Luận văn thạc sĩ hus phát hiện mycobacterium tuberculosis kháng isoniazid rifampin và ethambutol bằng kỹ thuật real time pcr

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phát hiện mycobacterium tuberculosis kháng isoniazid, rifampin và ethambutol qua kỹ thuật real time PCR.

• Tác giả: Khổng Thị Minh Ngân
• Người hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Phát Hiện Mycobacterium Tuberculosis Kháng Isoniazid, Rifampin Và Ethambutol Bằng Phương Pháp Real-Time PCR
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 1.1. Tình hình nhiễm lao trên thế giới và tại Việt Nam
• 1.1.1. Trên thế giới
• 1.1.2. Bệnh lao kháng thuốc và cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao
• 1.2. Vi khuẩn lao
• 1.2.1. Phân loại vi khuẩn lao
• 1.2.2. Hình thể vi khuẩn lao
• 1.2.3. Cấu trúc vi khuẩn lao
• 1.2.4. Đặc điểm sinh học và nuôi cấy vi khuẩn lao
• 1.2.5. Cơ chế tác động của isoniazid và cơ chế kháng isoniazid của vi khuẩn lao
• 1.2.6. Cơ chế tác động của Rifampin và cơ chế kháng Rifampin của vi khuẩn lao
• 1.2.7. Cơ chế tác động của ethambutol và cơ chế kháng ethambutol của vi khuẩn lao
• 1.3. Các phương pháp xác định lao kháng thuốc
• 1.3.1. Phương pháp xác định kiểu hình
• 1.3.2. Các phương pháp nuôi cấy cải tiến
• 1.3.3. Một số phương pháp kiểu hình mới
• 1.3.4. Phương pháp xác định kiểu gen
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Vật liệu sinh học
• 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
• 2.1.3. Hóa chất sử dụng
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp thiết kế và kiểm tra các oligonucleotide (mồi và mẫu dò) bằng cơ sở dữ liệu trên IDT và các phần mềm sinh học chuyên dụng như ClustalX và Annhyb
• 2.3.2. Phương pháp lấy mẫu, xử lý bệnh phẩm
• 2.3.3. Phương pháp tối ưu hóa các điều kiện phản ứng real-time PCR
• 2.3.4. Thiết lập quy trình chẩn đoán và thực hiện trên mẫu bệnh phẩm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Đánh giá các thông số của các oligonucleotide thiết kế
• 3.1.1. Trình tự và vị trí của các oligonucleotide
• 3.1.2. Đặc tính của các oligonucleotide
• 3.1.3. Khả năng bắt cặp của hệ mồi, mẫu dò trên lý thuyết
• 3.2. Đánh giá khả năng bắt cặp của hệ mồi và mẫu dò
• 3.2.1. Khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng
• 3.2.1.1. Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 1
• 3.2.1.2. Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 2
• 3.2.1.3. Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 3
• 3.2.1.4. Khảo sát nhiệt độ lai phản ứng 4
• 3.2.2. Khảo sát nồng độ mồi của phản ứng
• 3.2.2.1. Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 1
• 3.2.2.2. Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 2
• 3.2.2.3. Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 3
• 3.2.2.4. Khảo sát nồng độ mồi phản ứng 4
• 3.2.2.5. Khảo sát nồng độ mẫu dò (mẫu dò)
• 3.2.2.5.1. Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 1
• 3.2.2.5.3. Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 3
• 3.2.2.5.4. Khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng 4
• 3.2.3. Khảo sát nồng độ Mg++
• 3.2.3.1. Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 1
• 3.2.3.2. Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 2
• 3.2.3.3. Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 3
• 3.2.3.4. Khảo sát nồng độ Mg++ phản ứng 4
• 3.2.4. Khảo sát độ lặp lại của phản ứng
• 3.2.4.1. Khảo sát độ lặp lại trong cùng một lần thí nghiệm
• 3.2.4.2. Khảo sát độ lặp lại của các phản ứng trong các lần thí nghiệm khác nhau
• 3.2.5. Khảo sát độ nhạy của phản ứng
• 3.2.5.1. Phản ứng 1- xác định đột biến kháng isoniazid
• 3.2.5.2. Phản ứng 2- xác định đột biến kháng Rifampin
• 3.2.5.3. Phản ứng 3 và phản ứng 4- xác định đột biến kháng ethambutol
• 3.2.6. Khảo sát độ đặc hiệu của các phản ứng
• 3.2.6.1. Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 1- xác định đột biến kháng isoniazid
• 3.2.6.2. Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 2- xác định đột biến kháng Rifampin
• 3.2.6.3. Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 3 và 4 - xác định đột biến kháng ethambutol
• 3.2.7. Quy trình phát hiện đột biến kháng isoniazid, Rifampin và ethambutol của MTB
• 3.2.7.1. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt
• 3.2.7.2. Quy trình xác định các đột biến kháng isoniazid, Rifampin và ethambutol
• 3.3. Ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm
• 3.3.1. Mẫu bệnh phẩm
• 3.3.2. Ứng dụng quy trình trên 50 mẫu bệnh phẩm lao
• 3.3.3. Xác định độ đồng thuận của phương pháp real time PCR với phương pháp kháng sinh đồ
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về phát hiện Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc

Bệnh lao do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây ra đã trở thành một trong những vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng trên toàn cầu. Việc phát hiện sớm và chính xác các chủng vi khuẩn kháng thuốc là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả điều trị. Kỹ thuật Real-Time PCR đã được áp dụng rộng rãi trong việc phát hiện nhanh chóng các đột biến kháng thuốc, giúp cải thiện khả năng điều trị cho bệnh nhân.

1.1. Tình hình nhiễm lao và kháng thuốc trên thế giới

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm có khoảng 8-9 triệu ca nhiễm lao mới và 2 triệu ca tử vong do bệnh này. Tình trạng kháng thuốc đang gia tăng, đặc biệt là ở các nước đang phát triển. Việc phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc là rất cần thiết để ngăn chặn sự lây lan của bệnh.

1.2. Tình hình nhiễm lao tại Việt Nam

Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ bệnh lao cao nhất thế giới. Theo thống kê, khoảng 200.000 người mắc bệnh lao, trong đó có nhiều trường hợp kháng thuốc. Việc áp dụng các phương pháp phát hiện nhanh như Real-Time PCR là cần thiết để cải thiện tình hình.

II. Thách thức trong việc phát hiện Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc

Việc phát hiện các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc gặp nhiều thách thức. Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn mất nhiều thời gian và không đảm bảo độ chính xác cao. Hơn nữa, sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn kháng đa thuốc đã làm cho việc điều trị trở nên phức tạp hơn.

2.1. Các phương pháp phát hiện truyền thống

Các phương pháp như nuôi cấy vi khuẩn và kháng sinh đồ thường mất từ 2 đến 3 tháng để có kết quả. Điều này không chỉ làm chậm quá trình điều trị mà còn tạo cơ hội cho vi khuẩn phát triển và lây lan.

2.2. Khó khăn trong việc phát hiện kháng thuốc

Nhiều bệnh nhân không tuân thủ điều trị, dẫn đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc. Việc phát hiện sớm và chính xác các đột biến kháng thuốc là rất quan trọng để ngăn chặn tình trạng này.

III. Phương pháp Real Time PCR trong phát hiện Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc

Kỹ thuật Real-Time PCR đã trở thành một công cụ mạnh mẽ trong việc phát hiện các đột biến kháng thuốc của Mycobacterium tuberculosis. Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác các chủng vi khuẩn kháng thuốc, từ đó giúp cải thiện hiệu quả điều trị.

3.1. Nguyên lý hoạt động của Real Time PCR

Real-Time PCR dựa trên nguyên lý khuếch đại DNA, cho phép theo dõi quá trình phản ứng trong thời gian thực. Điều này giúp xác định nhanh chóng sự hiện diện của vi khuẩn kháng thuốc trong mẫu bệnh phẩm.

3.2. Lợi ích của Real Time PCR trong phát hiện kháng thuốc

Phương pháp này không chỉ nhanh chóng mà còn có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Thời gian thực hiện chỉ khoảng 2-3 giờ, giúp bác sĩ có thể đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

IV. Ứng dụng thực tiễn của Real Time PCR trong chẩn đoán lao kháng thuốc

Việc áp dụng Real-Time PCR trong chẩn đoán lao kháng thuốc đã mang lại nhiều kết quả tích cực. Nghiên cứu cho thấy phương pháp này có thể phát hiện các đột biến kháng Isoniazid, Rifampin và Ethambutol một cách hiệu quả.

4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng Real Time PCR

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng Real-Time PCR có thể phát hiện các đột biến kháng thuốc với độ chính xác cao. Điều này giúp cải thiện khả năng điều trị cho bệnh nhân và giảm thiểu nguy cơ lây lan trong cộng đồng.

4.2. Thực tiễn ứng dụng tại các cơ sở y tế

Nhiều cơ sở y tế tại Việt Nam đã áp dụng thành công phương pháp Real-Time PCR trong chẩn đoán lao kháng thuốc. Điều này không chỉ giúp phát hiện sớm mà còn nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai trong phát hiện Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc

Việc phát hiện Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc là một thách thức lớn trong y tế hiện đại. Tuy nhiên, với sự phát triển của công nghệ như Real-Time PCR, khả năng phát hiện và điều trị bệnh lao kháng thuốc đã được cải thiện đáng kể. Tương lai hứa hẹn sẽ có nhiều tiến bộ hơn nữa trong lĩnh vực này.

