ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lao là một bệnh truyền nhiễm có tính lây nhiễm cao, diễn biến lâm sàng phức tạp và thời gian điều trị kéo dài. Theo thống kê của WHO (2018), với sự nỗ lực không ngừng của toàn thế giới, từ năm 2000 đến 2018 ước tính có khoảng 53 triệu người đã được phát hiện và điều trị lao giúp giảm tỷ lệ tử vong do lao xuống còn 37%. Mặc dù đã được tập trung kiểm soát, bệnh lao vẫn là một trong 10 nguyên nhân tử vong hàng đầu và là nguyên nhân tử vong số 1 do bệnh truyền nhiễm (trên cả HIV). Việt Nam là một trong những điểm nóng của bệnh lao, đứng thứ 14 trong số 30 nước có gánh nặng cao do lao (WHO, 2018).
Năm 2017, tổng số trường hợp mắc lao được báo cáo ở Việt Nam là 105.733 bệnh nhân trong số đó có khoảng 80% là bệnh nhân lao phổi mới mắc và tái nhiễm. Mặc dù trên toàn thế giới, tỷ lệ mắc lao đang giảm đi khoảng 2% mỗi năm nhưng đến nay bệnh lao vẫn còn là vấn đề thách thức do sự phát triển và lan rộng của lao kháng thuốc. Bệnh nhân mang lao kháng thuốc thường có thời gian điều trị kéo dài, tốn kém. Ở Việt Nam theo ước tính trung bình chi phí cho một bệnh nhân lao đa kháng thuốc khoảng gần 400 USD cao hơn nhiều so với chi phí hơn 150 USD cho bệnh nhân lao thông thường.
Theo thống kê mới nhất của WHO, trên toàn cầu 3,5% trường hợp lao mới và 18% trường hợp lao tái trị có kháng Rifampicin hoặc đa kháng Rifampicin và Isoniazid (MDR/RR-TB). Ở Việt Nam con số này ước tính tương ứng là 4,1% và 17%. Tuy nhiên đây chỉ là con số ước tính vì chỉ có khoảng 32%-67% được thực hiện đánh giá tính kháng thuốc với Rifampicin (WHO, 2018). Trong các thuốc chống lao hàng một, ngoài Rifampicin và Isoniazid là hai thuốc quan trọng nhất trong các phác đồ điều trị lao còn có Streptomycin, Ethambutol, Pyrazinamid.
Trong những năm gần đây, tình hình kháng thuốc với 3 loại thuốc này ít được quan tâm, báo cáo. Việc chỉ tập trung vào hai thuốc quan trọng nhất là Rifampicin và Isoniazid có thể bỏ qua các biến động đáng chú ý về tình hình kháng thuốc của ba thuốc này. Theo hướng dẫn của WHO cũng như của Bộ Y tế, Isoniazid được dùng trong hầu hết các đối tượng bệnh nhân lao theo tuổi, giới, trong các phác đồ điều trị bệnh nhân lao mới, lao tái trị và kể cả điều trị dự phòng lao. Isoniazid được chuyển hóa bởi Khoa Sinh học 1 Khoá 2016-2018 z Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà enzyme NAT2 tại gan.
Đa hình di truyền gen NAT2 được biết đến có liên quan chặt chẽ tới đáp ứng Isoniazid trên các bệnh nhân mắc lao. Nghiên cứu tại Nam Phi cho thấy mặc dù > 98% bệnh nhân tuân thủ điều trị nhưng tình hình kháng thuốc vẫn xảy ra và một nghiên cứu khác cũng khẳng định kháng thuốc không phải chỉ do không tuân thủ điều trị mà còn do sự khác biệt về dược động học của thuốc giữa các cá thể. Mặt khác một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng yếu tố di truyền của bệnh nhân cũng có thể là một trong những yếu tố nguy cơ đối với việc việc lây nhiễm vi khuẩn lao. Tại Việt Nam, việc chẩn đoán lao kháng thuốc thật sự còn là vấn đề hết sức khó khăn tại các bệnh viện, kể cả những bệnh viện tuyến Trung ương.
