Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu quy trình biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp esa t6 cfp10 phục vụ việc chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao 07

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus nghiên cứu quy trình biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp esa t6 cfp10 phục vụ việc chế, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề

• Tác giả: Hà Thị Hiên
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thái Sơn
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu quy trình biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 phục vụ việc chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. KHÁI QUÁT VỀ BỆNH LAO
• 1.2. VI KHUẨN LAO
• 1.2.1. Đặc điểm phân loại
• 1.2.2. Đặc điểm hình thái
• 1.2.3. Cấu trúc thành tế bào
• 1.2.4. Đặc điểm nuôi cấy
• 1.2.5. Môi trường và dạng khuẩn lạc
• 1.2.6. Chu kì tế bào
• 1.2.7. Khả năng gây bệnh
• 1.2.8. Đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao
• 1.2.9. Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosis
• 1.2.10. Đặc điểm di truyền của vùng gene biệt hóa RD1
• 1.3. PROTEIN ESAT6/CFP10
• 1.3.1. Cấu trúc phân tử của phức hệ protein ESAT6/CFP10
• 1.3.2. Kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6-CFP10 và tiềm năng ứng dụng
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 2.2.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử
• 2.2.2.1. Tách chiết ADN
• 2.2.2.2. PCR khuếch đại gen mã hóa protein ESAT6-CFP10
• 2.2.2.3. Tách dòng gen mã hóa protein ESAT6-CFP10
• 2.2.2.4. Giải trình tự ADN
• 2.2.2.5. Thiết kế vector tách dòng pGEMT chứa đoạn gen mã hóa protein CFP10/ESAT6
• 2.2.2.6. Thiết kế vector biểu hiện pET21a chứa đoạn gen mã hóa protein CFP10/ESAT6
• 2.2.2.7. Biểu hiện protein ESAT6-CFP10 trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3)
• 2.2.2.8. Tinh sạch protein ESAT6/CFP10
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ESAT6/CFP10
• 3.1.1. Xác định tính ổn định của gen mã hóa protein ESAT6/CFP10
• 3.1.2. Kết quả khuếch đại trình tự gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 của M.
• 3.1.3. Kết quả tách dòng
• 3.1.4. Kết quả khuếch đại, nối 2 gen mã hóa protein ESAT6-CFP10 của M.
• 3.1.5. Kết quả tách dòng
• 3.1.6. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen ESAT6-CFP10
• 3.1.7. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen pET21a+
• 3.1.8. Gắn đoạn gen đích vào vector biểu hiện pET21a+
• 3.1.9. Chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR- colonies
• 3.2. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN ESAT6/CFP10
• 3.2.1. Biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/ESAT6-CFP10 vào E.coli chủng BL21(DE3)
• 3.2.2. Kiểm tra sự biểu hiện gen CFP10/ESAT6
• 3.2.3. Tối ưu điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp CFP10-ESAT6
• 3.2.3.1. Kết quả tối ưu nhiệt độ cảm ứng
• 3.2.3.2. Kết quả tối ưu nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng trên gen CFP10/ESAT6
• 3.2.4. Tinh sạch protein ESAT6/CFP10
• 3.2.5. Kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm
• 3.2.6. Kết quả kiểm tra protein tái tổ hợp bằng kháng thể đặc hiệu
• 3.2.7. Xác định hoạt tính kháng nguyên
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu quy trình biểu hiện gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6 CFP10

Nghiên cứu quy trình biểu hiện gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 là một bước tiến quan trọng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhiễm lao. Việc hiểu rõ về quy trình này không chỉ giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm sinh học mới. Kháng nguyên ESAT6 và CFP10 được mã hóa bởi gen nằm trong vùng RD1 của vi khuẩn lao, có vai trò quan trọng trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Nghiên cứu này không chỉ tập trung vào việc biểu hiện gen mà còn vào việc tối ưu hóa quy trình để đạt được sản phẩm protein có chất lượng cao.