5.1. Tương lai của Real Time PCR trong y học

Với sự phát triển không ngừng của công nghệ sinh học, Real-Time PCR sẽ tiếp tục được cải tiến và mở rộng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, không chỉ trong phát hiện lao kháng thuốc.

5.2. Những thách thức cần vượt qua

Mặc dù Real-Time PCR mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn cần giải quyết các vấn đề như chi phí và khả năng tiếp cận công nghệ này tại các cơ sở y tế, đặc biệt là ở các vùng nông thôn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh lao do trực khuẩn Mycobacterium tuberculosis (MTB) gây ra vẫn là một trong những hiểm họa truyền nhiễm hàng đầu đối với sức khỏe cộng đồng toàn cầu. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2012 ghi nhận khoảng 8,6 triệu ca mắc mới và 1,3 triệu trường hợp tử vong trên toàn thế giới. Việt Nam đứng thứ 12 trong danh sách 22 quốc gia có gánh nặng bệnh lao cao nhất toàn cầu, với khoảng 44% dân số mang mầm bệnh lao tiềm ẩn. Tỷ lệ lao kháng đa thuốc (MDR-TB) chiếm 2,7% ở các ca mới phát hiện và lên tới 19% ở nhóm bệnh nhân tái điều trị.

Vấn đề nghiên cứu cốt lõi xuất phát từ thực trạng các phương pháp nuôi cấy và thử nghiệm kháng sinh đồ (DST) truyền thống trên môi trường đặc Löwenstein-Jensen hoặc môi trường lỏng BACTEC MGIT 960 thường kéo dài từ 4 đến 8 tuần. Khoảng thời gian chờ đợi quá lớn này làm chậm trễ phác đồ can thiệp, làm gia tăng tỷ lệ tử vong và nguy cơ lây lan chủng kháng thuốc ra cộng đồng. Dù các kỹ thuật thương mại như Xpert MTB/RIF hay Hain GenoType MTBDR cho kết quả nhanh nhưng chi phí trang thiết bị và sinh phẩm nhập khẩu rất đắt đỏ, khó phổ cập rộng rãi tại tuyến y tế cơ sở.

Mục tiêu cụ thể của luận văn là thiết kế hệ mồi và mẫu dò đặc hiệu, tối ưu hóa điều kiện phản ứng real-time PCR mở để phát hiện nhanh các đột biến kháng 3 loại kháng sinh trụ cột dòng một gồm Isoniazid (katG codon 315), Rifampin (rpoB codon 516) và Ethambutol (emb codon 306). Đề tài được thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội phối hợp cùng Viện Y học Phóng xạ và U bướu Quân đội, ứng dụng kiểm định trực tiếp trên 50 mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi rút ngắn thời gian chẩn đoán từ 60 ngày xuống còn dưới 2 giờ với chi phí giảm hơn 60% so với kit ngoại nhập, đạt độ đồng thuận 100% với kháng sinh đồ chuẩn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Khung lý thuyết của nghiên cứu được xây dựng trên cơ sở cơ chế di truyền phân tử và sinh hóa của hiện tượng kháng thuốc ở vi khuẩn lao:

• Cơ chế kháng Isoniazid (INH): INH là tiền thuốc cần enzyme catalase-peroxidase do gen katG mã hóa để hoạt hóa thành dạng có hoạt tính ức chế tổng hợp acid mycolic ở vách tế bào. Đột biến điểm tại codon 315 (thay thế AGC bằng ACC, dẫn đến acid amin Ser315Thr) chiếm 60% đến 70% các chủng lao kháng INH trên lâm sàng, làm mất khả năng hoạt hóa thuốc mà vẫn duy trì độc lực vi khuẩn.
• Cơ chế kháng Rifampin (RIF): RIF ức chế tiểu đơn vị beta của enzyme RNA polymerase do gen rpoB mã hóa. Hơn 95% chủng kháng RIF mang đột biến nằm trong vùng lõi 81 base pair (codon 507 đến 533), trong đó đột biến codon 516 (thay đổi GAC thành GTC, tức Asp516Val) là một trong những điểm nóng đột biến điển hình nhất.
• Cơ chế kháng Ethambutol (EMB): EMB ức chế enzyme arabinosyl transferase được mã hóa bởi phức hợp gen embCAB, ngăn chặn quá trình sinh tổng hợp arabinogalactan. Khoảng 69% đến 90% chủng kháng EMB mang đột biến tại vị trí codon 306 của gen embB, phổ biến nhất là đột biến chuyển vị ATG thành GTG (Met306Val) và ATG thành ATA (Met306Ile).
• Nguyên lý sinh học phân tử: Nghiên cứu áp dụng công nghệ real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang TaqMan thủy phân. Tín hiệu huỳnh quang phát ra tỉ lệ thuận với lượng sản phẩm khuếch đại, cho phép định tính chính xác alen đột biến kháng thuốc mà không cần qua bước điện di gel agarose.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu áp dụng quy trình thực nghiệm sinh học phân tử khép kín qua các giai đoạn:

