thuật kết tủa phân đoạn (loại bỏ đường tự do và một phần protein tạp), chưa thực hiện các bước tinh sạch sâu bằng sắc ký trao đổi ion hay lọc gel để tách riêng từng cấu tử enzym ($C_1$, $C_x$, $\beta$-glucosidase) nhằm xác định khối lượng phân tử phân đoạn.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Mở rộng quy mô lên men bán rắn trên hệ thống nuôi cấy khay tầng hoặc thiết bị lên men cơ chất rắn có kiểm soát nhiệt độ, độ ẩm và thông khí.
• Nghiên cứu tối ưu hóa bổ sung thêm các nguồn nitơ hữu cơ rẻ tiền (như cao ngô, dịch thủy phân nấm men) và khoáng vi lượng để nâng cao hơn nữa hoạt lực sinh tổng hợp cellulase của T. viride.
• Ứng dụng các kỹ thuật tinh sạch bậc cao (như siêu lọc màng, sắc ký cột DEAE-Cellulose hoặc Sephadex) để thu nhận enzym có độ tinh khiết cao.
• Thử nghiệm ứng dụng trực tiếp chế phẩm cellulase thu được vào việc thủy phân các nguồn phế phụ phẩm thực vật khác (rơm rạ, bã mía, vỏ dứa) phục vụ sản xuất đường khử hoặc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi.

Giá trị tham khảo

Đồ án tốt nghiệp là tài liệu tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên ngành Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học và Kỹ thuật Hóa học: Cung cấp tài liệu tham khảo về phương pháp luận nghiên cứu enzym học vi sinh vật, kỹ thuật lên men bán rắn và các phương pháp hóa sinh định lượng đường khử, protein và hoạt độ cellulase.
• Người nghiên cứu về công nghệ enzym và xử lý phụ phẩm nông nghiệp: Cung cấp thông số cơ sở về thành phần hóa học của bã khoai mì Tây Ninh, các bước bố trí thí nghiệm trích ly enzym từ canh trường rắn và kỹ thuật kết tủa phân đoạn protein enzym bằng dung môi hữu cơ/muối trung tính.
• Phần đáng tham khảo nhất: Quy trình định lượng hoạt tính cellulase theo phương pháp Schaffer-Hartmann (Chương 3) và các bảng số liệu so sánh hiệu quả kết tủa enzym giữa ethanol, acetone và $(NH_4)_2SO_4$ (Chương 4).

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả lựa chọn bã khoai mì làm cơ chất nuôi cấy sinh tổng hợp cellulase?

Bã khoai mì là nguồn phụ phẩm công nghiệp dồi dào tại Việt Nam (thải ra hơn 1 triệu tấn/năm), có giá thành rẻ, hàm lượng chất khô chứa tới 19% cellulose và 21,1% tinh bột sót. Thành phần này đóng vai trò là cơ chất cảm ứng tự nhiên kích thích nấm sợi tổng hợp phức hệ enzym cellulase mà không cần bổ sung các nguồn carbon tinh khiết đắt tiền.

2. Hai chủng nấm mốc nào được đưa vào khảo sát tuyển chọn ban đầu và chủng nào được chọn?

Tác giả đã khảo sát hai chủng nấm mốc là Trichoderma viride và Aspergillus oryzae được phân lập và lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Vi sinh của Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ TP. HCM. Kết quả thử nghiệm trên đĩa thạch CMC 1% và nuôi cấy lỏng cho thấy Trichoderma viride có hoạt lực phân giải cellulose vượt trội, do đó được chọn làm chủng vi sinh vật cho toàn bộ các thí nghiệm tiếp theo.

3. Phương pháp nào được sử dụng để định lượng hoạt độ enzym cellulase trong nghiên cứu?

Hoạt độ cellulase được xác định thông qua phản ứng thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC 1%) trong đệm acetate pH 5,0 ở nhiệt độ 40°C trong 1 giờ. Lượng đường khử tạo thành sau phản ứng được chuẩn độ theo phương pháp Schaffer-Hartmann (dùng hệ thuốc thử đồng-oxalat, acid hóa giải phóng iod và chuẩn độ iod bằng dung dịch chuẩn $Na_2S_2O_3$ N/200 với chỉ thị hồ tinh bột). Một đơn vị hoạt độ ($U$) tương ứng với lượng enzym phân giải cơ chất tạo ra 1 mg glucose trong 1 giờ.

4. Những tác nhân nào đã được khảo sát để tinh sạch sơ bộ enzym cellulase từ dịch chiết thô?

Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát và so sánh 3 tác nhân kết tủa protein enzym gồm:

• Cồn ethanol $96^\circ$ được làm lạnh trước (khảo sát các tỷ lệ thể tích dung môi/dịch enzym từ 1:1 đến 6:1).
• Acetone làm lạnh (khảo sát các tỷ lệ thể tích từ 1:1 đến 6:1).
• Dung dịch muối ammonium sulfate $(NH_4)_2SO_4$ bão hòa ở các nồng độ tủa khác nhau. Sau khi tủa và ly tâm thu hồi, cặn protein được hòa tan lại trong dung dịch đệm acetate 50 mM (pH 5,0) để đo hoạt tính và hàm lượng protein.