1.1. Khái niệm về gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6 CFP10

Gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 là một phần quan trọng trong nghiên cứu chẩn đoán nhiễm lao. Hai kháng nguyên này được mã hóa bởi gen nằm trong vùng RD1 của Mycobacterium tuberculosis, có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch tế bào. Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp biểu hiện gen này sẽ giúp tạo ra các sản phẩm sinh học có giá trị trong chẩn đoán và điều trị bệnh lao.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu quy trình biểu hiện gen

Nghiên cứu quy trình biểu hiện gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao. Việc phát hiện sớm và chính xác bệnh lao sẽ giúp giảm thiểu tỷ lệ lây nhiễm trong cộng đồng. Hơn nữa, nghiên cứu này còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển vaccine phòng ngừa bệnh lao.

II. Thách thức trong việc chẩn đoán nhiễm lao hiện nay

Chẩn đoán nhiễm lao hiện nay gặp nhiều thách thức, đặc biệt là trong việc phát hiện các trường hợp nhiễm lao tiềm ẩn. Phương pháp truyền thống như TST có độ nhạy và độ đặc hiệu thấp, đặc biệt là ở những người đã tiêm vaccine BCG. Điều này dẫn đến việc nhiều bệnh nhân không được phát hiện kịp thời, tạo ra nguồn lây nhiễm trong cộng đồng. Hơn nữa, sự xuất hiện của các chủng lao kháng thuốc cũng làm cho việc chẩn đoán và điều trị trở nên khó khăn hơn.

2.1. Hạn chế của phương pháp chẩn đoán truyền thống

Phương pháp chẩn đoán truyền thống như TST có nhiều hạn chế, bao gồm độ nhạy thấp và không phân biệt được giữa nhiễm lao và phản ứng với vaccine BCG. Điều này dẫn đến việc nhiều trường hợp nhiễm lao không được phát hiện, gây khó khăn trong việc kiểm soát dịch bệnh.

2.2. Tác động của lao kháng thuốc đến chẩn đoán

Sự xuất hiện của các chủng lao kháng thuốc đã làm gia tăng độ phức tạp trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh lao. Các chủng này không chỉ gây khó khăn trong việc điều trị mà còn làm tăng nguy cơ lây nhiễm trong cộng đồng, đòi hỏi cần có các phương pháp chẩn đoán mới và hiệu quả hơn.

III. Phương pháp nghiên cứu quy trình biểu hiện gen kháng nguyên

Phương pháp nghiên cứu quy trình biểu hiện gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 bao gồm nhiều bước quan trọng, từ thiết kế vector đến biểu hiện và tinh sạch protein. Việc tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện là rất cần thiết để đạt được sản phẩm protein có chất lượng cao. Các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, tách dòng gen và tinh sạch protein sẽ được áp dụng trong nghiên cứu này.

3.1. Thiết kế vector biểu hiện gen

Thiết kế vector biểu hiện gen là bước đầu tiên trong quy trình nghiên cứu. Vector pET21a được sử dụng để biểu hiện gen mã hóa protein ESAT6/CFP10. Việc lựa chọn vector phù hợp sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả biểu hiện và thu nhận protein.

3.2. Kỹ thuật tinh sạch protein

Sau khi biểu hiện, protein ESAT6/CFP10 cần được tinh sạch để đảm bảo chất lượng cho các ứng dụng chẩn đoán. Các phương pháp như sắc ký lỏng và điện di sẽ được áp dụng để đạt được độ tinh khiết cao cho sản phẩm protein.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu trong chẩn đoán nhiễm lao

Nghiên cứu quy trình biểu hiện gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 không chỉ có giá trị trong lý thuyết mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong chẩn đoán nhiễm lao. Các sản phẩm sinh học được tạo ra từ nghiên cứu này có thể được sử dụng để phát triển các bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh và chính xác hơn, từ đó nâng cao hiệu quả trong việc phát hiện và điều trị bệnh lao.

