Luận án tiến sĩ: Phân lập tuyển chọn vi khuẩn nội sinh và vùng rễ cây mía trồng trên đất xám Tây Ninh - Hoàng Minh Tâm

• Tác giả: Hoàng Minh Tâm
• Người hướng dẫn: GS. Cao Ngọc Điệp
• Trường học: Đại học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Phân lập, tuyển chọn, nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía (Saccharum spp L.) trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Cần Thơ

Tóm tắt

I. Tổng quan về vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía

Vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía (Saccharum spp L.) là nhóm vi sinh vật sống cộng sinh trong mô cây hoặc phát triển quanh vùng rễ. Nhóm vi khuẩn này đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông qua nhiều cơ chế khác nhau. Các cơ chế bao gồm cố định đạm từ khí quyển, hòa tan lân khó tan trong đất, tổng hợp acid indole-3-acetic (IAA) và sản xuất siderophore. Cây mía là cây công nghiệp quan trọng tại Việt Nam, đặc biệt tại các tỉnh phía Nam như Tây Ninh. Đất xám là loại đất chủ yếu tại vùng trồng mía Tây Ninh, có đặc điểm chua phèn, nghèo dinh dưỡng hữu cơ. Việc nghiên cứu quần xã vi khuẩn cộng sinh với cây mía trên đất xám mở ra hướng tiếp cận mới trong nông nghiệp bền vững. Các chủng vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng cây trồng (PGPR) được kỳ vọng thay thế một phần phân bón hóa học. Điều này giúp giảm chi phí sản xuất và bảo vệ môi trường sinh thái nông nghiệp.

1.1. Khái niệm vi khuẩn nội sinh cây mía

Vi khuẩn nội sinh cây mía là nhóm vi sinh vật cư trú bên trong mô cây như thân, lá, rễ mà không gây bệnh. Chúng sống cộng sinh hoặc song sinh với cây chủ. Vi khuẩn nội sinh có khả năng xâm nhập vào hệ thống mạch dẫn của cây mía. Tại đó, chúng tương tác trực tiếp với quá trình sinh lý của cây. Một số chủng vi khuẩn nội sinh sản xuất các chất kích thích tăng trưởng tự nhiên. Chúng cũng tham gia vào quá trình cố định đạm ngay trong mô cây. Nhờ vị trí sống bên trong cây, vi khuẩn nội sinh được bảo vệ khỏi các yếu tố bất lợi từ môi trường bên ngoài.

1.2. Vai trò vi khuẩn vùng rễ cây mía

Vi khuẩn vùng rễ cây mía phát triển mạnh trong vùng đất tiếp xúc trực tiếp với hệ thống rễ. Khu vực này gọi là quyển rễ (rhizosphere), nơi tập trung nhiều chất hữu cơ do rễ cây tiết ra. Vi khuẩn vùng rễ sử dụng các chất này làm nguồn carbon và năng lượng. Đổi lại, nhiều chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm tự do từ không khí. Một số chủng khác hòa tan phosphat khó tan thành dạng cây trồng hấp thụ được. Vi khuẩn vùng rễ còn tổng hợp hormone IAA kích thích phát triển bộ rễ. Sản xuất siderophore giúp cây mía hấp thu sắt hiệu quả hơn trong đất thiếu vi lượng.

II. Thách thức trong canh tác mía và ô nhiễm môi trường

Ngành công nghiệp mía đường đối mặt nhiều thách thức về môi trường và bền vững. Canh tác mía quy mô công nghiệp tiêu thụ lượng lớn phân bón vô cơ và thuốc bảo vệ thực vật. Lượng phân đạm và lân hóa học sử dụng hàng năm gây ô nhiễm đất và nước ngầm. Các chất diệt cỏ như atrazine, diuron, 2,4-D và alachlor phổ biến trong canh tác mía. Những hóa chất này hòa tan trong nước, xâm nhập đất và nguồn nước mặt. Tại các nước sản xuất mía lớn như Brazil, ngành công nghiệp này gây phát thải khí nhà kính. Methane và nitrogen oxide là hai khí chính được giải phóng từ ruộng mía. Đất trồng mía bị thay đổi tính chất vật lý, hóa học và sinh học theo thời gian. Cỏ dại cạnh tranh dinh dưỡng, có thể gây thiệt hại 20-25% năng suất mía. Sự xuống cấp chất lượng nước mặt và không khí ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ sinh thái. Giải pháp sinh học sử dụng vi khuẩn có lợi là hướng đi cần thiết cho ngành mía bền vững.

