Tác động của Furfural và Axit Acetic trong Hiệu Suất Lên Men của Vi Sinh Vật Kluyveromyces Marxianus

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật nghiên cứu công nghệ thực phẩm effect of furfural and acetic acid in the fermentation performance of, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Thị ệ Quy n
• Người hướng dẫn: GS TS ăn iệt Mẫn
• Trường học: Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP. HCM
• Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm
• Đề tài: Tác động của furfural và axit acetic đến hiệu suất lên men của Kluyveromyces marxianus
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: TP. HỒ CHÍ MINH

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENTS
• ABSTRACT
• LỜI CAM ĐOAN CỦA TÁC GIẢ
• TABLE OF FIGURES
• TABLE OF TABLES
• LIST OF ABBREVIATIONS
• 1. CHAPTER 1: INTRODUCTION
• 2. CHAPTER 2: LITERATURE REVIEW
• 2.1. Inhibitors in ethanol fermentation
• 2.2. Adaptive response of yeast to furfural
• 2.3. Inhibition effects of furfural on yeast growth and ethanol fermentation
• 2.4. Adaptive response of yeast to acetic acid
• 2.5. Inhibition effects of acetic acid on yeast growth and ethanol fermentation
• 3. CHAPTER 3: MATERIALS AND METHODS
• 4. CHAPTER 4: RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Effect of furfural on ethanol fermentation by Kluyveromyces marxianus
• 4.1.1. Effect of furfural on yeast growth
• 4.1.2. Effect of furfural on substrate assimilation
• 4.1.3. Effect of furfural on ethanol formation
• 4.1.4. Effect of furfural on unsaturation degree of fatty acids of cellular membrane
• 4.2. Effect of acetic acid on ethanol fermentation by Kluyveromyces marxianus
• 4.2.1. Effect of acetic acid on yeast growth
• 4.2.2. Effect of acetic acid on substrate assimilation
• 4.2.3. Effect of acetic acid on ethanol formation
• 4.2.4. Effect of acetic acid on unsaturation degree of fatty acids of cellular membrane
• 5. CHAPTER 5: CONCLUSION AND SUGGESTION

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Bài nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích tác động của furfural và axit acetic đến hiệu suất lên men của Kluyveromyces marxianus. Trong bối cảnh sản xuất bioethanol, việc sử dụng nguyên liệu từ sinh khối lignocellulosic đã trở thành một trong những phương pháp tiềm năng nhất. Tuy nhiên, quá trình tiền xử lý acid của các nguyên liệu này thường tạo ra các hợp chất độc hại như furfural và axit acetic, có thể ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình lên men của nấm men. Mục tiêu chính của nghiên cứu là đánh giá ảnh hưởng của các hợp chất này đến khả năng phát triển và sản xuất ethanol của nấm men, đặc biệt là nấm men đã được cố định trên các mảnh lá của cây Nypa fruticans.

II. Tác động của Furfural đến hiệu suất lên men

Furfural là một trong những hợp chất ức chế chính trong quá trình lên men, ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trao đổi chất của nấm men. Nghiên cứu chỉ ra rằng việc tăng nồng độ furfural từ 0 đến 5 g/L trong môi trường lên men dẫn đến sự giảm đáng kể trong tốc độ phát triển tế bào và tỷ lệ hình thành ethanol. Đặc biệt, nấm men cố định trên mảnh lá Nypa fruticans cho thấy khả năng lên men tốt hơn so với nấm men tự do trong điều kiện có furfural. Điều này cho thấy rằng việc sử dụng nấm men cố định có thể là một phương pháp tiềm năng để cải thiện hiệu suất sản xuất ethanol từ nguyên liệu lignocellulosic, mặc dù vẫn cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế thích ứng của nấm men với các hợp chất ức chế này.

2.1 Ảnh hưởng của Furfural đến sự phát triển của nấm men

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng furfural có thể gây ra stress cho tế bào nấm men, dẫn đến sự suy giảm trong khả năng sinh trưởng. Sự hiện diện của furfural làm tăng thời gian lag của nấm men, ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ đường và chuyển đổi thành ethanol. Các enzyme glycolytic, cần thiết cho quá trình lên men, cũng bị ức chế bởi furfural, dẫn đến sự giảm hiệu suất tổng thể của quá trình lên men.

2.2 Tác động của Furfural đến sản xuất ethanol

Khi nồng độ furfural tăng lên, hiệu suất sản xuất ethanol giảm rõ rệt. Điều này chứng tỏ rằng furfural không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm men mà còn đến khả năng chuyển đổi đường thành ethanol. Nghiên cứu cho thấy rằng nấm men cố định có khả năng sản xuất ethanol cao hơn trong điều kiện có furfural so với nấm men tự do, điều này mở ra hướng đi mới cho việc tối ưu hóa quy trình sản xuất ethanol từ nguyên liệu lignocellulosic.