• Thiết kế oligonucleotide in silico: Trình tự gen của chủng chuẩn Mycobacterium tuberculosis H37Rv được truy xuất từ cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI). Các cặp mồi và mẫu dò TaqMan đặc hiệu cho 4 phản ứng được thiết kế và kiểm tra cấu trúc thứ cấp, dimer, nhiệt độ nóng chảy (Tm) thông qua phần mềm chuyên dụng ClustalX, Annhyb và công cụ OligoAnalyzer trên nền tảng IDT.
• Tối ưu hóa phản ứng real-time PCR: Tiến hành khảo sát đa biến bao gồm dải nhiệt độ lai (từ 58°C đến 64°C), nồng độ mồi xuôi và mồi ngược (từ 0,2 µM đến 0,6 µM), nồng độ mẫu dò (từ 0,1 µM đến 0,3 µM) và nồng độ ion $Mg^{2+}$ (từ 2,0 mM đến 4,0 mM). Đánh giá độ nhạy phân tích (LOD), độ đặc hiệu phân tích và độ lặp lại nội mẻ (intra-assay) cũng như liên mẻ (inter-assay) thông qua hệ số biến thiên CV%.
• Thử nghiệm trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng: Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 50 mẫu đờm từ bệnh nhân nghi nhiễm lao. Phương pháp chọn mẫu thuận tiện được xử lý ly tâm đồng hóa bằng NALC-NaOH 4%, tách chiết DNA bằng phương pháp sốc nhiệt kết hợp enzyme lysozyme và proteinase K. Kết quả real-time PCR được đối chiếu song song với kết quả nuôi cấy và thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh (DST) theo phương pháp tỷ lệ quy chuẩn.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

• Thiết lập thành công 4 phản ứng real-time PCR đơn lẻ đặc hiệu: Phản ứng 1 phát hiện đột biến katG 315 (Ser315Thr); Phản ứng 2 phát hiện đột biến rpoB 516 (Asp516Val); Phản ứng 3 phát hiện đột biến emb 306 (Met306Val, ATG sang GTG); Phản ứng 4 phát hiện đột biến emb 306 (Met306Ile, ATG sang ATA). Tất cả các hệ mồi và mẫu dò đều có cấu trúc liên kết ổn định với năng lượng tự do Gibbs ($\Delta G$) âm, không tạo hetero-dimer bền vững.
• Thông số kỹ thuật tối ưu đạt độ chuẩn hóa cao: Nhiệt độ lai tối ưu cho cả 4 phản ứng được xác định đồng nhất ở 60°C. Nồng độ mồi tối ưu đạt 0,3 µM đến 0,4 µM, nồng độ mẫu dò tối ưu là 0,2 µM, và nồng độ $Mg^{2+}$ đạt hiệu suất khuếch đại cực đại ở mức 3,0 mM.
• Độ tin cậy và độ nhạy phân tích xuất sắc: Độ lặp lại của chu kỳ ngưỡng (Ct) giữa các lần thí nghiệm đạt hệ số biến thiên CV < 2,5%, chứng minh tính ổn định cao của hệ thống. Giới hạn phát hiện của phản ứng đạt ngưỡng $10^2$ đến $10^3$ bản sao DNA/ml bệnh phẩm. Thử nghiệm độ đặc hiệu trên các chủng vi khuẩn khác như Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli hoàn toàn không xuất hiện tín hiệu chéo giả định.
• Hiệu quả kiểm định lâm sàng trên 50 mẫu bệnh phẩm: Quy trình phân tích 50 mẫu đờm lâm sàng phát hiện chính xác các trường hợp mang đột biến kháng INH, RIF và EMB, đạt độ nhạy chẩn đoán 96% và độ đặc hiệu chẩn đoán 100% khi so sánh với kháng sinh đồ kiểu hình.

Thảo luận kết quả

Kết quả thu được minh chứng rằng việc lựa chọn các đột biến điểm tại katG 315, rpoB 516 và emb 306 mang tính đại diện dịch tễ học rất cao cho các chủng lao kháng thuốc lưu hành tại Việt Nam. So sánh với phương pháp kháng sinh đồ truyền thống mất 6 đến 8 tuần, quy trình real-time PCR cho phép đưa ra kết luận chỉ sau 1,5 đến 2 giờ kể từ khi nhận mẫu đờm.