4.1. Phát triển bộ sinh phẩm chẩn đoán

Các sản phẩm protein ESAT6/CFP10 có thể được sử dụng để phát triển bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao. Bộ sinh phẩm này sẽ giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác các trường hợp nhiễm lao, từ đó giảm thiểu tỷ lệ lây nhiễm trong cộng đồng.

4.2. Tăng cường hiệu quả điều trị bệnh lao

Việc phát hiện sớm và chính xác bệnh lao sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị. Các sản phẩm sinh học từ nghiên cứu này có thể hỗ trợ trong việc theo dõi và đánh giá hiệu quả điều trị, từ đó cải thiện kết quả cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu quy trình biểu hiện gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 mở ra nhiều triển vọng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhiễm lao hiệu quả hơn. Việc ứng dụng các công nghệ sinh học hiện đại sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán và điều trị bệnh lao. Tương lai của nghiên cứu này không chỉ dừng lại ở việc phát triển bộ sinh phẩm mà còn có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát triển vaccine phòng ngừa bệnh lao.

5.1. Triển vọng phát triển vaccine từ nghiên cứu

Nghiên cứu về gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 có thể dẫn đến việc phát triển vaccine phòng ngừa bệnh lao hiệu quả. Việc ứng dụng các công nghệ sinh học hiện đại sẽ giúp tạo ra các sản phẩm có khả năng bảo vệ cao cho cộng đồng.

5.2. Hướng đi mới trong nghiên cứu bệnh lao

Nghiên cứu này không chỉ góp phần vào việc phát triển các phương pháp chẩn đoán mà còn mở ra hướng đi mới trong việc nghiên cứu và điều trị bệnh lao. Các sản phẩm sinh học từ nghiên cứu có thể được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ y học đến công nghệ sinh học.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh lao là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong số các bệnh truyền nhiễm trên thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, hiện có khoảng một phần ba dân số toàn cầu (tương đương 2,2 tỷ người) bị nhiễm vi khuẩn lao tiềm ẩn. Mỗi năm toàn cầu ghi nhận thêm khoảng 9 triệu ca mắc mới và gần 1,4 triệu ca tử vong. Tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện ca bệnh ước tính chỉ đạt 37%, đồng nghĩa với việc còn khoảng 63% người mắc lao chưa được phát hiện và điều trị kịp thời, trở thành nguồn lây nhiễm dai dẳng trong cộng đồng.

Việt Nam là quốc gia có gánh nặng bệnh lao cao, đứng thứ 12 trong 22 quốc gia có tỷ lệ dịch tễ lao cao nhất toàn cầu và đứng thứ 14 trong 27 nước có tỷ lệ lao kháng đa thuốc cao nhất thế giới. Năm 2012, toàn quốc ghi nhận khoảng 161.000 ca mắc lao, trong đó Chương trình Chống lao Quốc gia phát hiện khoảng 100.000 bệnh nhân. Tình trạng vi khuẩn kháng thuốc chiếm 32,5% ở các ca mắc mới, trong đó tỷ lệ kháng streptomycin là 25,1% và isoniazid là 20,0%.

Thách thức lớn nhất trong kiểm soát bệnh lao hiện nay là phương pháp chẩn đoán truyền thống Tuberculin Skin Test (phản ứng Mantoux) có độ đặc hiệu thấp do phản ứng chéo với vắc xin BCG và các chủng vi khuẩn lao không điển hình. Để giải quyết hạn chế này, luận văn thạc sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học thực hiện đề tài nghiên cứu quy trình biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 phục vụ chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao. Nghiên cứu được triển khai tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội vào năm 2014, trực thuộc nhiệm vụ Nghị định thư hợp tác quốc tế nhằm phát triển sinh phẩm ELISPOT chẩn đoán lao quy mô phòng thí nghiệm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên cơ sở di truyền học phân tử và miễn dịch học tế bào của trực khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis. Trọng tâm lý thuyết xoay quanh vùng gen biệt hóa RD1 (Region of Deletion 1) có chiều dài 9.454 cặp base chứa 9 khung đọc mở. Vùng gen này hiện diện ở tất cả các chủng vi khuẩn lao gây bệnh nhưng bị khuyết thiếu hoàn toàn ở chủng vắc xin BCG và hầu hết các chủng Mycobacteria hoang dại trong môi trường.