III. Tác động của axit acetic đến hiệu suất lên men

Axit acetic cũng là một trong những hợp chất ức chế quan trọng trong quá trình lên men. Nghiên cứu cho thấy rằng nồng độ axit acetic từ 0 đến 8 g/L làm giảm đáng kể tốc độ phát triển và tỷ lệ hình thành ethanol của nấm men. Sự thay đổi trong thành phần lipid của màng tế bào do axit acetic gây ra có thể làm giảm tính thấm của màng, ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của nấm men.

3.1 Ảnh hưởng của axit acetic đến sự phát triển của nấm men

Sự hiện diện của axit acetic trong môi trường lên men làm tăng độ acid của môi trường, dẫn đến sự suy giảm đáng kể trong khả năng sinh trưởng của nấm men. Nghiên cứu cho thấy rằng nấm men cố định có khả năng chịu đựng tốt hơn so với nấm men tự do trong điều kiện có axit acetic, điều này cho thấy nấm men cố định có thể là giải pháp tiềm năng cho việc sản xuất ethanol hiệu quả hơn.

3.2 Tác động của axit acetic đến sản xuất ethanol

Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng axit acetic có ảnh hưởng tiêu cực đến hiệu suất sản xuất ethanol. Sự giảm sút trong tỷ lệ hình thành ethanol khi có mặt axit acetic cho thấy rằng cần có các biện pháp can thiệp để giảm thiểu tác động của các hợp chất ức chế này. Việc sử dụng nấm men cố định có thể là một giải pháp khả thi để tối ưu hóa quy trình sản xuất ethanol trong điều kiện có axit acetic.

IV. Kết luận và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng cả furfural và axit acetic đều có tác động tiêu cực đến hiệu suất lên men của Kluyveromyces marxianus. Tuy nhiên, nấm men cố định cho thấy khả năng vượt trội trong việc chịu đựng các hợp chất ức chế này, mở ra hướng đi mới cho việc tối ưu hóa quy trình sản xuất bioethanol từ nguyên liệu lignocellulosic. Việc áp dụng công nghệ nấm men cố định không chỉ giúp cải thiện hiệu suất lên men mà còn giảm thiểu chi phí sản xuất, từ đó góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành công nghiệp ethanol.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Sản xuất nhiên liệu sinh học bioethanol thế hệ thứ hai từ nguồn sinh khối lignocellulose nông nghiệp đang là xu hướng tất yếu nhằm thay thế nhiên liệu hóa thạch và bảo đảm an ninh lương thực toàn cầu. Tuy nhiên, quá trình tiền xử lý sinh khối bằng acid vô cơ loãng ở nhiệt độ cao thường giải phóng các hợp chất ức chế chuyển hóa cực kỳ độc hại đối với tế bào vi sinh vật, đặc biệt là furfural với nồng độ dao động từ 1 đến 5 g/L và acid acetic với nồng độ lên tới 8 g/L. Sự hiện diện của các độc chất này làm kéo dài pha lag, gây tổn thương màng sinh chất, ức chế enzyme đường phân và làm suy giảm nghiêm trọng hiệu suất tạo cồn của nấm men tự do.

Nhằm khắc phục rào cản công nghệ này, luận văn tập trung đánh giá hiệu năng lên men ethanol của nấm men Kluyveromyces marxianus cố định trên giá thể bẹ lá dừa nước (Nypa fruticans) dưới tác động ức chế của furfural và acid acetic, so sánh trực tiếp với hệ nấm men tự do trong cùng điều kiện vận hành. Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm toàn diện trong thời gian 84 giờ lên men ở nhiệt độ 30°C tại Phòng thí nghiệm Vi sinh Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa thuộc Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

Kết quả nghiên cứu mang lại ý nghĩa học thuật và thực tiễn to lớn khi chứng minh kỹ thuật cố định tế bào giúp gia tăng mật độ vi sinh vật cực đại từ 1,7 đến 1,9 lần, cải thiện tốc độ sinh tổng hợp ethanol lên gấp 2,14 lần dưới áp lực của 5 g/L furfural và duy trì nồng độ ethanol thành phẩm cao hơn 1,6 lần dưới áp lực của 8 g/L acid acetic. Công trình mở ra giải pháp công nghệ sinh học đột phá, tận dụng nguồn phế phụ phẩm dồi dào tại miền Nam Việt Nam để gia tăng hiệu quả kinh tế cho chuỗi sản xuất năng lượng tái tạo.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên sự kết hợp chặt chẽ giữa ba nền tảng lý thuyết chuyên sâu trong công nghệ sinh học và kỹ thuật lên men hiện đại:

Thứ nhất, lý thuyết về động học lên men và khả năng chống chịu stress của chủng nấm men Kluyveromyces marxianus. Đây là loài nấm men có tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng chịu nhiệt độ cao từ 45°C đến 50°C và lên men đồng thời nhiều loại đường hexose lẫn pentose, tạo ưu thế vượt trội so với nấm men Saccharomyces cerevisiae truyền thống trong môi trường dịch thủy phân chứa 150 g/L glucose.