Dữ liệu khuếch đại huỳnh quang được trực quan hóa qua biểu đồ động học đường cong Sigma (Fluorescence vs Cycle number), cho thấy sự tách biệt rõ ràng giữa mẫu đột biến mang tín hiệu huỳnh quang vượt ngưỡng nền (Ct từ 18 đến 32) và mẫu kiểu dại/chứng âm (không có đường cong tăng trưởng). Một bảng ma trận đối chiếu giữa kết quả chu trình nhiệt Ct và đường kính vùng ức chế/tỷ lệ khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy khẳng định độ tương thích hoàn toàn.

So với xét nghiệm GenoType MTBDRplus hay GeneXpert MTB/RIF, hệ thống real-time PCR trong luận văn sử dụng hóa chất và thiết bị mở thông dụng, giúp giảm giá thành xét nghiệm từ 40 USD xuống chỉ còn khoảng 5-7 USD cho mỗi lượt xét nghiệm đầy đủ 3 loại kháng sinh. Điều này mở ra khả năng tiếp cận chẩn đoán phân tử rộng khắp cho các bệnh viện tuyến cơ sở.

Đề xuất và khuyến nghị

• Chuẩn hóa và thương mại hóa bộ sinh phẩm: Hoàn thiện quy trình sản xuất bộ kit multiplex real-time PCR 4 màu huỳnh quang tích hợp trong một giếng phản ứng duy nhất. Mục tiêu hạ giá thành xuống dưới 100.000 VNĐ/phản ứng và hoàn tất hồ sơ cấp phép lưu hành của Bộ Y tế trong vòng 12 đến 18 tháng do các đơn vị nghiên cứu y sinh thực hiện.
• Mở rộng phổ phát hiện đột biến kháng thuốc: Bổ sung thêm các mồi và mẫu dò nhắm vào vùng promoter inhA, các codon 526, 531 của gen rpoB, và gen pncA (kháng Pyrazinamide). Động thái này nhằm nâng tỷ lệ bao phủ phát hiện kháng đa thuốc lên trên 98% trên toàn bộ các biến thể dịch tễ tại Việt Nam.
• Triển khai ứng dụng vào quy trình chẩn đoán sàng lọc thường quy: Ban hành hướng dẫn chuyên môn đưa kỹ thuật real-time PCR vào phác đồ sàng lọc đầu tay tại các bệnh viện Lao và Bệnh phổi tuyến tỉnh trong vòng 24 tháng. Chủ thể điều phối là Chương trình Chống lao Quốc gia (CTCLQG) nhằm rút ngắn thời gian chỉ định đúng phác đồ điều trị xuống còn dưới 24 giờ.
• Tổ chức đào tạo nhân lực và kiểm định chất lượng phòng xét nghiệm: Xây dựng ngân hàng mẫu chứng chuẩn (chuẩn kháng và chuẩn nhạy) để tổ chức các chương trình ngoại kiểm sinh học phân tử định kỳ 6 tháng/lần cho mạng lưới 63 trung tâm kiểm soát bệnh tật (CDC) trên toàn quốc do Viện Phổi Trung ương chủ trì.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Bác sĩ và chuyên gia vi sinh lâm sàng: Nắm bắt cơ chế đột biến kháng kháng sinh của vi khuẩn lao và cách diễn giải kết quả xét nghiệm sinh học phân tử để nhanh chóng điều chỉnh phác đồ điều trị cá thể hóa cho bệnh nhân lao kháng đa thuốc.
• Học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học: Tham khảo chi tiết phương pháp luận thiết kế mồi, mẫu dò TaqMan in silico, cách xử lý cấu trúc thứ cấp và quy trình thực nghiệm tối ưu hóa phản ứng real-time PCR đa yếu tố.
• Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử: Ứng dụng quy trình tách chiết DNA từ mẫu đờm bệnh phẩm đặc, kỹ thuật pha hóa chất Master Mix và phương pháp kiểm soát sai số, loại bỏ nguy cơ nhiễm chéo trong phòng lab.
• Cán bộ quản lý y tế và chuyên trách Chương trình Chống lao: Cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học để xây dựng chính sách, dự toán ngân sách và lựa chọn công nghệ xét nghiệm phát hiện sớm lao đa kháng thuốc phù hợp với điều kiện kinh tế - kỹ thuật tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

• Tại sao kỹ thuật real-time PCR lại ưu việt hơn phương pháp nuôi cấy truyền thống trong chẩn đoán lao kháng thuốc? Real-time PCR phát hiện trực tiếp DNA của vi khuẩn và nhận diện đột biến điểm chỉ trong 1,5 đến 2 giờ, loại bỏ hoàn toàn thời gian chờ 4 đến 8 tuần để vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc. Ngoài ra, hệ thống phản ứng khép kín giúp hạn chế tối đa nguy cơ lây nhiễm chéo cho kỹ thuật viên và môi trường.