Vùng RD1 mã hóa cho hai kháng nguyên đặc hiệu có tính sinh miễn dịch rất mạnh là ESAT6 (Early Secretory Antigenic Target 6 kDa, gồm 95 axit amin) và CFP10 (Culture Filtrate Protein 10 kDa, gồm 100 axit amin). Trong chu trình xâm nhiễm tự nhiên, hai protein này được phiên mã và đồng biểu hiện thành phức hệ dị nhị phân ESAT6/CFP10 theo tỷ lệ 1:1, tiết ra ngoài tế bào ngay ở giai đoạn đầu của quá trình nhiễm trùng. Phức hệ này kích hoạt mạnh mẽ tế bào lympho T tiết ra Interferon-gamma (IFN-γ).

Nghiên cứu ứng dụng mô hình công nghệ DNA tái tổ hợp trên hệ thống vector biểu hiện pET (pET system) kiểm soát bởi promoter T7 mạnh, kết hợp đuôi ái lực polyhistidine (6xHis-tag) để sản xuất kháng nguyên dung hợp tan trong tế bào chủ vi khuẩn Escherichia coli.

Phương pháp nghiên cứu

Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm 54 chủng vi khuẩn lao lâm sàng phân lập từ đờm của các bệnh nhân lao phổi có kết quả soi kính hiển vi dương tính AFB(+) tại Bệnh viện Lao Hà Nội (đại diện miền Bắc) và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch (đại diện miền Nam), cùng chủng chuẩn quốc tế Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích tại hai trung tâm điều trị lao lớn nhất hai miền giúp đánh giá toàn diện tính ổn định di truyền của gen mục tiêu trên quần thể vi khuẩn lưu hành tại Việt Nam.

Quy trình phân tích gồm các kỹ thuật sinh học phân tử chuẩn hóa:

• Tách chiết ADN bộ gen vi khuẩn bằng bộ sinh phẩm silica-membrane chuyên dụng.
• Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR khuếch đại gen CFP10 (352 bp với cặp mồi P1-P2) và gen ESAT6 (338 bp với cặp mồi P3-P4), sau đó nối hai đoạn gen qua kỹ thuật overlap PCR tạo phân đoạn dung hợp 645 bp bằng cặp mồi P1-P4.
• Tách dòng phân đoạn gen vào vector pGEM-T, biến nạp vào tế bào E. coli DH5α và giải trình tự nucleotide theo phương pháp Sanger trên hệ thống ABI Prism 3100 Avant. Lý do lựa chọn phương pháp này nhằm khẳng định tính bảo tồn tuyệt đối của trình tự gen trước khi biểu hiện.
• Thiết kế vector biểu hiện pET21a+ (kích thước 5.443 bp) mở vòng bằng hai enzyme cắt giới hạn BamHI và HindIII, nối định hướng gen đích bằng T4 DNA Ligase.
• Biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli BL21(DE3) dưới cảm ứng chất kích hoạt IPTG nồng độ 1 mM ở 37 độ C trong 3 đến 5 giờ.
• Tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực kim loại cố định (IMAC) qua cột niken ProBond Nickel-Chelating Resin, loại bỏ nội độc tố vi khuẩn (endotoxin) và thẩm tích qua đêm trong đệm PBS 1X.
• Định lượng protein bằng phương pháp Bradford, kiểm tra độ tinh sạch qua điện di SDS-PAGE 12% và xác định hoạt tính miễn dịch bằng Western blot với kháng thể đơn dòng đặc hiệu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận bốn kết quả then chốt mang tính thực tiễn cao:

Thứ nhất, tính ổn định di truyền của gen mã hóa ESAT6 và CFP10 trên 54 chủng vi khuẩn lao lâm sàng tại Việt Nam đạt mức độ bảo tồn rất cao so với chủng chuẩn H37Rv (mã số ngân hàng gen BX842575). Cụ thể, đối với gen ESAT6, có 43 trên 54 chủng (chiếm 79,6%) đạt độ tương đồng 100% và 11 trên 54 chủng (chiếm 20,4%) đạt độ tương đồng 99%. Đối với gen CFP10, có 27 chủng (chiếm 50,0%) đạt độ tương đồng 100% và 27 chủng (chiếm 50,0%) đạt độ tương đồng 99%.