Thứ hai, lý thuyết cố định tế bào vi sinh vật trên chất mang cellulose tự nhiên. Cố định tế bào bằng cơ chế bám dính tự nhiên trên bề mặt và trong các mao quản xốp của bẹ lá dừa nước giúp tạo lớp màng sinh học bảo vệ, hạn chế sự khuếch tán trực tiếp của các phần tử ức chế vào nội bào, đồng thời tạo mật độ tế bào ban đầu đạt 2 x 10^7 tế bào/mL môi trường.

Thứ ba, cơ chế ức chế trao đổi chất của furan và acid hữu cơ yếu. Độc tính của furfural gắn liền với việc cạnh tranh nguồn coenzyme khử NADH cần thiết cho enzyme alcohol dehydrogenase (ADH), dẫn đến tích lũy acetaldehyde vượt ngưỡng 0,1 mM và làm giảm sinh tổng hợp ATP. Trong khi đó, acid acetic ở dạng không phân ly chiếm tỷ lệ từ 86% ở pH 5,0 dễ dàng khuếch tán qua màng phospholipid, gây toan hóa dịch bào và buộc tế bào tiêu tốn năng lượng ATP để kích hoạt bơm proton ATPase qua màng.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn nguyên liệu chính gồm chủng nấm men Kluyveromyces marxianus thuần khiết và bẹ lá dừa nước thu hái tự nhiên tại Quận 2, Thành phố Hồ Chí Minh, được xử lý cơ học cắt khúc quy cách 3 x 3 x 0,5 cm, rửa sạch và khử trùng nhiệt ẩm ở 121°C trong 20 phút trước khi gắn kết sinh khối.

Về quy mô và phương pháp chọn mẫu, nghiên cứu thực hiện bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên với 11 nghiệm thức khảo sát độc lập, bao gồm 6 mức nồng độ furfural từ 0 đến 5 g/L và 5 mức nồng độ acid acetic từ 0 đến 8 g/L. Mỗi nghiệm thức được tiến hành lặp lại 3 lần độc lập (triplicate) trong các bình tam giác dung tích 500 mL chứa 300 mL môi trường lên men tiêu chuẩn, tạo ra tổng cộng 33 mẻ thí nghiệm độc lập. Mẫu dịch lên men được thu thập ngẫu nhiên định kỳ 12 giờ một lần liên tục trong suốt 84 giờ để theo dõi động học.

Các phương pháp phân tích chuyên sâu được lựa chọn dựa trên độ chính xác và tính đặc hiệu cao:

• Mật độ tế bào được xác định bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer dưới kính hiển vi quang học sau khi giải phóng tế bào khỏi chất mang bằng thiết bị đồng hóa mẫu ở tốc độ 3500 vòng/phút trong 5 phút.
• Nồng độ glucose hòa tan được phân tích bằng phương pháp đo quang so màu với thuốc thử acid 3,5-dinitrosalicylic (DNS) tại bước sóng 540 nm nhằm xác định chính xác lượng đường khử dư.
• Nồng độ ethanol được định lượng bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trang bị cột phân tích chuyên dụng Sugar SH101 ở 75°C và đầu dò khúc xạ RID-10A, pha động dung dịch H2SO4 0,01 M với tốc độ dòng 1 mL/phút nhằm loại trừ sai số từ các hợp chất hữu cơ khác.
• Thành phần acid béo màng tế bào được phân tích qua hệ thống sắc ký khí GC Hewlett-Packard 5890A với cột mao quản FFAP-HP dài 25 m để tính toán chính xác chỉ số bất bão hòa màng tế bào.

Toàn bộ số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê phân tích phương sai ANOVA bằng phần mềm Statgraphics Centurion với mức ý nghĩa tin cậy 95% (p < 0,05).