Chỉ một số lượng nhất định bệnh nhân được chỉ định làm kháng sinh đồ và thời gian này mất khoảng 2-3 tháng mới có kết quả do vi khuẩn lao sinh trưởng tương đối chậm trong quá trình nuôi cấy. Hiện nay một số các test phân tử được áp dụng để chẩn đoán nhanh lao kháng thuốc là Hain test hay Xpert MTB/RIF. Tuy nhiên, các xét nghiệm này giá thành khá cao và không được chỉ định rộng rãi. Hơn nữa các kit thương mại này mới chỉ đánh giá được lao kháng Rifampicin, Isoniazid chứ chưa đánh giá được với các thuốc khác trong thuốc kháng lao hàng một.
Từ thực tiễn chẩn đoán và điều trị lao, với mục tiêu xác định được tính kháng thuốc của các thuốc chống lao hàng một và tiên lượng nguy cơ mắc vi khuẩn lao kháng thuốc Isoniazid liên quan đến yếu tố di truyền gen NAT2 ở bệnh nhân lao phổi, chúng tôi đề xuất đề tài “Khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn lao phân lập từ bệnh nhân lao điều trị bằng Isoniazid và đánh giá ảnh hƣởng của gen NAT2 của bệnh nhân lao đến tính kháng thuốc Isoniazid”. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được tính kháng thuốc của vi khuẩn lao với các thuốc chống lao hàng một trên bệnh nhân lao phổi; Xác định được đa hình di truyền gen NAT2 và mối liên quan tới tính kháng thuốc Isoniazid của vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao phổi. Khoa Sinh học 2 Khoá 2016-2018 z Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Giới thiệu về vi khuẩn lao 1.
Hình thể, cấu trúc Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ Actinomycetales, phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, chi Mycobacterium, gồm hơn 169 loài, đa phần không gây bệnh cho người. Nhóm vi khuẩn gây bệnh lao cho người được gọi là nhóm Mycobacterium tuberculosis complex (MTBc) gồm có các loài chính như Mycobacterium tuberculosis (trực khuẩn lao người), Mycobacterium bovis (trực khuẩn lao bò), Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti. Trong đó quan trọng nhất là loài Mycobacterium tuberculosis[64]. Mycobacterium được gọi là trực khuẩn kháng cồn kháng acid, được Robert Koch phân lập năm 1882, gọi tắt là BK (Bacille de Koch).
tuberculosis là trực khuẩn thanh mảnh, hơi cong, kích thước 0,5 x 2-6 µm. Chúng không có vỏ, không có lông và không có nha bào. Trong bệnh phẩm chúng thường đứng thành từng đám nối đầu vào nhau. Thành tế bào của M.
tuberculosis chỉ chứa một lượng nhỏ peptidoglycan, nhưng chứa nhiều lipid tạo nên tính kháng cồn - kháng acid, và làm cho vi khuẩn lao không nhuộm được bằng phương pháp thông thường mà phải nhuộm bằng phương pháp Ziehl - Neelsen (hình 1. tuberculosis nhuộm Ziehl - Neelsen, vật kính dầu 100x Khoa Sinh học 3 Khoá 2016-2018 z Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà 1. Khả năng gây bệnh 1. Độc lực và con đường lây truyền Trực khuẩn lao không có ngoại độc tố và nội độc tố.
Độc lực của vi khuẩn lao có thể liên quan đến yếu tố sợi và lớp sáp ở vách tế bào. Các chủng lao độc lực có chứa nhiều yếu tố sợi có bản chất hóa học là 6,6’-dimycoly trehalose. Yếu tố sợi này làm vi khuẩn lao gắn với nhau thành bó và khi mất đi sẽ làm giảm độc lực. Vi khuẩn lao có thể sống sót trong đại thực bào sau khi bị thực bào.
Vi khuẩn lao phát triển trong đại thực bào, phá vỡ tế bào và xâm nhập đại thực bào khác [15]. Bệnh lao lây chủ yếu qua đường hô hấp. Người bị nhiễm lao do hít phải những giọt đờm (đường kính 1 - 5 μm) có chứa vi khuẩn lao từ bệnh nhân lao ho, hắt hơi vào không khí. Các vi khuẩn khi qua được hàng rào thứ nhất của cơ thể sẽ ở lại phế nang và tiến triển thành viêm phế quản phổi với phần lớn các trường hợp có triệu chứng không rõ ràng.
Vi khuẩn cũng có thể lây nhiễm sang thai nhi bằng đường máu qua tĩnh mạch rốn nếu mẹ bị lao cấp tính hoặc qua nước ối khi chuyển dạ nếu mẹ bị lao niêm mạc tử cung, âm đạo. Đôi khi, đường lây khác có thể là đường tiêu hóa khi uống sữa bò bị bệnh do M. Từ cơ quan bị lao ban đầu, trực khuẩn lao theo đường máu và bạch huyết đến các cơ quan khác để gây bệnh (lao hạch, lao mang não lao xương). Tuy nhiên, con đường truyền bệnh quan trọng nhất với bệnh lao là đường hô hấp [11], [15].
Cơ chế gây bệnh Bệnh lao là một loại bệnh nhiễm trùng bên trong tế bào và tiến triển mạn tính. Vi khuẩn lao khi xâm nhập vào phế nang sẽ bị các đại thực bào tiêu diệt một phần. Những tế tào không bị đại thực bào tiêu diệt sẽ tiếp tục nhân lên trong đại thực bào và dần thành nang lao. Nếu các nang lao vỡ ra vi khuẩn lao lây nhiễm rộng, sinh sản và bệnh lao xuất hiện.
Khi tiếp xúc lần đầu với vi khuẩn lao thì một phản ứng viêm cấp tính nhẹ ở phổi xuất hiện. Sau khi vi khuẩn lao bị thực bào, ở người có đáp ứng miễn dịch tế bào đầy đủ, sau 4 - 6 tuần lymphokin được sản xuất, hoạt hóa đại thực bào giết Khoa Sinh học 4 Khoá 2016-2018 z Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà chết vi khuẩn lao. Cơ thể sinh ra đáp ứng quá mẫn muộn với vi khuẩn lao, kết quả là hình thành u hạt. Tiếp theo là hoại tử ở trung tâm, bã đậu hoá, xơ hoá và hình thành sẹo.
Sau khi liền tổn thương tiên phát, vi khuẩn lao vẫn không bị diệt hoàn toàn. Chúng có thể tồn tại mãi trong cơ thể dưới dạng không hoạt động, những người nhiễm lao thường chỉ biểu hiện ở test tuberculin (+) và không có khả năng lây nhiễm. Ở những người này có khoảng 10% vi khuẩn lao tái hoạt động trở thành người mắc lao. Ngoài ra các yếu tố nguy cơ đối với việc mắc lao như: tuổi trẻ, bệnh đi kèm như đái tháo đường, bụi phổi, HIV, phụ nữ có thai, yếu tố cơ địa - yếu tố gen [11].
Nuôi cấy vi khuẩn lao Để chuẩn đoán xác định có nhiều phương pháp cận lâm sàng như nhuộm Ziehl-Neelsen tìm AFB, Xpert MTB/RIF, nuôi cấy…. trong đó xét nghiệm nuôi cấy vi khuẩn lao là tiêu chuẩn vàng. Vi khuẩn lao thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, nhiệt độ thích hợp là 37oC và dưới áp suất của oxy là 100 mmHg. Đây là một trong những lý do giải thích tại sao lao phổi là thể bệnh gặp nhiều nhất.
Vi khuẩn lao không nuôi được ở môi trường thông thường, phải nuôi ở môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng (hình 1. Khuẩn lạc đƣợc phóng đại b. Khuẩn lạc trên LJ Hình 1.tuberculosis nuôi cấy trên môi trƣờng đặc [24], [60] Khoa Sinh học 5 Khoá 2016-2018 z Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà Vi khuẩn lao mọc rất chậm, thời gian phân chia khoảng 20-24 giờ một lần trên môi trường thử nghiệm. Trên môi trường Lowenstein- Jensen (LJ, gồm chủ yếu khoai tây, lòng đỏ trứng gà, asparagin, glycerin 0,75%), sau 4-6 tuần vi khuẩn lao mới hình thành khuẩn lạc điển hình.
Khuẩn lạc dạng R, sần sùi như hình hoa lơ. Trên môi trường lỏng (canh thang Sauton, Middlebbrook 7H9, 7H12) vi khuẩn lao mọc thành váng, đám hoặc lắng cặn.