Thứ hai, nghiên cứu đã khuếch đại và ghép nối thành công hai đoạn gen CFP10 (352 bp) và ESAT6 (338 bp) thành một phân đoạn gen dung hợp duy nhất có kích thước 645 bp thông qua cầu nối oligonucleotide linh hoạt.

Thứ ba, thiết kế thành công cấu trúc vector biểu hiện tái tổ hợp pET21a+/CFP10-ESAT6. Kết quả giải trình tự khẳng định khung đọc mở liên tục dài 711 nucleotide mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 237 axit amin, có đầy đủ bộ ba mở đầu, trình tự liên kết ribosome và 6 gốc histidine ở đầu C mà không xuất hiện đột biến dịch khung hay mã kết thúc sớm.

Thứ tư, biểu hiện thành công protein tái tổ hợp ESAT6/CFP10 ở dạng hòa tan trong sinh khối tế bào E. coli BL21(DE3). Sau quá trình tinh sạch trên cột niken và thẩm tích, sản phẩm protein dung hợp thu được biểu hiện thành một băng đồng nhất trên gel điện di SDS-PAGE và phản ứng đặc hiệu mạnh mẽ với kháng thể đơn dòng kháng ESAT6 trong thử nghiệm Western blot.

Thảo luận kết quả

Mức độ tương đồng nucleotide trên 99% của gen ESAT6 và CFP10 giữa các chủng thực địa tại hai miền Nam - Bắc hoàn toàn trùng khớp với các công bố quốc tế của các nhóm nghiên cứu dịch tễ học phân tử trên thế giới khi phân tích 24 kháng nguyên của 16 chủng lao lâm sàng. Sự bảo tồn tuyệt đối này chứng minh kháng nguyên ESAT6/CFP10 là đích nhắm lý tưởng, không bị biến đổi bởi áp lực chọn lọc địa lý hay đột biến kháng thuốc.

Dữ liệu nghiên cứu về sự phụ thuộc của hiệu suất biểu hiện protein theo nhiệt độ (25 độ C, 30 độ C, 37 độ C) và nồng độ chất cảm ứng IPTG (0,5 mM đến 1,0 mM) cùng thời gian thu hoạch (từ 1 đến 5 giờ) có thể được trình bày một cách trực quan qua biểu đồ đường biểu diễn động học sinh trưởng và bảng ma trận mật độ quang học OD600. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu ở 37 độ C với 1 mM IPTG trong 5 giờ mang lại hiệu suất thu nhận protein hòa tan cao nhất.

So với các bộ kit thương mại nhập ngoại đắt tiền sử dụng peptide tổng hợp gối đầu (overlapping peptides) có giá thành lên tới hàng triệu đồng mỗi xét nghiệm, việc sản xuất kháng nguyên dung hợp tái tổ hợp hoàn chỉnh bằng hệ thống E. coli giúp giảm giá thành nguyên liệu thô ước tính hơn 70%, mở ra triển vọng nội địa hóa sinh phẩm chẩn đoán lao cho các nước đang phát triển.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đưa ra bốn khuyến nghị hành động cụ thể nhằm hoàn thiện công nghệ sản xuất:

Một là, nâng cấp quy trình nuôi cấy vi khuẩn lên men quy mô bình sinh học (bioreactor) dung tích từ 5 đến 10 lít, mục tiêu nâng sản lượng protein tái tổ hợp đạt trên 50 mg/lít dịch nuôi cấy trong thời gian 12 tháng do nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học thực hiện.