5. Phức hệ cellulase của Trichoderma viride gồm những enzym thành phần nào và đặc điểm cấu trúc của Exoglucanase là gì?

Phức hệ cellulase gồm 3 nhóm enzym chính hoạt động hiệp đồng: Endoglucanase (EC 3.2.1.4 / $C_x$), Exoglucanase (EC 3.2.1.91 / $C_1$ / CBH1) và $\beta$-Glucosidase (EC 3.2.1.21). Trong đó, Exoglucanase cấu tạo từ 2 chuỗi polypeptide (chuỗi A và chuỗi B), mỗi chuỗi gồm 434 gốc acid amin, chứa 10 cầu disulfide, liên kết với một nguyên tử $Ca^{2+}$ tại các vị trí Glu295 và Glu325, có chức năng cắt các đơn vị cellobiose từ đầu chuỗi cellulose.

Kết luận

Đồ án tốt nghiệp của sinh viên Huỳnh Thị Hồng Sương đã nghiên cứu thành công quy trình công nghệ thu nhận và tinh sạch sơ bộ enzym cellulase từ nấm sợi Trichoderma viride sử dụng cơ chất cảm ứng là phụ phẩm bã khoai mì Tây Ninh. Bằng phương pháp lên men bán rắn kết hợp với các kỹ thuật chiết tách và kết tủa phân đoạn, công trình đã xác lập được các thông số thực nghiệm về độ ẩm môi trường, thời gian nuôi cấy, tỷ lệ dung môi chiết và tác nhân tủa protein thích hợp. Kết quả nghiên cứu không chỉ mang ý nghĩa khoa học trong lĩnh vực công nghệ enzym vi sinh vật mà còn mở ra giải pháp xử lý chất thải rắn hiệu quả, gia tăng giá trị kinh tế cho ngành công nghiệp chế biến sắn tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

LỜI MỞ ĐẦU Công nông nghiệp ngày càng phát triển, lượng chất hữu cơ thải ra càng nhiều. Tận dụng phụ phế liệu này làm nguồn carbon để sản xuất enzym cellulase bằng cách nuôi cấy nấm sợi trên môi trường lên men bán rắn đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam. Cơ chất thường được sử dụng nhiều nhất là bã mía, bã mì, do có hàm lượng cellulose cao. Đây là cơ chất rẻ tiền và ổn định nên có tiềm năng sử dụng để sản xuất cellulase ở quy mô lớn.

Việt Nam là một nước nhiệt đới, có nền nông nghiệp khá phong phú, đa dạng và đang trên đà phát triển. Lượng phế phẩm và phụ phẩm nông nghiệp, công nghiệp cũng rất dồi dào nhưng lại không nhận được sự quan tâm đúng mức. Theo đó chất thải hữu cơ cũng tăng lên rất nhiều. Trong đó phụ liệu của ngành sản xuất tinh bột khoai mì là một ví dụ điển hình và chiếm khoảng ½ khoai nguyên liệu.

Nếu công suất nhà máy tinh bột khoai mì là 200 tấn/ ngày thì mỗi ngày nhà máy thải ra môi trường khoảng 20 tấn bã khoai mì gây ô nhiễm nghiêm trọng chính vì thế đã và đang có nhiều hướng giải quyết lượng bã khoai mì sau sản xuất như phơi khô làm thức ăn gia súc nhưng chưa khả thi do không thực sự đảm bảo nguồn dinh dưỡng, và không tận dụng triệt để nguồn phế phẩm. Nguồn phế phẩm này để lâu sẽ bị vi sinh vật tấn công gây hư hỏng tạo mùi khó chịu gây ô nhiễm môi trường và hao tốn diện tích. Trong bã khoai mì có hàm lượng cellulose cao nên ta có thể tận dụng bã khoai mì như nguồn cacbon để cảm ứng cho vi sinh vật tổng hợp enzym cellulase. Cellulase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, trong nông nghiệp enzym này dùng chế biến thức ăn cho vật nuôi, bên cạnh đó chúng còn được ứng dụng cho sản xuất phân hữu cơ.

Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase là tác nhân thủy phân nguyên liệu giàu cellulose (rơm, rạ, gỗ vụn, mạt cưa, dăm bào…) để tạo thành glucose, mật đường thay thế dần cho thủy phân bằng acid. Việc tinh sạch enzym cellulase là một trong những bước tiến quan trọng của lĩnh vực công nghệ enzym. Kỹ thuật này đã công cấp lượng enzyme sạch phục vụ cho rất nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong y học. Nắm bắt được nhu cầu của thị trường tôi tiến hành nghiên cứu việc thu nhận và tinh sạch sơ bộ enzym cellulase từ canh trường nuôi cấy Trichodema viride trên bã khoai mì.

Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài này chúng tôi cố gắng giải quyết các vấn đề sau: SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 1 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước - Chọn chủng nấm mốc thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase. - Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase. - Tách chiết enzym thô.

- Tinh sạch sơ bộ enzym thô. - Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến chế phẩm enzym sau khi tinh sạch sơ bộ. SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 2 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cellulose [16] 2.

Cấu tạo cellulose - Cellulose là polyanhydroglucose có mức độ trùng hợp khoảng 14000, có dạng hình sợi. Nhiều phân tử celluose liên kết với nhau tạo thành chùm gọi là micelle nhờ liên kết hydro. Mỗi mixen thường có khoảng 60 phân tử cellulose. Sợi cellulose không hòa tan chính là do các phân tử cellulose được xếp song song, sát lại với nhau và phía ngoài được bao bằng lớp vỏ chung có chứa sáp và pectin.