MỞ ĐẦU Bệnh lao và vi khuẩn gây bệnh lao đã được biết rõ từ hơn một thế kỷ nay. Những liệu pháp chữa trị bằng kháng sinh tỏ ra hiệu quả từ những năm 1960. Tuy nhiên, trong những thập niên 90 đến nay, đã xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn lao kháng thuốc, rất khó chữa trị và đang có nguy cơ lây lan rất nhanh, đe dọa hàng triệu người trên thế giới. Y học thế giới những năm gần đây đã ghi nhận chủng vi khuẩn gây bệnh lao kháng đa thuốc mới gọi là lao siêu kháng thuốc.
Những người mắc bệnh lao với chủng vi khuẩn mới này cần phải điều trị trên 2 năm so với từ 6-8 tháng như trước đây và chi phí điều trị cũng tăng lên gấp 100 lần. WHO ước tính, đến nay đã có 27 ngàn ca bệnh lao mới kháng thuốc ở 41 quốc gia [47]. Việc điều trị cho bệnh nhân lao kháng đa thuốc hết sức nghiêm ngặt, cần phải theo dõi liên tục trong 2 năm. Một số bệnh nhân sau một thời gian uống thuốc, thấy mình khỏe và không có triệu chứng gì, cho rằng mình đã khỏi bệnh nên tự ý bỏ trị lao.
Bệnh nhân không biết rằng vi trùng lao “sống dai” và rất nguy hiểm. Sau một thời gian “nằm ẩn mình” và tìm cách chống lại thuốc lao, chúng sẽ hoạt động gây bệnh trở lại. Lúc này, người bệnh trở nên bị lao kháng thuốc, và bệnh sẽ nguy hiểm hơn lúc phát bệnh lao ban đầu. Ngoài ra, cũng có những bệnh nhân bị khó chịu do tác dụng phụ của thuốc lao trong quá trình điều trị, nhưng không đến tái khám để bác sỹ điều chỉnh thuốc, mà tự bỏ trị nửa chừng.
Cũng có những bệnh nhân uống thuốc lao không đều đặn, hay uống không đủ liều thuốc…. Tất cả những trường hợp này đều tạo điều kiện thuận lợi cho vi trùng lao trở nên kháng thuốc. Nếu điều trị không đầy đủ, vi khuẩn kháng thuốc càng mạnh hơn và khả năng hồi phục càng trở nên mong manh. Và sẽ cực kỳ nguy hiểm cho cộng đồng, bởi lao kháng đa thuốc đã rất khỏe sẽ từ bệnh nhân lây lan trong cộng đồng do bị phát tán trong không khí, môi trường sinh hoạt [26,28].
Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu [2]. Năm 2007, Việt Nam ước tính có 150 ca nhiễm lao mới/nghìn dân và tỷ lệ mắc HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 1 GVHD: PGS. Nguyễn Thái Sơn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com bệnh là 192 ca/nghìn dân. Tỷ lệ lao đa kháng thuốc trong tổng số ca nhiễm lao mới là 2.7%, và trong tổng số ca đã qua điều trị là 19%.
Theo số liệu bệnh nhân lao đăng ký điều trị lao tại TP. HCM năm 2008, với tỷ lệ kháng đa thuốc (kháng ít nhất với Rifampin và Isoniazid) vào khoảng 3.8% trong số bệnh nhân mới và trên 22% ở bệnh nhân lao tái điều trị [1,2]. Ở nghiên cứu này chúng tôi tập trung nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng 3 loại thuốcchủ yếu trong điều trị lao là Rifampin, Isoniazid, và Ethambutol. Để phát hiện lao đa kháng thuốc có các phương pháp như : làm xét nghiệm nuôi cấy vi trùng lao từ các mẫu bệnh phẩm như đờm, dịch cơ thể… và làm kháng sinh đồ lao.
Quá trình nuôi cấy vi trùng và thử kháng sinh đồ này mất khoảng 2 đến 3 tháng mới có kết quả. Hiện nay, ở Việt Nam đã có xét nghiệm giúp phát hiện kháng thuốc sớm và nhanh hơn là Hain test (thời gian thực hiện xét nghiệm khoảng 5 ngày) và Xpert MTB/RIF (thời gian thực hiện xét nghiệm khoảng 2 giờ). Tuy nhiên, hai xét nghiệm này có giá thành đắt, và không dùng phổ biến cho mọi bệnh nhân bị lao[5]. Hiện nay các tiến bộ trong lĩnh vực công nghệ sinh học đang mang tới rất nhiều lợi ích ứng dụng trong y học.
Một trong số đó là kỹ thuật real-time PCR, sử dụng kỹ thuật real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở, nhanh, nhạy, chính xác, không lệ thuộc vào các hãng sản xuất kít ở nước ngoài, giá thành rẻ hơn,… nên chúng tôi chọn real-time PCR để phát hiện các đột biến kháng isoniazid, Rifampin và ethambutol trên vi khuẩn lao trong mẫu bệnh phẩm. Chính vì những lý do trên nhóm nghiên cứu quyết định thực hiện đề tài: “ Phát hiện Mycobacterium tuberculosis kháng Isoniazid, Rifampin và Ethambutol bằng kỹ thuật real-time PCR”. Đề tài nhằm các mục tiêu sau : 1. Xây dựng quy trình real-time PCR phát hiện nhanh các mẫu lao đột biến kháng Isoniazid (đột biến gen katG ở codon 315 AGC-ACC (Ser315Thr)), Rifampin (đột biến gen rpoB ở codon 516 GAC-GTC (Asp516Val)) và Ethambutol (đột biến gen emb tại codon 306 với 2 loại: ATG-GTG (Met306Val) và ATG-ATA(Met306Ile) ).