Hai là, chuẩn hóa quy trình tinh chế loại bỏ triệt để nội độc tố vi khuẩn (lipopolysaccharide), đảm bảo nồng độ endotoxin tồn dư đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học dưới 0,1 EU/μg protein theo tiêu chuẩn Dược điển, hoàn thành trong vòng 6 tháng do nhóm kiểm định chất lượng đảm trách.

Ba là, triển khai thử nghiệm đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu lâm sàng của kháng nguyên tái tổ hợp trên cỡ mẫu tối thiểu 200 mẫu máu bệnh nhân lao hoạt tính và 100 mẫu đối chứng khỏe mạnh tại Bệnh viện Phổi Trung ương trong khung thời gian 18 tháng do nhóm nghiên cứu lâm sàng chủ trì.

Bốn là, hoàn thiện hồ sơ đăng ký quyền sở hữu trí tuệ và chuyển giao quy trình công nghệ cho các công ty sản xuất sinh phẩm y tế trong nước trước năm 2026 dưới sự điều phối của Bộ Khoa học và Công nghệ và Bộ Y tế.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu luận văn mang lại giá trị thực tiễn và học thuật cho bốn nhóm độc giả chuyên sâu:

Nhóm thứ nhất là học viên cao học, nghiên cứu sinh chuyên ngành Vi sinh vật học, Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học: Luận văn là tài liệu hướng dẫn chuẩn mực về các kỹ thuật thao tác gen, thiết kế mồi PCR nối phân đoạn, tạo dòng pGEM-T và biểu hiện protein dung hợp trên vector pET21a+.

Nhóm thứ hai là các nhà khoa học, kỹ thuật viên tại các viện nghiên cứu dịch tễ và trung tâm sản xuất sinh phẩm y tế: Tài liệu cung cấp thông số thực nghiệm chi tiết để thiết lập quy trình sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp phục vụ phát triển các bộ kit chẩn đoán IGRA hoặc ELISA tại phòng xét nghiệm.

Nhóm thứ ba là các bác sĩ chuyên khoa truyền nhiễm, lao và bệnh phổi: Luận văn cung cấp nền tảng miễn dịch học chuyên sâu về sự khác biệt giữa kháng nguyên vùng RD1 và tuberculin PPD, giúp nâng cao nhận thức trong chẩn đoán phân biệt nhiễm lao và phản ứng sau tiêm chủng BCG.

Nhóm thứ tư là các nhà hoạch định chính sách y tế và quản lý chương trình chống lao quốc gia: Cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu kỹ thuật để định hướng chiến lược tự chủ nguồn sinh phẩm chẩn đoán trong nước, tối ưu hóa ngân sách y tế cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

Kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 có ưu điểm gì vượt trội so với phản ứng Mantoux truyền thống? Kháng nguyên ESAT6/CFP10 được mã hóa bởi vùng gen RD1 chỉ hiện diện ở vi khuẩn lao gây bệnh, không có trong chủng vắc xin BCG và vi khuẩn lao môi trường. Nhờ đó, xét nghiệm sử dụng kháng nguyên này đạt độ đặc hiệu trên 95%, loại bỏ hoàn toàn hiện tượng dương tính giả ở người đã tiêm vắc xin BCG vốn rất phổ biến ở Việt Nam.

Mức độ biến dị di truyền của gen ESAT6 và CFP10 trên các chủng lao tại Việt Nam như thế nào? Kết quả giải trình tự trên 54 chủng vi khuẩn lao lâm sàng tại Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh cho thấy gen ESAT6 đạt độ tương đồng 100% ở 79,6% số chủng, gen CFP10 đạt tương đồng 100% ở 50,0% số chủng và các chủng còn lại đều đạt 99%, khẳng định tính bảo tồn rất cao của kháng nguyên thực địa.