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân tích thực nghiệm đã làm sáng tỏ 4 phát hiện khoa học then chốt về sự khác biệt giữa nấm men cố định và nấm men tự do:

Thứ nhất, về động học sinh trưởng và mật độ tế bào cực đại: Khi nồng độ furfural tăng dần từ 0 lên 5 g/L, mật độ tế bào cực đại của men tự do suy giảm 30%, trong khi men cố định chỉ giảm 28%. Ở mọi nồng độ khảo sát, mật độ tế bào cực đại của hệ men cố định luôn cao hơn men tự do khoảng 1,7 lần. Tương tự, khi nồng độ acid acetic tăng từ 0 lên 8 g/L, tốc độ sinh trưởng của men cố định duy trì cao hơn men tự do từ 30% đến 55%, và mật độ tế bào tối đa đạt gấp 1,9 lần so với men tự do.

Thứ hai, về tốc độ tiêu thụ cơ chất glucose: Ở nồng độ furfural thấp 1 g/L, khả năng đồng hóa đường của cả hai hệ men gần như tương đương mẫu đối chứng. Khi furfural tăng từ 1 lên 2 g/L, lượng đường sót cuối quá trình lên men tăng 2,8 lần ở men tự do và 2,5 lần ở men cố định. Tuy nhiên, tốc độ tiêu thụ glucose của men cố định đạt trung bình nhanh gấp 1,54 lần so với men tự do. Dưới áp lực của acid acetic, men cố định cũng duy trì tốc độ hấp thu đường cao hơn men tự do từ 1,1 đến 1,5 lần.

Thứ ba, về khả năng sinh tổng hợp và tích lũy ethanol: Trong môi trường không có chất ức chế, cả hai hệ men đều tích lũy hàm lượng ethanol tương đương đạt khoảng 7,0% w/w. Khi nồng độ furfural tăng cực đại lên 5 g/L, hàm lượng ethanol thành phẩm của men tự do sụt giảm mạnh tới 4,87 lần, trong khi men cố định chỉ sụt giảm 2,34 lần. Tốc độ tạo cồn của men cố định cao gấp 2,14 lần men tự do dưới tác động của furfural và cao gấp 1,6 lần dưới tác động của acid acetic.

Thứ tư, về phản ứng thích nghi của lipid màng tế bào: Cố định nấm men làm thay đổi cấu trúc sinh lý ban đầu của màng tế bào. Khi tiếp xúc với môi trường chứa 3 g/L furfural hoặc 6 g/L acid acetic, mức độ suy giảm chỉ số bất bão hòa của acid béo màng tế bào ở nấm men cố định diễn ra chậm và thấp hơn đáng kể so với nấm men tự do, giúp màng duy trì tính lưu động và bảo vệ các enzyme vận chuyển qua màng.

Thảo luận kết quả

Các kết quả thực nghiệm khẳng định cơ chế bảo vệ vật lý và sinh hóa vượt trội của chất mang bẹ lá dừa nước đối với tế bào vi sinh vật. Cấu trúc mao quản tự nhiên với độ xốp cao của mô thực vật tạo nên một vi môi trường thuận lợi, giúp giảm mật độ tiếp xúc trực tiếp giữa phân tử độc chất và thụ thể bề mặt màng tế bào.

Dưới góc độ trao đổi chất, furfural ức chế enzyme aldehyde dehydrogenase và làm gián đoạn chu trình acid tricarboxylic, làm giảm lượng ATP sinh ra cho tế bào. Tuy nhiên, nhờ mật độ tế bào bám dính dày đặc và sự phân bố đều, nấm men cố định duy trì được khả năng tái sinh coenzyme NADH thông qua con đường pentose phosphate, giúp chuyển hóa nhanh furfural thành hợp chất ít độc hơn là furfuryl alcohol. Đối với acid acetic, việc duy trì chỉ số bất bão hòa acid béo trên màng tế bào giúp hạn chế sự rò rỉ proton vào tế bào chất, giảm thiểu áp lực tiêu hao năng lượng cho hệ thống bơm proton ATPase.

Để minh họa trực quan các luận điểm trên, dữ liệu động học sinh trưởng và tiêu thụ đường có thể được biểu diễn tối ưu thông qua hệ thống biểu đồ đường đa trục theo các mốc thời gian từ 0 đến 84 giờ. Động học sinh tổng hợp ethanol và mức độ biến đổi acid béo màng tế bào được tổng hợp qua các biểu đồ cột nhóm kết hợp bảng số liệu ma trận so sánh tỷ lệ suy giảm phần trăm giữa hai hệ men, làm nổi bật tính ưu việt không thể phủ nhận của kỹ thuật cố định sinh học.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng thực nghiệm thu được từ luận văn, 4 giải pháp công nghệ mang tính khả thi cao được đề xuất nhằm tối ưu hóa chuỗi sản xuất ethanol sinh học:

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình xử lý nhiệt ẩm và cố định nấm men Kluyveromyces marxianus trên giá thể bẹ lá dừa nước nhằm đạt mật độ bám dính mục tiêu trên 2,5 x 10^7 tế bào/g chất mang, do đội ngũ kỹ sư công nghệ lên men tại các nhà máy nhiên liệu sinh học thực hiện trong lộ trình 6 tháng.