Ứng dụng quy trình trên các mẫu bệnh phẩm thực tế. HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 2 GVHD: PGS. Nguyễn Thái Sơn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình nhiễm lao trên thế giới và tại Việt Nam 1.1 Trên thế giới Bệnh lao đã tồn tại rất lâu cùng con người, khoảng 150000 – 200000 năm. Mặc cho mọi cố gắng của con người trong việc kiểm soát và khống chế bệnh lao, hàng năm vẫn có 8 - 9 triệu trường hợp lao mới và 2 triệu người bị chết do căn bệnh này.
Tỷ lệ mắc lao trên thế giới vẫn tiếp tục tăng 1% mỗi năm. Trong lịch sử nhân loại, bệnh lao đã 5 lần bùng phát và lan rộng thành các vụ đại dịch lao. Trong khoảng 100 - 150 năm gần đây vi khuẩn lao đã dần phát triển trong hầu hết các khu vực trên trái đất [1]. Theo WHO : - Lao là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ 2 sau HIV.
Năm 2012, có 8,6 triệu người nhiễm lao và 1,3 triệu người chết vì lao. - Hơn 95% số người chết tới từ các nước kém và đang phát triển và là một trong ba nguyên nhân gây chết lớn nhất cho phụ nữ từ 15-44 tuổi. - Vào năm 2012, có 530 nghìn trẻ em nhiễm lao và 74 000 trẻ em đã chết. Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 85%, nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 44% số bệnh nhân ước tính.
Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo ước tính của WHO, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người) [47]. Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực Đông - Nam châu Á. Cuối thập niên 70 đầu thập niên 80 ở một số nước phát triển đã tưởng như chế ngự được hoàn toàn bệnh lao, do đó bệnh lao đã đi vào quá khứ bởi sự lãng quên của các nhà y học và khoa học. Tuy nhiên thực tế lại không như vậy bởi sự xuất hiện của cơ chế kháng lại thuốc kháng sinh của khuẩn lao, khiến cho việc phát hiện và điều trị ngày càng trở nên khó khăn và tốn kém.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 3 GVHD: PGS. Nguyễn Thái Sơn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Vì vậy bệnh lao vẫn tiếp tục là một trong ba căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới cùng với hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) và sốt rét. Điều này đã một lần nữa khơi dậy các nghiên cứu sâu hơn trong phương pháp phát hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh lao. Bệnh lao là kết quả của nghèo đói và nghèo đói lại là nguyên nhân làm cho bệnh lao phát triển.1 Sơ đồ phân bố lao trên toàn thế giới [47] 1.2 Việt Nam Việt Nam là một trong 22 nước có tình trạng bệnh lao nặng nhất thế giới.
Tại châu Á, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philippines về số lượng bệnh nhân lao. Hiện Việt Nam có khoảng trên 200.000 người mắc bệnh lao. Trong đó, số người mới mắc khoảng 185. Số người nhiễm lao ở Việt Nam chiếm tới 44% dân số.
Số tử vong do lao rất cao, mỗi năm có khoảng 4% trường hợp tức là 3200 – 3500 tử vong. Tỷ lệ lao trẻ em khoảng 60 – 61/ 100. Ước tính mỗi năm có khoảng 20.000 trường hợp lao trẻ em, song hiện nay trung bình chỉ điều trị khoảng 250 – 300 trẻ. Ở người lớn, bệnh lao gặp phổ biến ở người nghèo lứa tuổi 15 -55 tuổi, cao nhất trong lớp người 25 – 40 là những người đang đóng góp nhiều nhất cho xã hội [1,2].
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 4 GVHD: PGS. Nguyễn Thái Sơn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục tiêu của WHO là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi AFB(+) với tỷ lệ khỏi là 92% [2]. Năm 2002, khu vực Tây-Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới. Trong đó, số bệnh nhân do CTCLQG Việt nam phát hiện chiếm 12% bệnh nhân các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới.
Với những kết quả đạt được trong chỉ tiêu phát hiện và điều trị bệnh nhân, năm 1996, Việt nam là nước đầu tiên ở Châu Á đã đạt được mục tiêu của WHO. Việt nam đã được WHO và Ngân hàng thế giới đánh giá cao thành tích đạt được trong mọi hoạt động chống lao. Từ năm 1997, WHO và Hiệp hội Bài lao và Bệnh phổi Quốc tế cùng phối hợp với CTCLQG Việt Nam tổ chức 8 khoá học về quản lý Chương trình chống lao cho các học viên quốc tế tại Việt Nam. Mô hình hoạt động chống lao ở Việt nam được xem là mô hình để học viên các nước học tập.
Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở các tỉnh phía Nam là 2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%). Trên thực tế có thể chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5% như vậy các con số nêu trên có thể còn lớn hơn. Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác chống lao không những trong những năm tới mà có thể còn trong thời gian khá dài, ngay cả khi đã bước sang thiên niên kỷ mới[2,31]. Hiện tại Việt Nam còn đang gia tăng số lượng người nhiễm lao kháng thuốc.
Thep thống kê của WHO số ca lao kháng thuốc được biết tới cao nhất vào năm 2011 là 610 ca tới năm 2012 thì phát hiện thêm 273 ca. Việt Nam là một trong những nước đang phát triển, điều kiện chăm sóc y tế tại những nơi vùng sâu vùng xa còn kém. Người dân không có thói quen dùng thuốc và điều trị thuốc theo bác sỹ nên tình trạng kháng thuốc đang rất báo động [45,47].