MỞ ĐẦU Ngày nay, việc sử dụng chuột như một mô hình động vật bệnh lý được xem như là công cụ phổ biến và được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực nghiên cứu, đặc biệt là trong lĩnh vực y sinh học. Năm 2009, chỉ riêng các bài báo nghiên cứu về chuột thí nghiệm gấp 3 lần so với cá ngựa vằn, ruồi giấm và giun đất gộp lại. Những nghiên cứu dựa trên loài gặm nhấm đã giải quyết mọi thứ từ thần kinh học và tâm lý học, cho đến thử thuốc với các loại bệnh tật. Loài gặm nhấm ở phòng thí nghiệm đã được sử dụng trên các thử nghiệm động vật trong suốt hơn 150 năm qua, và số lượng những thí nghiệm dạng này vẫn đang đà tăng theo cấp số nhân tính đến năm 2019.
Vì vậy, có thể nói việc tạo ra mô hình động vật bệnh lý đặc biệt là trên đối tượng chuột là việc hết sức cần thiết, có vai trò to lớn nhằm đáp ứng nhu cầu rất lớn trong các lĩnh vực nghiên cứu liên quan đến y sinh học. Bằng chứng là kỹ thuật này đã được thực hiện từ những năm thập niên 70 và vẫn được áp dụng cho đến thời điểm này [1]. Ngày nay, đi cùng với sự phát triển của việc chỉnh sửa gen sử dụng phương pháp Crispr/ Cas 9 thì việc tạo ra các mô hình động vật bệnh lý, đặc biệt là trên đối tượng chuột thí nghiệm ngày càng được chú trọng. Việc kết hợp giữa kỹ thuật này và phương pháp tạo ra mô hình động vật là một sự kết hợp hoàn hảo trong việc tạo mô hình động vật bệnh lý, đặc biệt là trên đối tượng chuột nghiên cứu.
Để tạo ra được mô hình động vật mang gen ngoại lai, thì ngoài việc sàng lọc các phôi mang gen để chuẩn bị cho quá trình chuyển phôi thì việc chuyển phôi mang gen vào chuột mẹ mang thai hộ là một trong các bước cực kì quan trọng. Đây có thể là bước quan trọng nhất bởi nếu bước này không thành công thì sẽ không bao giờ có được sinh vật (chuột) biến đổi gen nào được sinh ra. Năm 2018, việc tạo chuột con sinh ra từ các tế bào không phải tế bào trứng (non-egg) được công bố, nghiên cứu này cho thấy việc sử dụng chuột mang thai hộ đóng vai trò hết sức quan trọng. Vì tầm quan trọng đó, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo mô hình chuột mẹ mang thai hộ nhằm tạo chuột chuyển gen phát sáng huỳnh quang” nhằm tạo được 1 2 quy trình ổn định, có tỉ lệ thành công cao để có thể làm chủ được công nghệ tạo sinh vật biến đổi gen đáp ứng nhu cầu cho các nghiên cứu liên quan đến mô hình chuột.
Mục tiêu chung của đề tài: Tạo được chuột mẹ mang thai hộ nhằm ứng dụng tạo chuột chuyển gen phục vụ các nghiên cứu liên quan đến chuột thí nghiệm và mở ra một hướng đi mới cho việc tạo chuột biến đổi di truyền cho các nghiên cứu tiếp theo của các nhà khoa học ở Việt Nam. Để đạt được mục tiêu trên, các nội dung cụ thể cần thực hiện như sau: - Xác định giai đoạn động dục ở chuột cái bằng phương pháp quan sát trực quan âm đạo thông qua phương pháp vết phết tế bào âm đạo Chỉ tiêu đánh giá: (1) Sự hiện diện rõ rang của các tế bào đại diện cho giai đoạn của chu kì động dục đặc biệt là giai đoạn động dục (estrous); (2). Sự tương quan cao giữa hai phương pháp trực quan âm đạo và vết phết tế bào âm đạo nhằm thực hiện việc quan sát trực quan âm đạo và xác định được giai đoạn động dục mà không cần kiểm tra lại bằng phương pháp vết phết tế bào âm đạo. - Sàng lọc được hợp tử giai đoạn hai tiền nhân chuẩn bị cho quá trình vi tiêm DNA chuẩn bị quá trình chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ.
Tiêu chí đánh giá: (1) Thu nhận được các hợp tử giai đoạn 2 tiền nhân. (2) Phôi sau khi vi tiêm DNA có sự sinh trưởng và phát triển thành các giai đoạn 2 tế bào nhằm đảm bảo sự khỏe mạnh của phôi. - Tạo chuột mẹ mang thai hộ thành công bằng phương pháp phẫu thuật chuyển phôi vào ống dẫn trứng và theo dõi chuột mẹ mang thai sau khi chuyển phôi. Chỉ tiêu đánh giá: (1) Chuột đực không có khả năng sinh sản sau khi cắt ống dẫn tinh; (2) Ghi nhận được dấu hiệu giao phối thành công của các chuột được ghép đôi nhằm tiến hành kiểm tra ống dẫn trứng.
(4) Chuột nhận phôi có dấu hiệu mang thai ít nhất sau 1 tuần chuyển phôi. 3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2. Tình hình nghiên cứu sử dụng chuột mẹ mang thai hộ bằng phương pháp phẫu thuật chuyển phôi vào ống dẫn trứng Các nhà khoa học trên thế giới đã công bố nhiều công trình khoa học trong việc sử dụng chuột mẹ mang thai hộ phục vụ cho các nghiên cứu của họ. Nghiên cứu của Masaru Okabe và cộng sự năm 1997 trong việc tạo ra chuột chuyển gen phát sáng huỳnh quang nhằm tạo ra nguồn tế bào mang gen egfp dồi dào phục vụ cho các nghiên cứu liên quan đến cấy ghép tế bào đã báo cáo rằng, có 272 hợp tử đã vi tiêm DNA đã được cấy chuyển phôi vào chuột mang thai hộ và kết quả đạt được 52 chuột con sinh ra [2].
Carson và cộng sự năm 2000 đã báo cáo rằng, việc chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ là một bước thiết yếu trong quá trình tạo chuột biến đổi gen [3]. Do đó, việc tạo mô hình chuột mang thai hộ là cần thiết. Lars M Ittner và cộng sự năm 2007 nghiên cứu việc sản xuất chuột chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm DNA vào phôi đã mô tả việc chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ, trong đó để tạo chuột mẹ mang thai hộ cần sử dụng chuột cái ở giai đoạn động dục [4]. Trong nghiên cứu của Satoshi Kishigami và cộng sự năm 2006 về nghiên cứu sản xuất chuột nhân bản bằng phương pháp chuyển nhân tế bào sinh dưỡng cũng mô tả việc chuyển phôi vào chuột mang thai hộ và chuột mang thai hộ được tạo ra từ việc sử dụng chuột cái giai đoạn động dục.
Champlin và cộng sự đã nghiên cứu và đưa ra phương pháp xác định các giai đoạn của động dục ở chuột bằng việc quan sát trực quan âm hộ. Giai đoạn động dục được ghi nhận âm hộ có màu hồng, ít ẩm ướt. Tuy nhiên đây là một phương pháp đòi hỏi kĩ năng cũng như nhiều kinh nghiệm của người thực hiện, do đó cần có các phương pháp khác đối chiếu. Byers và cộng sự năm 2012 đã đưa ra phương pháp xác định các giai đoạn của chu kì động dục ở chuột bằng quan sát trực quan âm hộ ở các chủng chuột khác nhau, đồng thời đối chiếu là phương pháp vết phết tế bào âm đạo với sự xuất hiện của tế bào đặc trưng như tế bào biểu mô sừng hóa không nhân, tế bào biểu mô có nhân, tế bào bạch cầu.
Các tế bào này xuất hiện với tỉ lệ khác nhau ở các giai 4 đoạn khác nhau, nhóm nghiên cứu của Shannon L. Byers cũng đã được ra công cụ nhằm ước tính tỉ lệ tế bào và đưa ra giai đoạn động dục chính xác. Tuy nhiên, phương pháp của Shannon L. Byers và cộng sự là quan sát dưới kính hiển vi với mẫu tươi dịch âm đạo.
Điều này có ưu điểm là dễ dàng thực hiện, tiết kiệm thời gian. Tuy nhiên, các thị trường bên trong tiêu bản chứa dịch âm đạo không chỉ có tế bào, do đó rất khó phân biệt sự khác nhau của các loại tế bào ở các giai đoạn khác nhau. Fumiaki Itoi và cộng sự năm 2012 đã báo cáo về việc áp dụng mô hình chuột mang thai hộ trong đó sử dụng chuột ICR làm chuột mẹ mang thai hộ phục vụ nghiên cứu về các điều kiện nuôi khác nhau ở các hệ thống khác nhau và sinh con non bình thường [5]. Kết quả nghiên cứu của Ayako Isotani và cộng sự năm 2016 trong việc thiết lập dòng tế bào gốc phôi của chuột đã vi tiêm gen ngoại lai vào phôi và chuyển phôi vào chuột cái mang thai hộ nhằm sinh con non [6].
Trong nghiên cứu về hiệu quả của việc chỉnh sửa gen bằng kỹ thuật Crispr- EZ được báo cáo bởi Andrew J Modzelewski và cộng sự năm 2018 trên tạp chí Nature cũng mô tả việc tạo chuột biến đổi gen bằng việc vi tiêm DNA vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân và chuyển phôi vào ống dẫn trứng chuột cái mang thai hộ nhằm sinh chuột con được chỉnh sửa gen [7]. Yi Wu và cộng sự năm 2019 nghiên cứu về việc tạo ra chuột biến đổi gen được đăng trên tạp chí Nature đã mô tả việc vi tiêm hỗ hợp sgRNA và Cas9 mRNA hoặc protein vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân và giai đoạn 2 tế bào. Hợp tử sau vi tiêm được nuôi đến giai đoạn hai tế bào và các phôi hai tế bào sau vi tiêm được chuyển vào ống dẫn trứng của chuột mang thai hộ (hình 2. Quá trình tạo chuột biến đổi gen áp dụng mô hình chuột mang thai hộ [8] U.
Lampreht Tratar và cộng sự năm 2018 trong nghiên cứu mô hình chuột trong các nghiên cứu liên quan đến ung thư đã chỉ ra rằng, trong tất cả ba phương pháp tạo chuột chuyển gen mà họ đã sử dụng, điều quan trọng và chung nhất là đều phải chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ để tạo ra mô hình chuột nghiên cứu theo mô tả hình bên dưới [9]. Quy trình tạo chuột chuyển gen [9]. Cho đến thời điểm hiện tại, chưa có một công trình nào ở Việt Nam được công bố về nghiên cứu tạo chuột mẹ mang thai hộ nhằm tạo chuột phát sáng huỳnh quang tiếp cận bằng việc phẫu thuật chuyển phôi vào ống dẫn trứng. Điều này có 6 thể thấy nghiên cứu của chúng tôi đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc phục vụ cho nghiên cứu khoa học.
Sự đang dạng về mặt ứng dụng của mô hình chuột mẹ mang thai hộ cũng cho thấy tiềm năng ứng dụng của mô hình chuột mẹ mang thai hộ là rất lớn, đồng thời việc làm chủ công nghệ này là một lợi thế to lớn trong việc thực hiện các nghiên cứu khoa học tiếp theo. Vai trò của chuột trong nghiên cứu Thông qua tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước được thực hiện trên đối tượng chuột, có thể thấy chuột đóng một vai trò hết sức quan trọng trong nghiên cứu cơ bản và cả các nghiên cứu ứng dụng, đặc biệt là trong lĩnh vực y sinh học.