Luận văn thạc sĩ: Phát hiện Mycobacterium tuberculosis kháng Isoniazid, Rifampin và Ethambutol bằng Real-Time PCR

• Tác giả: Khổng Thị Minh Ngân
• Người hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Phát Hiện Mycobacterium Tuberculosis Kháng Isoniazid, Rifampin Và Ethambutol Bằng Phương Pháp Real-Time PCR
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 1.1. Tình hình nhiễm lao trên thế giới và tại Việt Nam
• 1.1.1. Trên thế giới
• 1.1.2. Bệnh lao kháng thuốc và cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao
• 1.2. Vi khuẩn lao
• 1.2.1. Phân loại vi khuẩn lao
• 1.2.2. Hình thể vi khuẩn lao
• 1.2.3. Cấu trúc vi khuẩn lao
• 1.2.4. Đặc điểm sinh học và nuôi cấy vi khuẩn lao
• 1.2.5. Cơ chế tác động của isoniazid và cơ chế kháng isoniazid của vi khuẩn lao
• 1.2.6. Cơ chế tác động của Rifampin và cơ chế kháng Rifampin của vi khuẩn lao
• 1.2.7. Cơ chế tác động của ethambutol và cơ chế kháng ethambutol của vi khuẩn lao
• 1.3. Các phương pháp xác định lao kháng thuốc
• 1.3.1. Phương pháp xác định kiểu hình
• 1.3.2. Các phương pháp nuôi cấy cải tiến
• 1.3.3. Một số phương pháp kiểu hình mới
• 1.3.4. Phương pháp xác định kiểu gen
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Vật liệu sinh học
• 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
• 2.1.3. Hóa chất sử dụng
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp thiết kế và kiểm tra các oligonucleotide (mồi và mẫu dò) bằng cơ sở dữ liệu trên IDT và các phần mềm sinh học chuyên dụng như ClustalX và Annhyb
• 2.3.2. Phương pháp lấy mẫu, xử lý bệnh phẩm
• 2.3.3. Phương pháp tối ưu hóa các điều kiện phản ứng real-time PCR
• 2.3.4. Thiết lập quy trình chẩn đoán và thực hiện trên mẫu bệnh phẩm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Đánh giá các thông số của các oligonucleotide thiết kế
• 3.1.1. Trình tự và vị trí của các oligonucleotide
• 3.1.2. Đặc tính của các oligonucleotide
• 3.1.3. Khả năng bắt cặp của hệ mồi, mẫu dò trên lý thuyết
• 3.2. Đánh giá khả năng bắt cặp của hệ mồi và mẫu dò
• 3.2.1. Khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng
• 3.2.1.1. Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 1
• 3.2.1.2. Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 2
• 3.2.1.3. Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 3
• 3.2.1.4. Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 4
• 3.2.2. Khảo sát nồng độ mồi của phản ứng
• 3.2.2.1. Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 1
• 3.2.2.2. Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 2
• 3.2.2.3. Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 3
• 3.2.2.4. Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 4
• 3.2.2.5. Khảo sát nồng độ mẫu dò (mẫu dò)
• 3.2.2.5.1. Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 1
• 3.2.2.5.3. Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 3
• 3.2.2.5.4. Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 4
• 3.2.3. Khảo sát nồng độ Mg++
• 3.2.3.1. Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 1
• 3.2.3.2. Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 2
• 3.2.3.3. Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 3
• 3.2.3.4. Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 4
• 3.2.4. Khảo sát độ lặp lại của phản ứng
• 3.2.4.1. Khảo sát độ lặp lại trong cùng một lần thí nghiệm
• 3.2.4.2. Khảo sát độ lặp lại của các phản ứng trong các lần thí nghiệm khác nhau
• 3.2.5. Khảo sát độ nhạy của phản ứng
• 3.2.5.1. Phản ứng 1- xác định đột biến kháng isoniazid
• 3.2.5.2. Phản ứng 2- xác định đột biến kháng Rifampin
• 3.2.5.3. Phản ứng 3 và phản ứng 4- xác định đột biến kháng ethambutol
• 3.2.6. Khảo sát độ đặc hiệu của các phản ứng
• 3.2.6.1. Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 1- xác định đột biến kháng isoniazid
• 3.2.6.2. Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 2- xác định đột biến kháng Rifampin
• 3.2.6.3. Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 3 và 4 - xác định đột biến kháng ethambutol
• 3.2.7. Quy trình phát hiện đột biến kháng isoniazid, Rifampin và ethambutol của MTB
• 3.2.7.1. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt
• 3.2.7.2. Quy trình xác định các đột biến kháng isoniazid, Rifampin và ethambutol
• 3.3. Ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm
• 3.3.1. Mẫu bệnh phẩm
• 3.3.2. Ứng dụng quy trình trên 50 mẫu bệnh phẩm lao
• 3.3.3. Xác định độ đồng thuận của phương pháp real time PCR với phương pháp kháng sinh đồ
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về phát hiện Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc

Bệnh lao do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây ra đã trở thành một trong những vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng trên toàn cầu. Việc phát hiện sớm và chính xác các chủng vi khuẩn kháng thuốc là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả điều trị. Kỹ thuật Real-Time PCR đã được áp dụng rộng rãi trong việc phát hiện nhanh chóng các đột biến kháng thuốc, giúp cải thiện khả năng điều trị cho bệnh nhân.