• Các đột biến gen cụ thể nào được phát hiện trong nghiên cứu này? Nghiên cứu tập trung phát hiện chính xác 4 đột biến cốt lõi gồm: đột biến gen katG codon 315 (Ser315Thr) gây kháng Isoniazid; đột biến gen rpoB codon 516 (Asp516Val) gây kháng Rifampin; và hai dạng đột biến gen emb codon 306 (Met306Val và Met306Ile) gây kháng Ethambutol.

• Đột biến tại codon 306 gen emb có ý nghĩa lâm sàng như thế nào đối với kháng Ethambutol? Codon 306 của gen embB là vị trí biến đổi then chốt chiếm từ 70% đến 90% các chủng kháng Ethambutol. Sự biến đổi acid amin tại vị trí này làm biến đổi cấu trúc protein màng arabinosyl transferase, khiến thuốc không thể gắn kết để ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn.

• Độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình real-time PCR trong luận văn đạt mức bao nhiêu? Quy trình tối ưu hóa đạt độ nhạy phân tích ở ngưỡng $10^2$ bản sao/ml và độ đặc hiệu phân tích 100% khi thử nghiệm với các vi khuẩn không phải lao. Trên 50 mẫu bệnh phẩm lâm sàng, phương pháp đạt độ nhạy 96% và độ đồng thuận 100% so với kháng sinh đồ kiểu hình.

• Quy trình này có thể triển khai tại các phòng xét nghiệm y tế tuyến tỉnh hay không? Hoàn toàn khả thi vì quy trình được thiết kế dựa trên hệ thống hóa chất và máy real-time PCR mở thông dụng (như ABI 7500, Rotor-Gene hoặc Bio-Rad). Chi phí đầu tư cho mỗi ca xét nghiệm rẻ hơn 3 đến 5 lần so với các hệ thống đóng nhập ngoại.

Kết luận

• Xây dựng thành công quy trình kỹ thuật real-time PCR đơn bước phát hiện đồng thời các đột biến kháng 3 loại thuốc chống lao thiết yếu: Isoniazid (katG 315), Rifampin (rpoB 516) và Ethambutol (emb 306).
• Tối ưu hóa toàn diện các thông số phản ứng với nhiệt độ lai đồng nhất 60°C, nồng độ mồi 0,3-0,4 µM, mẫu dò 0,2 µM và $Mg^{2+}$ 3,0 mM, đảm bảo hệ số biến thiên lặp lại CV < 2,5%.
• Kiểm định lâm sàng trên 50 mẫu bệnh phẩm đờm cho kết quả chính xác cao, rút ngắn thời gian chẩn đoán từ 60 ngày xuống còn dưới 2 giờ, đạt độ tương đồng 100% với kháng sinh đồ chuẩn.
• Đóng góp giải pháp công nghệ sinh học phân tử tự chủ, chi phí thấp, giảm bớt sự phụ thuộc vào các bộ kit thương mại nước ngoài đắt tiền.
• Hướng phát triển tiếp theo là tích hợp đa mồi trong một giếng phản ứng (Multiplex PCR) và chuyển giao công nghệ cho các cơ sở y tế trong mạng lưới phòng chống lao quốc gia. Hãy liên hệ các đơn vị nghiên cứu sinh học phân tử để tiếp nhận và nhân rộng quy trình kỹ thuật hữu ích này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Bệnh lao và vi khuẩn gây bệnh lao đã được biết rõ từ hơn một thế kỷ nay. Những liệu pháp chữa trị bằng kháng sinh tỏ ra hiệu quả từ những năm 1960. Tuy nhiên, trong những thập niên 90 đến nay, đã xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn lao kháng thuốc, rất khó chữa trị và đang có nguy cơ lây lan rất nhanh, đe dọa hàng triệu người trên thế giới. Y học thế giới những năm gần đây đã ghi nhận chủng vi khuẩn gây bệnh lao kháng đa thuốc mới gọi là lao siêu kháng thuốc.

Những người mắc bệnh lao với chủng vi khuẩn mới này cần phải điều trị trên 2 năm so với từ 6-8 tháng như trước đây và chi phí điều trị cũng tăng lên gấp 100 lần. WHO ước tính, đến nay đã có 27 ngàn ca bệnh lao mới kháng thuốc ở 41 quốc gia [47]. Việc điều trị cho bệnh nhân lao kháng đa thuốc hết sức nghiêm ngặt, cần phải theo dõi liên tục trong 2 năm. Một số bệnh nhân sau một thời gian uống thuốc, thấy mình khỏe và không có triệu chứng gì, cho rằng mình đã khỏi bệnh nên tự ý bỏ trị lao.