2.1. Ô nhiễm hóa chất từ canh tác mía công nghiệp

Canh tác mía đường sử dụng lượng lớn phân bón vô cơ chứa nitơ và phosphor. Lượng phân bón dư thừa không được cây hấp thụ sẽ rửa trôi vào nguồn nước. Hiện tượng phú dưỡng xảy ra khi phosphor tích lũy quá mức trong ao hồ. Thuốc diệt cỏ chiếm tỷ trọng lớn trong tổng lượng hóa chất sử dụng. Có đến 50% thuốc diệt cỏ toàn cầu được dùng cho mía đường thương mại. Atrazine là chất phổ biến nhất, có khả năng tồn lưu lâu trong đất. Các hóa chất này gây độc cho sinh vật đất và vi sinh vật có ích. Ô nhiễm nước ngầm ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng dân cư vùng trồng mía.

2.2. Suy thoái đất và giảm đa dạng sinh học

Đất trồng mía liên tục bị mất chất hữu cơ do canh tác thâm canh kéo dài. Cấu trúc đất bị phá vỡ, khả năng giữ nước và dinh dưỡng giảm sút. Quá trình xói mòn diễn ra mạnh trên các triền đồi trồng mía. Đa dạng vi sinh vật đất bị suy giảm nghiêm trọng do ảnh hưởng hóa chất. Các quần xã vi khuẩn có lợi như vi khuẩn cố định đạm bị ức chế phát triển. Đất chua phèn tại Tây Ninh càng làm trầm trọng thêm vấn đề suy thoái. Cân bằng hệ sinh thái vi sinh vật đất bị đảo lộn, thuận lợi cho vi khuẩn gây bệnh. Việc khôi phục đa dạng vi sinh vật đất là nhiệm vụ cấp bách.

III. Phương pháp phân lập tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn mía

Quy trình phân lập vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía bao gồm nhiều bước. Mẫu vật được thu thập từ rễ và thân cây mía tại các ruộng trồng trên đất xám Tây Ninh. Vi khuẩn nội sinh được phân lập sau khi xử lý bề mặt mẫu bằng thuốc tẩy và ethanol. Mẫu được nghiền và pha loãng trên môi trường nuôi cấy chọn lọc. Các kỹ thuật không phụ thuộc nuôi cấy cũng được áp dụng song song. Khuếch đại và phân tích trình tự 16S rDNA là phương pháp chính để nhận diện vi khuẩn. Các phần mềm phân tích sinh học tin học giúp xác định loài và xây dựng cây phát sinh. Tuyển chọn chủng vi khuẩn dựa trên bốn đặc tính quan trọng. Đó là khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA và sản xuất siderophore. Các xét nghiệm sinh hóa và sinh học phân tử được kết hợp để đánh giá toàn diện. Kết quả cho phép xây dựng mô hình quần xã vi khuẩn tự nhiên trên cây mía Tây Ninh.

3.1. Kỹ thuật phân lập vi khuẩn từ mẫu cây mía

Phân lập vi khuẩn nội sinh yêu cầu xử lý vô trùng bề mặt mẫu cây mía. Mẫu thân và rễ được rửa sạch, ngâm trong ethanol 70% và sodium hypochlorite. Sau đó, mẫu được nghiền trong dung dịch đệm vô trùng rồi pha loãng nhiều lần. Dung dịch pha loãng được cấy trên các môi trường chọn lọc như TSA, NA, PDA. Các đĩa cấy được ủ ở nhiệt độ 28-30°C trong 24-72 giờ. Các khuẩn lạc có hình thái khác nhau được thuần hóa bằng cách cấy lại nhiều lần. Vi khuẩn vùng rễ được phân lập từ mẫu đất bám quanh rễ cây mía. Mẫu đất được pha loãng seri và cấy trên môi trường chọn lọc tương ứng.

3.2. Kỹ thuật nhận diện bằng trình tự 16S rDNA

Nhận diện vi khuẩn bằng trình tự 16S rDNA là phương pháp chuẩn trong vi sinh vật học phân tử. ADN được chiết xuất từ khuẩn lạc vi khuẩn thuần khiết bằng bộ kit chuyên dụng. Vùng 16S rDNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu 27F và 1492R. Sản phẩm PCR được giải trình tự bằng phương pháp Sanger hiện đại. Trình tự thu được so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank sử dụng thuật toán BLAST. Phần mềm MEGA và ClustalW hỗ trợ phân tích phát sinh loài. Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phương pháp Neighbor-Joining với bootstrap 1000 lần. Kết quả cho phép xác định chính xác loài và vị trí phân loại của chủng vi khuẩn.