1.1. Tình hình nhiễm lao và kháng thuốc trên thế giới

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm có khoảng 8-9 triệu ca nhiễm lao mới và 2 triệu ca tử vong do bệnh này. Tình trạng kháng thuốc đang gia tăng, đặc biệt là ở các nước đang phát triển. Việc phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc là rất cần thiết để ngăn chặn sự lây lan của bệnh.

1.2. Tình hình nhiễm lao tại Việt Nam

Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ bệnh lao cao nhất thế giới. Theo thống kê, khoảng 200.000 người mắc bệnh lao, trong đó có nhiều trường hợp kháng thuốc. Việc áp dụng các phương pháp phát hiện nhanh như Real-Time PCR là cần thiết để cải thiện tình hình.

II. Thách thức trong việc phát hiện Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc

Việc phát hiện các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc gặp nhiều thách thức. Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn mất nhiều thời gian và không đảm bảo độ chính xác cao. Hơn nữa, sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn kháng đa thuốc đã làm cho việc điều trị trở nên phức tạp hơn.

2.1. Các phương pháp phát hiện truyền thống

Các phương pháp như nuôi cấy vi khuẩn và kháng sinh đồ thường mất từ 2 đến 3 tháng để có kết quả. Điều này không chỉ làm chậm quá trình điều trị mà còn tạo cơ hội cho vi khuẩn phát triển và lây lan.

2.2. Khó khăn trong việc phát hiện kháng thuốc

Nhiều bệnh nhân không tuân thủ điều trị, dẫn đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc. Việc phát hiện sớm và chính xác các đột biến kháng thuốc là rất quan trọng để ngăn chặn tình trạng này.

III. Phương pháp Real Time PCR trong phát hiện Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc

Kỹ thuật Real-Time PCR đã trở thành một công cụ mạnh mẽ trong việc phát hiện các đột biến kháng thuốc của Mycobacterium tuberculosis. Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác các chủng vi khuẩn kháng thuốc, từ đó giúp cải thiện hiệu quả điều trị.

3.1. Nguyên lý hoạt động của Real Time PCR

Real-Time PCR dựa trên nguyên lý khuếch đại DNA, cho phép theo dõi quá trình phản ứng trong thời gian thực. Điều này giúp xác định nhanh chóng sự hiện diện của vi khuẩn kháng thuốc trong mẫu bệnh phẩm.

3.2. Lợi ích của Real Time PCR trong phát hiện kháng thuốc

Phương pháp này không chỉ nhanh chóng mà còn có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Thời gian thực hiện chỉ khoảng 2-3 giờ, giúp bác sĩ có thể đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

IV. Ứng dụng thực tiễn của Real Time PCR trong chẩn đoán lao kháng thuốc

Việc áp dụng Real-Time PCR trong chẩn đoán lao kháng thuốc đã mang lại nhiều kết quả tích cực. Nghiên cứu cho thấy phương pháp này có thể phát hiện các đột biến kháng Isoniazid, Rifampin và Ethambutol một cách hiệu quả.

4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng Real Time PCR

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng Real-Time PCR có thể phát hiện các đột biến kháng thuốc với độ chính xác cao. Điều này giúp cải thiện khả năng điều trị cho bệnh nhân và giảm thiểu nguy cơ lây lan trong cộng đồng.

4.2. Thực tiễn ứng dụng tại các cơ sở y tế

Nhiều cơ sở y tế tại Việt Nam đã áp dụng thành công phương pháp Real-Time PCR trong chẩn đoán lao kháng thuốc. Điều này không chỉ giúp phát hiện sớm mà còn nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai trong phát hiện Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc

Việc phát hiện Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc là một thách thức lớn trong y tế hiện đại. Tuy nhiên, với sự phát triển của công nghệ như Real-Time PCR, khả năng phát hiện và điều trị bệnh lao kháng thuốc đã được cải thiện đáng kể. Tương lai hứa hẹn sẽ có nhiều tiến bộ hơn nữa trong lĩnh vực này.

5.1. Tương lai của Real Time PCR trong y học

Với sự phát triển không ngừng của công nghệ sinh học, Real-Time PCR sẽ tiếp tục được cải tiến và mở rộng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, không chỉ trong phát hiện lao kháng thuốc.

5.2. Những thách thức cần vượt qua

Mặc dù Real-Time PCR mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn cần giải quyết các vấn đề như chi phí và khả năng tiếp cận công nghệ này tại các cơ sở y tế, đặc biệt là ở các vùng nông thôn.