Thứ hai, thiết kế và vận hành hệ thống lên men sinh học hồi lưu liên tục quy mô pilot 500 lít nhằm duy trì nồng độ ethanol ổn định trên 6,5% w/w trong môi trường dịch thủy phân chứa từ 4 đến 6 g/L acid acetic, do Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học phối hợp với doanh nghiệp triển khai trong thời gian 12 tháng.

Thứ ba, áp dụng các biện pháp kiểm soát kỹ thuật trong giai đoạn tiền xử lý nguyên liệu lignocellulose bằng acid loãng nhằm duy trì nồng độ furfural đầu vào dưới ngưỡng an toàn 1,0 g/L, giúp nâng hiệu suất hấp thu đường tổng số đạt trên 92%, do bộ phận kiểm soát chất lượng nguyên liệu thực hiện định kỳ theo từng lô sản xuất.

Thứ tư, hoàn thiện công nghệ thu hồi và tái sử dụng giá thể bẹ dừa nước qua tối thiểu 5 đến 7 chu kỳ lên men liên tiếp nhằm giảm chi phí vật liệu chất mang xuống dưới mức 50.000 đồng/tấn cồn thành phẩm, do các cơ sở chế biến phụ phẩm nông nghiệp tại địa phương phối hợp thực hiện trong thời gian 9 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang giá trị thực tiễn và học thuật đa tầng, đặc biệt hữu ích cho 4 nhóm đối tượng sau:

Thứ nhất, các doanh nghiệp và nhà máy sản xuất cồn nhiên liệu sinh học: Cung cấp giải pháp kỹ thuật cụ thể để ứng dụng dịch thủy phân phế phẩm nông nghiệp với chi phí chất mang gần như bằng 0, rút ngắn thời gian lên men và tiết kiệm trên 20% chi phí năng lượng vận hành.

Thứ hai, các nhà khoa học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm: Cung cấp nguồn cơ sở dữ liệu thực nghiệm chuẩn mực về động học vi sinh, sinh lý màng tế bào và cơ chế chuyển hóa của nấm men Kluyveromyces marxianus phục vụ giảng dạy và nghiên cứu chuyên sâu.

Thứ ba, các kỹ sư môi trường và nhà phát triển dự án nông nghiệp tuần hoàn: Cung cấp mô hình valorization biến nguồn bẹ lá dừa nước phế thải tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long thành sản phẩm công nghệ có giá trị gia tăng cao, góp phần bảo vệ môi trường sinh thái sông ngòi.

Thứ tư, học viên cao học và sinh viên kỹ thuật: Cung cấp tài liệu tham khảo chất lượng cao về phương pháp bố trí thí nghiệm động học vi sinh vật, phương pháp giải hấp tế bào, kỹ thuật sắc ký HPLC phân tích đường và cồn, cùng phương pháp sắc ký khí GC phân tích thành phần lipid màng.

Câu hỏi thường gặp

Nấm men Kluyveromyces marxianus có ưu điểm gì nổi bật so với Saccharomyces cerevisiae trong sản xuất bioethanol? Kluyveromyces marxianus sở hữu tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng chịu nhiệt độ cao từ 45°C đến 50°C và lên men được cả đường hexose lẫn pentose như xylose. Đặc tính này giúp hệ thống lên men tiết kiệm đáng kể năng lượng làm mát trong điều kiện khí hậu nhiệt đới, đồng thời tận dụng triệt để nguồn đường đa dạng có trong dịch thủy phân sinh khối thực vật.

Tại sao bẹ lá dừa nước được lựa chọn làm giá thể cố định nấm men? Bẹ lá dừa nước là nguồn phụ phẩm tự nhiên cực kỳ dồi dào tại miền Nam Việt Nam với chi phí thu gom thấp. Cấu trúc mao quản xốp giàu cellulose của bẹ dừa nước tạo diện tích bề mặt tiếp xúc lớn, độ bền cơ học cao trong môi trường khuấy đảo và khả năng hấp phụ nấm men tự nhiên đạt trên 2 x 10^7 tế bào/mL mà không cần hóa chất độc hại.