IV. Ứng dụng vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng cây trồng bền vững

Kết quả phân lập và nhận diện vi khuẩn nội sinh, vi khuẩn vùng rễ mở ra nhiều ứng dụng thực tiễn. Các chủng vi khuẩn PGPR được tuyển chọn có thể phát triển thành chế phẩm sinh học. Chế phẩm vi khuẩn phối hợp nhiều chủng cho hiệu quả cao hơn so với chủng đơn lẻ. Nghiên cứu trên cây bắp cho thấy vi khuẩn vùng rễ mía có thể tăng sinh khối gấp 3,4 lần. Các thành viên của cộng đồng vi khuẩn tổng hợp xâm chiếm hiệu quả cơ quan cây trồng. Chúng thay thế vi sinh vật tự nhiên và chiếm ưu thế trong quần xã vi sinh vật vùng rễ. Ứng dụng trên cây mía giúp giảm 20-30% lượng phân đạm hóa học. Phân lân khó tan được chuyển hóa thành dạng cây hấp thụ dễ dàng. Chế phẩm sinh học vi khuẩn cải thiện sức khỏe đất và đa dạng vi sinh vật. Hướng nghiên cứu này phù hợp với mục tiêu nông nghiệp bền vững và giảm phát thải carbon. Công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn cần được chuyển giao cho nông dân trồng mía tại Tây Ninh.

4.1. Phát triển chế phẩm vi khuẩn phối hợp nhiều chủng

Chế phẩm vi khuẩn phối hợp nhiều chủng dựa trên nguyên lý cộng sinh và hiệp đồng. Mỗi chủng vi khuẩn đảm nhận chức năng riêng biệt trong việc thúc đẩy tăng trưởng. Chủng cố định đạm kết hợp với chủng hòa tan lân tạo hiệu ứng kép. Chủng sản xuất siderophore giúp cây hấp thu sắt, bổ sung cho nhóm tổng hợp IAA. Chế phẩm phối hợp dựa trên sự phong phú quần xã tự nhiên có hiệu quả vượt trội. Quy trình sản xuất chế phẩm bao gồm lên men lỏng, cô đặc và bảo quản dạng bột hoặc lỏng. Thời hạn sử dụng và điều kiện bảo quản là yếu tố quan trọng trong ứng dụng thực tế. Chế phẩm cần được kiểm tra tính an toàn trước khi đưa ra thị trường.