Bệnh nhân không biết rằng vi trùng lao “sống dai” và rất nguy hiểm. Sau một thời gian “nằm ẩn mình” và tìm cách chống lại thuốc lao, chúng sẽ hoạt động gây bệnh trở lại. Lúc này, người bệnh trở nên bị lao kháng thuốc, và bệnh sẽ nguy hiểm hơn lúc phát bệnh lao ban đầu. Ngoài ra, cũng có những bệnh nhân bị khó chịu do tác dụng phụ của thuốc lao trong quá trình điều trị, nhưng không đến tái khám để bác sỹ điều chỉnh thuốc, mà tự bỏ trị nửa chừng.

Cũng có những bệnh nhân uống thuốc lao không đều đặn, hay uống không đủ liều thuốc…. Tất cả những trường hợp này đều tạo điều kiện thuận lợi cho vi trùng lao trở nên kháng thuốc. Nếu điều trị không đầy đủ, vi khuẩn kháng thuốc càng mạnh hơn và khả năng hồi phục càng trở nên mong manh. Và sẽ cực kỳ nguy hiểm cho cộng đồng, bởi lao kháng đa thuốc đã rất khỏe sẽ từ bệnh nhân lây lan trong cộng đồng do bị phát tán trong không khí, môi trường sinh hoạt [26,28].

Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu [2]. Năm 2007, Việt Nam ước tính có 150 ca nhiễm lao mới/nghìn dân và tỷ lệ mắc HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 1 GVHD: PGS. Nguyễn Thái Sơn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] bệnh là 192 ca/nghìn dân. Tỷ lệ lao đa kháng thuốc trong tổng số ca nhiễm lao mới là 2.7%, và trong tổng số ca đã qua điều trị là 19%.

Theo số liệu bệnh nhân lao đăng ký điều trị lao tại TP. HCM năm 2008, với tỷ lệ kháng đa thuốc (kháng ít nhất với Rifampin và Isoniazid) vào khoảng 3.8% trong số bệnh nhân mới và trên 22% ở bệnh nhân lao tái điều trị [1,2]. Ở nghiên cứu này chúng tôi tập trung nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng 3 loại thuốcchủ yếu trong điều trị lao là Rifampin, Isoniazid, và Ethambutol. Để phát hiện lao đa kháng thuốc có các phương pháp như : làm xét nghiệm nuôi cấy vi trùng lao từ các mẫu bệnh phẩm như đờm, dịch cơ thể… và làm kháng sinh đồ lao.

Quá trình nuôi cấy vi trùng và thử kháng sinh đồ này mất khoảng 2 đến 3 tháng mới có kết quả. Hiện nay, ở Việt Nam đã có xét nghiệm giúp phát hiện kháng thuốc sớm và nhanh hơn là Hain test (thời gian thực hiện xét nghiệm khoảng 5 ngày) và Xpert MTB/RIF (thời gian thực hiện xét nghiệm khoảng 2 giờ). Tuy nhiên, hai xét nghiệm này có giá thành đắt, và không dùng phổ biến cho mọi bệnh nhân bị lao[5]. Hiện nay các tiến bộ trong lĩnh vực công nghệ sinh học đang mang tới rất nhiều lợi ích ứng dụng trong y học.

Một trong số đó là kỹ thuật real-time PCR, sử dụng kỹ thuật real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở, nhanh, nhạy, chính xác, không lệ thuộc vào các hãng sản xuất kít ở nước ngoài, giá thành rẻ hơn,… nên chúng tôi chọn real-time PCR để phát hiện các đột biến kháng isoniazid, Rifampin và ethambutol trên vi khuẩn lao trong mẫu bệnh phẩm. Chính vì những lý do trên nhóm nghiên cứu quyết định thực hiện đề tài: “ Phát hiện Mycobacterium tuberculosis kháng Isoniazid, Rifampin và Ethambutol bằng kỹ thuật real-time PCR”. Đề tài nhằm các mục tiêu sau : 1. Xây dựng quy trình real-time PCR phát hiện nhanh các mẫu lao đột biến kháng Isoniazid (đột biến gen katG ở codon 315 AGC-ACC (Ser315Thr)), Rifampin (đột biến gen rpoB ở codon 516 GAC-GTC (Asp516Val)) và Ethambutol (đột biến gen emb tại codon 306 với 2 loại: ATG-GTG (Met306Val) và ATG-ATA(Met306Ile) ).

Ứng dụng quy trình trên các mẫu bệnh phẩm thực tế. HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 2 GVHD: PGS. Nguyễn Thái Sơn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chƣơng 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình nhiễm lao trên thế giới và tại Việt Nam 1.1 Trên thế giới Bệnh lao đã tồn tại rất lâu cùng con người, khoảng 150000 – 200000 năm. Mặc cho mọi cố gắng của con người trong việc kiểm soát và khống chế bệnh lao, hàng năm vẫn có 8 - 9 triệu trường hợp lao mới và 2 triệu người bị chết do căn bệnh này.

Tỷ lệ mắc lao trên thế giới vẫn tiếp tục tăng 1% mỗi năm. Trong lịch sử nhân loại, bệnh lao đã 5 lần bùng phát và lan rộng thành các vụ đại dịch lao. Trong khoảng 100 - 150 năm gần đây vi khuẩn lao đã dần phát triển trong hầu hết các khu vực trên trái đất [1]. Theo WHO : - Lao là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ 2 sau HIV.

Năm 2012, có 8,6 triệu người nhiễm lao và 1,3 triệu người chết vì lao. - Hơn 95% số người chết tới từ các nước kém và đang phát triển và là một trong ba nguyên nhân gây chết lớn nhất cho phụ nữ từ 15-44 tuổi. - Vào năm 2012, có 530 nghìn trẻ em nhiễm lao và 74 000 trẻ em đã chết. Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 85%, nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 44% số bệnh nhân ước tính.

Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo ước tính của WHO, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người) [47]. Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực Đông - Nam châu Á. Cuối thập niên 70 đầu thập niên 80 ở một số nước phát triển đã tưởng như chế ngự được hoàn toàn bệnh lao, do đó bệnh lao đã đi vào quá khứ bởi sự lãng quên của các nhà y học và khoa học. Tuy nhiên thực tế lại không như vậy bởi sự xuất hiện của cơ chế kháng lại thuốc kháng sinh của khuẩn lao, khiến cho việc phát hiện và điều trị ngày càng trở nên khó khăn và tốn kém.

HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 3 GVHD: PGS. Nguyễn Thái Sơn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Vì vậy bệnh lao vẫn tiếp tục là một trong ba căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới cùng với hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) và sốt rét. Điều này đã một lần nữa khơi dậy các nghiên cứu sâu hơn trong phương pháp phát hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh lao. Bệnh lao là kết quả của nghèo đói và nghèo đói lại là nguyên nhân làm cho bệnh lao phát triển.1 Sơ đồ phân bố lao trên toàn thế giới [47] 1.2 Việt Nam Việt Nam là một trong 22 nước có tình trạng bệnh lao nặng nhất thế giới.

Tại châu Á, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philippines về số lượng bệnh nhân lao. Hiện Việt Nam có khoảng trên 200.000 người mắc bệnh lao. Trong đó, số người mới mắc khoảng 185. Số người nhiễm lao ở Việt Nam chiếm tới 44% dân số.

Số tử vong do lao rất cao, mỗi năm có khoảng 4% trường hợp tức là 3200 – 3500 tử vong. Tỷ lệ lao trẻ em khoảng 60 – 61/ 100. Ước tính mỗi năm có khoảng 20.000 trường hợp lao trẻ em, song hiện nay trung bình chỉ điều trị khoảng 250 – 300 trẻ. Ở người lớn, bệnh lao gặp phổ biến ở người nghèo lứa tuổi 15 -55 tuổi, cao nhất trong lớp người 25 – 40 là những người đang đóng góp nhiều nhất cho xã hội [1,2].

HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 4 GVHD: PGS. Nguyễn Thái Sơn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục tiêu của WHO là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi AFB(+) với tỷ lệ khỏi là 92% [2]. Năm 2002, khu vực Tây-Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới. Trong đó, số bệnh nhân do CTCLQG Việt nam phát hiện chiếm 12% bệnh nhân các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới.

Với những kết quả đạt được trong chỉ tiêu phát hiện và điều trị bệnh nhân, năm 1996, Việt nam là nước đầu tiên ở Châu Á đã đạt được mục tiêu của WHO. Việt nam đã được WHO và Ngân hàng thế giới đánh giá cao thành tích đạt được trong mọi hoạt động chống lao. Từ năm 1997, WHO và Hiệp hội Bài lao và Bệnh phổi Quốc tế cùng phối hợp với CTCLQG Việt Nam tổ chức 8 khoá học về quản lý Chương trình chống lao cho các học viên quốc tế tại Việt Nam. Mô hình hoạt động chống lao ở Việt nam được xem là mô hình để học viên các nước học tập.

Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở các tỉnh phía Nam là 2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%). Trên thực tế có thể chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5% như vậy các con số nêu trên có thể còn lớn hơn. Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác chống lao không những trong những năm tới mà có thể còn trong thời gian khá dài, ngay cả khi đã bước sang thiên niên kỷ mới[2,31]. Hiện tại Việt Nam còn đang gia tăng số lượng người nhiễm lao kháng thuốc.

Thep thống kê của WHO số ca lao kháng thuốc được biết tới cao nhất vào năm 2011 là 610 ca tới năm 2012 thì phát hiện thêm 273 ca. Việt Nam là một trong những nước đang phát triển, điều kiện chăm sóc y tế tại những nơi vùng sâu vùng xa còn kém. Người dân không có thói quen dùng thuốc và điều trị thuốc theo bác sỹ nên tình trạng kháng thuốc đang rất báo động [45,47].