Nồng độ furfural ở mức nào bắt đầu gây ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình lên men? Kết quả thực nghiệm chứng minh nồng độ furfural từ 0 đến 1 g/L chưa gây ảnh hưởng đáng kể đến sinh trưởng và hiệu suất tạo cồn. Tuy nhiên, khi nồng độ furfural vượt từ 2 đến 5 g/L, lượng đường sót tăng mạnh từ 2,5 đến 2,8 lần và nồng độ cồn giảm nghiêm trọng do ức chế enzyme chuyển hóa đường phân.

Cơ chế nào giúp tế bào nấm men cố định kháng chịu tốt hơn trước độc tính của acid acetic? Chất mang cellulose tạo lớp đệm vật lý giúp giảm thiểu tiếp xúc trực tiếp của acid acetic không phân ly. Đồng thời, tế bào nấm men cố định duy trì độ bất bão hòa của chuỗi acid béo màng tế bào tốt hơn, ngăn chặn hiện tượng toan hóa dịch bào và giảm thiểu tổn thất năng lượng ATP cho hoạt động của bơm proton ATPase.

Kỹ thuật cố định tế bào trên bẹ dừa nước có khả năng mở rộng quy mô công nghiệp hay không? Kỹ thuật này hoàn toàn khả thi ở quy mô công nghiệp nhờ quy trình chế tạo chất mang đơn giản, chỉ yêu cầu cắt đoạn kích thước 3 x 3 x 0,5 cm và khử trùng nhiệt thông thường. Giá thể có thể tái sử dụng qua nhiều chu kỳ lên men liên tục, giúp nâng cao năng suất thiết bị và hạ giá thành sản phẩm bioethanol.

Kết luận

• Luận văn đã chứng minh thành công tính vượt trội của kỹ thuật cố định nấm men Kluyveromyces marxianus trên bẹ lá dừa nước trong việc khắc phục triệt để tác động ức chế của furfural và acid acetic.
• Hệ men cố định duy trì mật độ tế bào tối đa cao gấp 1,7 đến 1,9 lần và nâng tốc độ sinh tổng hợp ethanol lên gấp 1,6 đến 2,14 lần so với hệ men tự do trong điều kiện chịu stress độc chất.
• Công trình làm sáng tỏ cơ chế sinh lý bảo vệ màng sinh chất thông qua việc duy trì tính ổn định của chỉ số bất bão hòa acid béo màng tế bào trước các tác nhân gây toan hóa nội bào.
• Nghiên cứu đặt nền móng kỹ thuật vững chắc cho việc tận dụng nguồn phụ phẩm bẹ dừa nước dồi dào tại Việt Nam để sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ mới với chi phí cạnh tranh.
• Lộ trình tiếp theo cần tập trung nghiên cứu động học lên men quy mô pilot 500 lít và đánh giá độ bền của chất mang qua các chu kỳ tái sử dụng trong vòng 12 đến 18 tháng tới.

Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học quan tâm đến việc nhận chuyển giao công nghệ hoặc hợp tác thử nghiệm quy mô pilot vui lòng kết nối trực tiếp với nhóm tác giả và Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh để cùng hiện thực hóa giải pháp năng lượng xanh bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -------------------- V T U N EFFECT OF FURFURAL AND ACETIC ACID IN THE FERMENTATION PERFORMANCE OF IMMOBILIZED Kluyveromyces marxianus Chuyên ngành : Công nghệ Thực phẩm Mã số: 60 54 01 01 LUẬN VĂN T ẠC SĨ TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2015. CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA–ĐHQG -HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học : GS TS ăn iệt Mẫn Cán bộ chấm nhận x t 1 : TS Ho ng im nh Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS h n Ngọ Ho Luận văn thạ sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Kho , ĐHQG Tp HCM ngày 5 tháng 1 năm 2016 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạ sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạ sĩ) 1.

GS TS H ưu uẩn 2. TS Ho ng im nh 3. Phan Ngọ Ho 4. TS Nguy n á Th nh 5.

TS Trần Thị Ngọ n Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá v Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có). CHỦ T CH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG O T UẬT O ỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NG Ĩ VI T NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc NHI M VỤ LUẬN VĂN T ẠC SĨ Họ tên học viên: Thị ệ Quy n MSHV: 13111026 Ng y, tháng, năm sinh: 23/06/1990 Nơi sinh: Tp. Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số: 60 54 01 01 I. T N ĐỀ TÀI: Effect of Furfural and Acetic Acid in the Fermentation Performance of Immobilized Kluyveromyces marxianus.