4.2. Triển vọng ứng dụng trên cây mía tại Tây Ninh

Đất xám tỉnh Tây Ninh có đặc điểm chua phèn, nghèo dinh dưỡng hữu cơ sẵn có. Vi khuẩn nội sinh và vùng rễ cây mía bản địa phù hợp với điều kiện đất địa phương. Các chủng vi khuẩn tuyển chọn từ chính ruộng mía Tây Ninh có khả năng thích nghi cao. Ứng dụng chế phẩm vi khuẩn giúp giảm chi phí phân bón cho nông dân trồng mía. Năng suất mía được cải thiện đồng thời bảo vệ môi trường đất và nước. Mô hình canh tác mía bền vững kết hợp chế phẩm sinh học cần được nhân rộng. Nghiên cứu tiếp theo cần đánh giá hiệu quả thực tế trên quy mô ruộng sản xuất. Sự hợp tác giữa viện nghiên cứu và doanh nghiệp mía đường là chìa khóa thành công.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ HOÀNG MINH TÂM PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, NHẬN DIỆN VI KHUẨN NỘI SINH VÀ VI KHUẨN VÙNG RỄ CÂY MÍA (Saccharum spp L.) TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM TỈNH TÂY NINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62 42 01 07 Cần Thơ, 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ HOÀNG MINH TÂM PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, NHẬN DIỆN VI KHUẨN NỘI SINH VÀ VI KHUẨN VÙNG RỄ CÂY MÍA (Saccharum spp L.) TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM TỈNH TÂY NINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62 42 01 07 Người hướng dẫn khoa học GS. CAO NGỌC ĐIỆP PGS. NGUYỄN BẢO TOÀN Cần Thơ, 2021 LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin được gửi lời cám ơn đến Thầy, GS. Cao Ngọc Điệp và Thầy, PGS. TS Nguyễn Bảo Toàn, đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và thực hiện luận án tiến sĩ. Chân thành cảm ơn quý Thầy Cô của trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là các Thầy Cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học đã truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức bổ ích, kinh nghiệm quý báu, phục vụ quá trình nghiên cứu thực hiện luận án. Chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học, Khoa Sau Đại học và các Phòng Ban khác của Trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Lãnh đạo các đơn vị của Trường Đại học Sài Gòn đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi suốt thời gian làm nghiên cứu sinh. Chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn đồng nghiệp Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ và Trường Đại học Sài Gòn đã quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian làm nghiên cứu sinh. Chân thành cảm ơn các em sinh viên, học viên cao học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ và các em sinh viên Khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên Trường Đại học Sài Gòn đã cộng tác cùng tôi trong thời gian thực hiện thí nghiệm. Chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Mía đường Thành Thành Công, Tây Ninh đã hỗ trợ và giúp tôi triển khai thực hiện các thí nghiệm trong chậu và ngoài đồng. Đặc biệt gửi lời cảm ơn sâu sắc đến em Nguyễn Thị Xuân Mỵ, Nguyễn Tây Khoa, Lê Đức Toàn người đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình triển khai và thực hiện nghiên cứu. Sau cùng xin được gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, những người thân trong gia đình, vợ và các con đã ủng hộ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm nghiên cứu sinh. Hoàng Minh Tâm i TÓM TẮT Luận án nhằm phân lập, tuyển chọn, nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía (Saccharum spp L.) trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA và sản xuất siderophore. Các đặc tính này giúp thúc đẩy sự tăng trưởng và năng suất của mía, đồng thời giảm thiểu lượng phân đạm, lân hóa học cũng như sự ảnh hưởng tiêu cực lên môi trường và sức khỏe con người. Vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía có khả năng cố định đạm và hòa tan lân đã được phân lập trên môi trường Burk, LGI không đạm và môi trường NBRIP chứa phosphate khó tan. Đánh giá khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA, siderophore của các dòng vi khuẩn đã được thực hiện thông qua phương pháp so màu. Định danh các dòng vi khuẩn đã chọn dựa trên trình tự gene 16S rRNA bằng phương pháp sinh học phân tử và công cụ tin sinh học. Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật đã được đánh giá trên cây mía trồng trong điều kiện nhà lưới, trong chậu và ngoài đồng. Kết quả là đã phân lập được 422 dòng vi khuẩn, trong đó có 246 dòng vi khuẩn vùng rễ và 176 dòng vi khuẩn nội sinh có cả hai khả năng cố định đạm và hòa tan lân, 101 dòng có khả năng tổng hợp IAA, và 81 dòng có khả năng sinh siderophore. Ba mươi sáu dòng tuyển chọn đã được định danh dựa trên trình tự gene 16S rRNA với mức tương đồng trình tự từ 95 – 100% so với các chủng vi khuẩn có trong cơ sở dữ liệu của Genbank, NCBI. Các dòng vi khuẩn này thuộc về các chi Enterobacter, Burkholderia, Bacillus, Stenotrophomonas, Kosakonia, Serratia, Advenella, Paraburkholderia, Chitinophaga, Herbaspirillum, và Acinetobacter. Mười hai trong số 36 dòng đã định danh được tiếp tục chọn lựa để đánh giá khả năng thúc đẩy sự phát triển của cây mía nuôi cấy mô trồng trong bình Leonard. Hai dòng tốt nhất là vi khuẩn nội sinh cây mía CT4bd (Serratia oryzae) và vi khuẩn vùng rễ cây mía TPD3b (Bacillus subtilis) đã được tiếp tục đánh giá sự thúc đẩy tăng trưởng của cây mía trồng trong chậu và ngoài đồng. Sự kết hợp của 2 dòng CT4bd và TP3b cho thấy khả năng thúc đẩy sinh trưởng của cây mía cao nhất. Đối với mía trồng trong chậu và ngoài đồng, khi sử dụng phối hợp 2 dòng vi khuẩn với 75% lượng phân N và P