Tại sao vector pET21a+ lại được lựa chọn để biểu hiện phức hệ protein này? Vector pET21a+ sở hữu promoter T7 cực mạnh giúp tối đa hóa mức độ phiên mã trong tế bào chủ E. coli BL21(DE3). Ngoài ra, vector tích hợp sẵn trình tự mã hóa 6 gốc histidine ở đầu C, tạo điều kiện tinh sạch protein dung hợp nhanh chóng và đạt độ tinh khiết cao qua sắc ký ái lực cột niken.

Thách thức lớn nhất khi sản xuất kháng nguyên trong vi khuẩn E. coli là gì và giải quyết ra sao? Thách thức chính là sự nhiễm nội độc tố endotoxin (LPS) từ màng ngoài tế bào E. coli, có thể gây kích thích miễn dịch không đặc hiệu. Nghiên cứu giải quyết vấn đề này bằng cách tích hợp quy trình rửa cột chuyên biệt và xử lý qua cột lọc loại bỏ endotoxin chuyên dụng, đưa nồng độ độc tố về ngưỡng cho phép.

Kháng nguyên tái tổ hợp này được ứng dụng cụ thể trong loại sinh phẩm chẩn đoán nào? Kháng nguyên ESAT6/CFP10 tái tổ hợp được ứng dụng làm chất kích thích miễn dịch đặc hiệu trong bộ sinh phẩm chẩn đoán ELISPOT và xét nghiệm giải phóng Interferon-gamma (IGRA), giúp phát hiện chính xác tình trạng nhiễm lao hoạt tính và lao tiềm ẩn từ mẫu máu ngoại vi.

Kết luận

• Luận văn đã xác định tính ổn định di truyền cao của gen ESAT6 và CFP10 với độ tương đồng từ 99% đến 100% trên 54 chủng vi khuẩn lao lâm sàng tại Việt Nam.
• Thiết kế và tạo dòng thành công phân đoạn gen dung hợp CFP10-ESAT6 kích thước 645 bp vào vector biểu hiện chuẩn pET21a+.
• Xác định khung đọc mở chính xác gồm 711 nucleotide mã hóa cho protein tái tổ hợp hoàn chỉnh chứa 237 axit amin.
• Thiết lập quy trình biểu hiện tối ưu trong tế bào E. coli BL21(DE3) dưới cảm ứng 1 mM IPTG và tinh sạch thành công protein hòa tan qua cột sắc ký niken.
• Khẳng định hoạt tính kháng nguyên đặc hiệu của sản phẩm qua phản ứng Western blot với kháng thể đơn dòng.

Công trình đóng góp một quy trình công nghệ hoàn chỉnh, tạo tiền đề vững chắc cho việc tự chủ sản xuất nguyên liệu kháng nguyên chẩn đoán lao chất lượng cao tại Việt Nam. Trong giai đoạn 24 tháng tới, quy trình cần tiếp tục được thử nghiệm đánh giá lâm sàng mở rộng và tối ưu hóa ở quy mô công nghiệp. Các viện nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp dược phẩm sinh học hãy cùng hợp tác khai thác kết quả này để sớm đưa bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao Make in Vietnam vào phục vụ cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN 1. KHÁI QUÁT VỀ BỆNH LAO Bệnh lao là căn bệnh truyền nhiễm xuất hiện lâu đời, đã được hiện diện trong con người từ thời cổ đại. Các nghiên cứu dấu tích hoá thạch đã cho thấy bệnh lao xuất hiện trên quần thể người khoảng 400- 230 năm trước Công nguyên. Các dấu hiệu của bệnh cũng đã được tìm thấy trong xác ướp Ai Cập giữa năm 3000 và 2400 trước Công Nguyên.

Bệnh ho lao (còn được gọi là consumption) là một thuật ngữ tiếng Hy Lạp. Khoảng 400 năm trước Công nguyên, Hippocrate đã xác định bệnh ho lao là căn nguyên phổ biến nhất liên quan đến ho ra máu và sốt, hầu như luôn gây tử vong. Đại dịch lao bùng phát ở châu Âu (mà sau này được gọi là “Great White Plague”) bắt đầu vào thế kỷ XVII lan sang châu Mỹ và kéo dài cho đến tận thế kỷ XIX. Tác nhân gây bệnh lao, Mycobacterium tuberculosis, chính thức được xác định và mô tả vào năm 1882.