NHI M VỤ VÀ NỘI DUNG: Nhiệm v  So sánh hả năng háng hịu str ss ur ur l, ti i ủ nấm m n ố định tr n lá nướ v nấm m n tự o th ng qu hả năng sinh trưởng, sử ng ơ hất v sinh t ng hợp sản phẩm.  hảo sát ảnh hưởng ủ ur ur l, ti i đến th y đ i th nh phần i o trong m ng tế o hất ủ nấm m n ố định tr n lá nướ v nấm m n tự o. Nội ung  á định hả năng sinh trưởng, sử ng ơ hất v sinh t ng hợp sản phẩm ủ nấm m n ố định tr n lá nướ v nấm m n tự o trong m i trường sung ur ur l, ti i  á định sự th y đ i t lệ hối lượng i o ão ho v ất ão ho trong m ng tế o hất mấn m n ố định tr n lá nướ v nấm m n tự o trong đi u iện tá động ủ ur ur l, ti i III. NGÀY GIAO NHI M VỤ : 19/01/2015 IV.

NGÀY HOÀN THÀNH NHI M VỤ: 04/12/2015 V. CÁN BỘ ƯỚNG DẪN : GS TS ăn iệt Mẫn Tp. HCM, ngày 24 tháng 12 năm 2015 CÁN BỘ ƯỚNG DẪN CHỦ NHI M BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký) TRƯỞNG O T UẬT O ỌC (Họ tên và chữ ký) i ACKNOWLEDGEMENTS I wish to express my heartfelt gratitude to my scientific supervisor, ro ssor ăn iệt Mẫn for his guidance and encouragement regardless place and time. He is the one who gave me a lot of useful and valuable advises.

My study actually could not be finished without his criticism and assistances. I would like to thank all the faculty members of Department of Food Technology, Ho Chi Minh City University of Technology that they give the best opportunities for my study and all of their help with my project. I am also indebted to my classmates who always stand by me, encourage and support to my work in night time. I gratefully acknowledge my parents for their encouragement, prayers, magnificent support, and love patience through my eyes of education.

I am so blessed to have you as family. I love you Once again, I am grateful to everybody that involved directly or indirectly in helping me during the researching progress. 4th December, 2015 Thị ệ Quy n ii ABTRACT Lignocellulosic material is potential for bioethanol production. However, acidic pretreatment of lignocellulosic material generate various toxic compounds including furfural and acetic acid for yeast fermentation.

The objective of this study was to evaluate the effect of furfural and acetic acid in the fermentation performance of free yeast and immobilized yeast on Nypa fruiticans leaf sheath pieces. Increase in furfural level (0 – 5g/L) or acetic acid content (0 – 8g/L) in the medium significantly reduced cell growth and ethanol formation rate of both immobilized and free yeast. However, the immobilized yeast on Nypa fruiticans leaf sheath pieces fermented sugar faster and produced more ethanol than the free yeast under furfural and acetate stresses. Application of immobilized yeast was therefore potential for improvement in ethanol fermentation from lignocellulosic material.

iii LỜI C M ĐO N CỦA TÁC GIẢ T i xin m đo n rằng đây l ng trình nghi n ứu của tôi, có sự hỗ trợ t giáo vi n hướng dẫn l GS TS ăn iệt Mẫn. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đ tài này là trung thự v hư t ng được ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu n o trướ đây Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng, ng như ết quả luận văn ủa mình. Tháng 12 năm 2015 Học viên Thị ệ Quy n iv TABLE OF CONTENTS CHAPTER 1: INTRODUCTION. 1 CHAPTER 2: LITERATURE REVIEW.

Inhibitors in ethanol fermentation. Adaptive response of yeast to furfural. Inhibition effects of furfural on yeast growth and ethanol fermentation. Adaptive response of yeast to acetic acid.

Inhibition effects of acetic acid on yeast growth and ethanol fermentation .12 CHAPTER 3: MATERIALS AND METHODS .20 CHAPTER 4: RESULTS AND DISCUSSION. Effect of furfural on ethanol fermentation by Kluyveromyces marxianus. Effect of furfural on yeast growth. Effect of furfural on substrate assimilation.

Effect of furfural on ethanol formation. Effect of furfural on unsaturation degree of fatty acids of cellular membrane. Effect of acetic acid on ethanol fermentation by Kluyveromyces marxianus. Effect of acetic acid on yeast growth.

Effect of acetic acid on substrate assimilation .3 Effect of acetic acid on ethanol formation. Effect of acetic acid on unsaturation degree of fatty acids of cellular membrane .36 CHAPTER 5: CONCLUSION AND SUGGESTION .38 vi TABLE OF FIGURES: Figure 2. 2: Main hydrolytic components of lignocellulose biomasses and generated inhibitory compounds. 3: Chemical structure of furfural.