đã cho kết quả về năng suất mía ngang bằng với nghiệm thức sử dụng 100% phân N và P hóa học. Ngoài ra, năng suất đường cũng tăng 14%, tương đương 1,02 tấn/ha trong điều kiện trồng ngoài đồng. Hai dòng vi khuẩn tiềm năng CT4bd và TP3b đã được đề xuất tiếp tục khảo nghiệm khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật trên nhiều giống mía khác nhau ở cả vụ mía tơ và mía gốc ở các vùng mía nguyên liệu khác nhau của tỉnh Tây Ninh. Từ khóa: cố định đạm, đất xám, hòa tan phosphate, mía, thúc đẩy tăng trưởng thực vật, vi khuẩn nội sinh, vi khuẩn vùng rễ. ii ABSTRACT The thesis aims to isolate, characterize and identify endophytic bacteria and rhizospheric bacteria from sugarcane (Saccharum spp L.) grown on acrisols in Tay Ninh province with capacities of nitrogen fixation, phosphate solubilization, IAA synthesis and siderophore production. These characteristics help promote the growth and yield of sugarcane, while minimizing the amount of chemical nitrogenous and phosphorus fertilizer as well as negative impacts on the environment and human health. Endophytic and rhizospheric bacteria of sugarcane capable of nitrogen fixation and phosphate solubilization were isolated on N-free Burks’ and LGI media and NBRIP media containing insoluble phosphate. Evaluation of nitrogen fixation, phosphorus solubility, IAA and siderophore synthesis of bacterial strains was done through colorimetric method. Identification of selected bacterial strains based on 16S rRNA gene sequence by molecular biology method and bioinformatics tool. The ability to promote plant growth was assessed in sugarcane grown in net houses, pots and field. As a result, 422 bacterial strains were isolated, including 246 rhizospheric isolates and 176 endophytic isolates capable of nitrogen fixation and phosphorus solubilization, 101 isolates are capable of synthesizing IAA, and 81 isolates are capable of producing siderophore. Thirty-six selected strains were identified based on the 16S rRNA gene with sequence similarity from 95 to 100% compared with strains found in Genbank database, NCBI. These strains belong to the genera Enterobacter, Burkholderia, Bacillus, Stenotrophomonas, Kosakonia, Serratia, Advenella, Paraburkholderia, Chitinophaga, Herbaspirillum, and Acinetobacter. Twelve of the 36 identified isolates were selected to evaluate their ability to promote the growth of sugarcane grown in Leonard jars. The two best bacterial strains, the endophytic bacteria CT4bd (Serratia oryzae) and the rhizospheric bacteria TPD3b (Bacillus subtilis), were further evaluated for their ability to promote the growth of potted and field sugarcane plants. The combination of these two isolates showed the highest ability to promote the growth of sugarcane. In terms of sugarcane grown in pots and in the field, when using a combination of the two bacterial isolates and 75% of N and P fertilizer amount, the result was equal to the sugarcane yield of the treatment of 100% chemical N and P fertilizer. In addition, sugar yield also increased by about 14%, equivalent to about 1.02 tons/ha in field trial. These two potential isolates CT4bd and TPD3b have been proposed to continue testing their ability to promote plant growth on many different sugarcane varieties in both plant-cane and ratoon crops in different raw material sugarcane areas of Tay Ninh province. Key words: acrisols, endophytic bacteria, phosphate solubilization, nitrogen fixation, plant growth promotion, sugarcane, rhizospheric bacteria. iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN . ii MỤC LỤC . v DANH MỤC BẢNG . ix DANH MỤC HÌNH. xii Chương 1: GIỚI THIỆU . Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu . Mục tiêu nghiên cứu . Phạm vi nghiên cứu . Nội dung nghiên cứu . Ý nghĩa nghiên cứu . Thời gian thực hiện và địa điểm nghiên cứu . Các điểm mới của nghiên cứu. 5 Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU . Hiện trạng sản xuất mía đường của tỉnh Tây Ninh . Đặc điểm khí hậu, đất đai của tỉnh Tây Ninh . Đặc điểm vùng mía đường Tây Ninh . Các vấn đề về môi trường và sức khoẻ phát sinh từ việc trồng mía13 2. Đối với thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ . Đối với phân bón hoá học . Đa dạng các vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía . Các khái niệm vi khuẩn vùng rễ, vi khuẩn nội sinh, vi khuẩn liên kết thực vật và vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật . Các vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía . Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các vi khuẩn liên kết cây mía trồng trên đất v xám . Tình hình nghiên cứu về các đặc tính của vi khuẩn liên kết cây mía trồng trên đất xám . Tình hình nghiên cứu về hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn liên kết trên cây mía . Các phương pháp thường được sử dụng trong nghiên cứu phân lập, đặc tính hoá và nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía . Xử lý mẫu để phân lập vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh thực vật . Xác định khả năng cố định đạm của vi khuẩn . Xác định khả năng hoà tan lân của vi khuẩn . Xác định khả năng sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn . Xác định khả năng sản xuất siderophore của vi khuẩn . Định danh vi khuẩn liên kết cây mía dựa trên trình tự gene 16S rRNA . Nuôi cấy mô thực vật và một số kết quả trong vi nhân giống mía 51 2. Một số nguyên lý và vai trò của nuôi cấy mô thực vật . Quy trình và một số kết quả trong vi nhân giống mía . 52 Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm .