Chương 1. Giới Thiệu Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.com/) 3 - Giai đoạn thứ nhất: tiến hành thủy phân nhằm thu được đường. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân như nồng độ axit, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân, tỉ lệ cám gạo tách béo/dung dịch axit được khảo sát. - Sau đó loại bỏ các chất gây ức chế sự phát triển của vi sinh vật như 5- hydroxymethylfurfural (HMF), furfural.
- Giai đoạn thứ hai: Sử dụng dung dịch cám gạo tách béo thủy phân đã khử độc để nuôi cấy nấm men Y. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tích lũy chất béo của nấm men cũng được khảo sát. Giới Thiệu Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.com/) 4 Chương 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Vi sinh vật cho dầu 2.1 Giới thiệu Một vài loài vi sinh vật có khả năng tích lũy chất béo trên 20% khối luợng tế bào khô, được gọi là vi sinh vật cho dầu.
SCO được sản xuất bởi các vi sinh vật có dầu khác nhau đã được biết đến hơn 100 năm nay, nhưng không phải tất cả các vi sinh vật đều có khả năng tích lũy chất béo. Một số loài vi sinh vật như nấm men, vi tảo đã được báo cáo là có khả năng sinh trưởng và tích lũy lượng chất béo đáng kể (Bảng 2.1 Hàm lượng dầu cuả một số loài vi sinh vật Microorganisms Oil content Microorganisms Oil content (% dry wt) (% dry wt) Microalgae Yeast Botryococcus braunii 25–75 Candida curvata 58 Cylindrothecasp 16–37 Cryptococcus albidus 65 Nitzschiasp 45–47 Lipomyces starkeyi 64 Schizochytriumsp. 50–77 Rhodotorula glutinis 72 Bacterium Fungi Arthrobacter sp. > 40 Aspergillus oryzae 57 Acinetobacter calcoaceticus 27–38 Mortierella isabellina 86 Rhodococcus opacus 24–25 Humicola lanuginose 75 Bacillus alcalophilus 18–24 Mortierella vinacea 66 Chương 2.
Lược Khảo Tài Liệu Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.2 Nấm men cho dầu Nấm men có khả năng tổng hợp và tích lũy dầu từ 25% đến 80% trọng lượng khô của tế bào vì thế được gọi là vi sinh vật cho dầu. Tùy thuộc vào điều kiện môi trường, các tế bào nấm men có thể tổng hợp các axid béo tự do hay axit béo lưu trữ như triacylglycerol (TAG) và este steryl (SE), trong đó bao gồm một lõi kỵ nước được hình thành từ chất béo trung tính và được bao quanh bởi một lớp phospholipid đơn với một vài protein. Trong số 600 loài nấm men, có ít hơn 30 loài cho đến nay được xác định là có khả năng tích lũy chất béo hơn 25% trọng lượng sinh khối của chúng. Ví dụ như Rhodotorulaspp và Cryptococcus curvatus (Apiotricum curvatum) có thể tích lũy 40-70 % chất béo, trong khi nấm men Saccharomyces cerevisiae và Candida utilisare thường tích lũy chất béo 5-10%.
Các nấm men cho dầu nổi tiếng nhất bao gồm Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Rhizopus, Trichosporonand Yarrowia [11]. Những sinh vật này đã được sử dụng thương mại hóa cho nhiều mục đích khác nhau trong quá khứ. Tuy nhiên, trong tương lai việc sử dụng thành công tiềm năng của loại SCO để sản xuất biodiesel sẽ phụ thuộc vào việc sử dụng các nguồn nguyên liệu có giá trị thấp như các phụ phẩm nông nghiệp hay trong chế biến các sản phẩm nông nghiệp [5].2 Nấm men Yarrowia lipolytica 2.1 Khái quát về Yarrowia lipolytica Yarrowia lipolytica, với tiền thân được gọi là Candida lipolytica, được phân loại lại và đổi tên thành Endomycopsis lipolytica, Saccharomycopsis lipolytica, và cuối cùng được thống nhất là Y. lipolytica là loại nấm đa hình, tùy thuộc vào điều kiện dinh dưỡng và môi trường sống mà nó phát triển ở dạng tế bào đơn, giả sợi hoặc dạng sợi có vách ngăn (Hình 2.
Tuy nhiên dạng thường gặp là dạng sợi có vách ngăn có chiều dày từ 3-5 µm, những tế bào ở phần chồi dài khoảng 100 µm, trong khi mỗi đoạn chỉ dài từ 50 - 70 µm. Mỗi đoạn có một nhân tế bào [13-14]. Hầu hết các chủng của Y. lipolytica không thể phát triển trên 32 °C, là loài vi sinh vật hiếu khí và không có khả năng gây bệnh.
lipolytica thường được Chương 2. Lược Khảo Tài Liệu Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.com/) 6 tìm thấy trong các chất nền kỵ nước như ankan hoặc chất béo. Loại nấm men này thường được phân lập từ các sản phẩm sữa như pho mát hoặc một số chất gây ô nhiễm từ các loại thực phẩm khác nhau (pho mát, sữa chua, và xúc xích). Chủng này cũng được phân lập từ đất, nước thải và môi trường dầu bị ô nhiễm [15].
lipolytica còn có khả năng phân hủy tốt một số loại đường hexose như glucose, mannose và fructose. Hình thái tế bào của nấm men Y.lipolytica Với cơ chế phức tạp và sự đa dạng của hệ gen, Y. lipolytica có khả năng tích lũy chất béo trên 50% trong lượng khô của tế bào. lipolytica được xem như là một chủng nấm men có khả năng cho dầu có tiềm năng [16].
lipolytica Chương 2. Lược Khảo Tài Liệu Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.2 Sự tích lũy và tổng hợp chất béo của Y. lipolytica Sự tích lũy chất béo của tế bào nấm có thể được tăng cường bởi những chỗ lồi lõm trên bề mặt tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho các cơ chất kị nước hấp thu từ môi trường [10]. Những chất béo này tạo thành phần chất béo lưu trữ, chủ yếu là các triacylglycerol (triglycerides) và este steryl.
Quá trình tích lũy chất béo phụ thuộc chủ yếu vào sinh lý vi sinh vật, nguồn dinh dưỡng và điều kiện môi trường như nhiệt độ và độ pH [5]. Trong các vi sinh vật có dầu, sự tích lũy chất béo bắt đầu khi nguồn carbon dư thừa và một yếu tố khác trong môi trường phát triển trở nên hạn chế. Thông thường nguồn nitơ hạn chế là hiệu quả nhất dẫn đến sự tích lũy chất béo. Trong điều kiện nitơ hạn chế, các vi sinh vật tiếp tục đồng hóa nguồn carbon nhưng sự gia tăng tế bào dừng lại không tiếp tục sinh sản vì nguồn nitơ là cần thiết cho sự tổng hợp protein và nucleic.
Quá trình tích lũy chất béo ở vi sinh vật cho dầu là quá trình hai pha bao gồm pha sinh trưởng và pha tích lũy chất béo. Trong điều kiện này nguồn carbon dư thừa được chuyển sang tổng hợp triacylglycerol trong tế bào. Nếu vi sinh vật không cho dầu được đặt trong cùng điều kiện, chúng tích lũy polysaccharide bao gồm glycogen, glucan và mannan [10]. Khả năng tích lũy chất béo của Y.
lipolytica đã được nghiên cứu với các nguồn carbon khác nhau như glycerol [17], glucose thương mại [18], bã mía thủy phân [19], ứng với hàm lượng chất béo từ 14% - 58.5% sinh khối và thành phần axit béo bao gồm: 14.2% axit oleic (C18:1 ) và 2. Do thành phần axit béo không no nhỏ nên chất béo từ Y. lipolytica có một tiềm năng lớn để được sử dụng trong sản xuất dầu diesel sinh học [5, 20]. lipolytica Po1g Chủng Po1g của nấm men Y.
lipolytica bắt nguồn từ một chủng tự nhiên là W29 (ATCC 20460) sau khi thực hiện biến đổi gen với gen URA3 trong chủng Chương 2. Lược Khảo Tài Liệu Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.com/) 8 W29 được loại bỏ và thay bằng gen SUC2 từ S. cerevisiae, đồng thời loại bỏ các gen LEU2, XPR2 và AXP. lipolytica Po1g có khả năng tiết ra chất béo và protein tốt và không sinh ra các protease ngoại bào khi sinh trưởng trong sucrose, glucose.
Những đặc tính vượt trội này làm cho Y. lipolytica Po1g ngày càng được quan tâm nhiều hơn để sản xuất protein và chất béo [14].3 Cám gạo Cám gạo là phụ phẩm chính thu được từ lúa sau khi xay xát và thường chiếm khoảng 10% trọng lượng hạt lúa [21]. Cấu trúc của hạt lúa được trình bày như Hình 2. Lượng protein trong cám gạo có thể đạt 12 - 14%, cao hơn so với protein trong hạt bắp.
Lượng chất béo trong cám gạo rất cao 15 - 22%, chất đạm trên 12%, chất sắt trên 14%. Cám gạo là một loại phụ phẩm nông nghiệp giàu chất béo, carbohydrate và protein [22-23]. Các thành phần chính trong hạt thóc 2.1 Tinh bột cám gạo Tinh bột là một nguồn sinh khối quan trọng đối với quá trình lên men vi sinh vật, nó là nguồn nguyên liệu ít tốn kém, phong phú, dễ dàng lên men, và có thể được tái tạo liên tục nhờ quá trình quang hợp [24]. Lược Khảo Tài Liệu Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.com/) 9 Tinh bột trong cám gạo có chứa 10 – 55 %, tùy thuộc vào thiết bị xay xát và thành phần nội nhũ [25].2 Lignocellulose [7] Nguyên liệu lignocellulose chủ yếu tạo thành celluloses, hemicelluloses và lignin.
Phần hydrocarbon (cellulose và hemicellulose) thường chiếm đến hai phần ba lignocelluloses, có thể chuyển hóa thành đường bằng các phương pháp hóa học hay vi sinh. Cấu trúc lignincellulose [26] 2.1 Hemicellulose Hemicellulose là một loại polymer mạch nhánh, có cấu trúc vô định hình. Vì vậy, nó dễ tan trong nước và dễ bị phân hủy hơn cellulose. Hemicellulose có tác dụng liên kết giữa cellulose và lignin lại với nhau.
Cấu trúc hemicelluloses [27] Chương 2. Lược Khảo Tài Liệu Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.2 Cellulose Cellulose là các polysaccharide phổ biến nhất trong tự nhiên và bao gồm các đơn vị lặp đi lặp lại của cellobiose. Nó là một polymer glucan của các đơn vị D- glucopyranose, được liên kết với nhau bằng glucosidic. Các phân tử cellulose tổng hợp với nhau do liên kết hydro và liên kết Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình (Hình 2.
Cấu trúc cellulose [27] 2.3 Lignin Ngoài ra, trong thành phần của lignocelluloses còn có lignin. Đây là phần không thể chuyển hóa thành đường. Lignin là các polymer phức tạp bao gồm các đơn vị propan phenyl liên kết với nhau bằng các liên kết ether hoặc liên kết carbon- carbon (Hình 2. Cấu trúc lignin [27] Chương 2.
Lược Khảo Tài Liệu Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.3 Cám gạo tách béo Sau khi được trích ly chất béo, cám gạo tách béo (CGTB) có chứa một lượng tinh bột và polysaccharide đáng kể: tinh bột (46,7%), cellulose và hemicellulose (11,3%), chất béo (1,4%) [21]. Các thành phần này được chuyển đổi thành các loại đường pentose và hexose bằng phương pháp thủy phân. Một số tính chất và thành phần khác của CGTB được trình bày trong Bảng 2. Đây là một nghiên cứu của Sairam năm 2011 có sự so sánh giữa CGTB phòng thí nghiệm và CGTB thương mại.
Từ nguồn dinh dưỡng này, CGTB được tận dụng như một nguồn carbon nuôi cấy vi sinh vật để sản xuất chất béo, góp phần giảm bớt chi phí cho quá trình sản xuất diesel sinh học Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng và tính chất vật lý của CGTB (g/100g) [28] CGTB phòng thí CGTB thương Thành phần nghiệm mại Độ ẩm 13.2 Chất xơ không tan 5.