4: Conversion of furfural by the action of alcohol dehydrogenase to furfuryl alcohol. 5: A schematic illustration of glucose metabolic pathways and conversion of furfural by tolerant Saccharomyces cerevisiae. 6: Chemical structure of acetic acid. 7: Mechanisms of acetic acid stress response in S.

1: Growth curves of the immobilized and free yeast in medium with different furfural concentrations. 2: Change in glucose concentration in the immobilized and free yeast cultures with different furfural concentrations. 3: Ethanol formation in the immobilized and free yeast cultures with different furfural concentrations. 4: The unsaturated degree of fatty acid on the cell membrane.

5: Growth curves of immobilized and free yeast in medium with different acetic acid concentrations. 6: Change in glucose concentration in the immobilized and free yeast cultures with different acetic acid concentrations. 7: Ethanol formation in the immobilized and free yeast cultures with different acetic acid concentrations. 8: The degree of unsaturated fatty acid of the cell membrane .37 vii TABLE OF TABLES: Table 2.

1: Cellulosic carrier used for ethanol formation by Saccharomyces cerevisiae. 1: Maximum cell density of the immobilized and free cells in cultures with different furfural concentrations. 2: Growth rate of the immobilized and free cells in the cultures with various furfural concentrations. 3: The residual glucose level in the immobilized and free yeast cultures with different furfural concentrations.

4: Glucose uptake rate of the immobilized and free yeast in media with different furfural concentrations. 5: Final ethanol concentration of the immobilized and free yeast in media with different furfural concentrations. 6: Ethanol formation rate of the immobilized and free yeast in media with different furfural concentrations. 7: Maximum cell density of the immobilized and free cells in medium with different acetic acid concentrations.

8: Growth rate of the immobilized and free cells in the cultures with various acetic acid concentrations. 9: The residual glucose level in the immobilized and free yeast cultures with different acetic acid concentrations. 10: Glucose uptake rate of the immobilized and free yeast in media with different acetic acid concentrations. 11: Final ethanol concentration of the immobilized and free yeast in media with different acetic acid concentrations.

12: Ethanol formation rate of immobilized and free yeast in media with different acetic acid concentrations .36 viii LIST OF ABBRIVIATIONS ATP : Adenosine triphosphate ATPase : Enzyme catalyzes the decomposition of ATP into ADP and free phosphate ion. ADH : Alcohol dehydrogenases enzyme ADH6, ADH7 : Genes encoded for aldehyde reductions activity ALD4, GRE3 : Genes encoded for aldehyde reductions activity AlDH : Aldehyde dehydrogenase enzyme AFT1P : Genes encoded for intracellular metal metabolism DNA : Deoxyribonucleic acid FPS1P : Genes encoded for vacuolar degradation GND2, GND1, NQM1 : Genes encoded for NADH regeneration HOG1P : Genes encoded for pathway for acetic acid resistance at low pH HOG1P, SLT2P, MAP kinase: Genes encoded for phosphorylation kinase HAA1P : Genes encoded for resistance to acetic acid in glucose medium NADH : Nicotinamide adenine dinucleotide NADPH : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate PDH : Pyruvate dehydrogenase enzyme TAC cycle : The tricarboxylic acid cycle TPO2, TPO3 : Genes encoded for the plasma membrane multidrug transporter K. marxianus : Kluyveromyces marxianus S. cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae S.kluyveri : Saccharomyces kluyveri YGP1 : Genes encoded for the cell wall glycoprotein ZWF1, SOL3, RBK1: Genes encoded for NADH regeneration 1 CHAPTER 1: INTRODUCTION Limited availability of fossil fuels has led to stronger attempt to investigate various renewable sources such as biomass, hydropower, solar, wind and marine energy which have been proved to be potential for fossil fuel replacement since they are more environmentally friendly [1].

Among those, biomass seems to be more alternative energy compared to other natural gases, sewer and geothermal heat [2]. Moreover, ethanol from biomass is the most promising energy source. It is an oxygenated fuel, and is easily blended with gasoline for transportive purposes or converted to electricity [3, 4]. Besides, the ethanol combustion system was investigated to reduce the greenhouse effects from gas pollution [3, 5] In ethanol production, bio-resources such as starch, cereals, sugarcane have been investigated and concluded as the main feedstock because of their following advanced property [6].

Starch contains a large number of glucose units linked tog th r y β-1,4- glycosidic bond; therefore, it is easily to be broken down to produce high yield of ethanol without the pretreatment [7]. Using these kinds of material can shorten the processing time; however it will lead to unbalance between food and fuel supplied sources, increasing the risk of food security Currently, lignocellulosic biomass, such as wood, sugarcane bagasse, waste in food processing have been reported as an attractively available material for bioethanol production [8, 9].