Đây là công trình nghiên cứu của Robert Koch (1843- 1910) [3, 72]. Để ghi nhận công lao của ông, ngày nay người ta còn gọi trực khuẩn lao gây bệnh trên người là trực khuẩn Koch (Bacille de Koch) [57]. Việc áp dụng các thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh đã cứu chữa cho hàng triệu bệnh nhân lao khỏi căn bệnh nguy hiểm này. Tuy nhiên điều đó cũng đã tạo ra một áp lực chọn lọc cho sự hình thành và phát triển các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc.

Hy vọng rằng bệnh này có thể được loại bỏ đã hoàn toàn bị dập tắt kể từ khi xuất hiện các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc vào những năm 1980 [69]. Bên cạnh đó, cùng với sự phát triển của đại dịch HIV/AIDS, dịch tễ lao toàn cầu đã bước sang một hướng phát triển mới gây ra những thách thức vô cùng to lớn cho cuộc chiến chống lao của loài người, đó là sự tương tác giữa lao và đại dịch HIV/AIDS và sự phát triển của các chủng lao kháng thuốc [57, 61]. TÌNH HÌNH BỆNH LAO TRÊN THẾ GIỚI Bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay. Trên thế giới chưa bao giờ và không có một quốc gia, một khu vực, một dân tộc nào 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] không có người mắc bệnh lao và chết do lao.

Năm 1993, WHO đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó trong tương lai là bệnh lao kháng thuốc [6]. Các kết quả thống kê lặp lại nhiều lần đã ước tính có khoảng 1/3 dânk. số thế giới (khoảng 2,2 tỷ người) bị lây nhiễm tiên phát với M.tuberculosis và 10% trong số đó sẽ ph át triển thành bệnh tại một thời điểm nào đó trong đời. Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao thuộc về các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động, do đó bệnh lao là nguyên nhân chủ yếu làm nghèo đói dai dẳng và là trở ngại đối với sự phát triển kinh tế xã hội [70].

Năm 2007, WHO ước tính rằng khu vực Đông Nam Á có số người nhiễm lao chiếm tới 34% trên toàn thế giới. Số lượng các ca mới nhiễm trên toàn cầu vẫn tăng lên và tập trung ở châu Phi, Đông Địa Trung Hải và Đông Nam Á. Trong năm 2010, có khoảng 10 triệu trẻ em mồ côi do cha mẹ tử vong vì lao, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao [70]. Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 82%, nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính.

Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo ước tính của WHO mỗi năm có thêm khoảng 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người). Ngày nay bệnh lao càng trở nên nghiêm trọng hơn do xuất hiện các chủng lao đa kháng thuốc (MDR), lao kháng thuốc tuyệt đối (XDR) và lao đồng nhiễm HIV/AIDS [61, 69]. Đến cuối thế kỷ 20, con người vẫn lạc quan về khả năng có thể kiểm soát được đại dịch này. Thực tế, cuối thập niên 70 đầu thập niên 80 ở một số nước phát triển người ta đã tưởng như chế ngự được hoàn toàn bệnh lao, do đó bệnh lao đã đi vào quá khứ bởi sự lãng quên của các nhà y học và khoa học.

Tuy nhiên, thực tế lại không như vậy bởi sự xuất hiện cơ chế kháng lại thuốc kháng sinh của vi khuẩn lao, khiến cho việc phát hiện và điều trị ngày càng trở nên khó khăn và tốn kém [61]. Theo số liệu công bố của WHO [70], ước tính trong năm 2010 có thêm khoảng 8,8 triệu người mắc lao mới (trung bình 128 trường hợp trên 100 000 dân) và 1,4 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] triệu người chết do lao (trong đó 1,1 triệu người HIV (-) và 0,35 triệu người tử vong do lao/HIV (+)). Sau HIV/AIDS, vi khuẩn lao là căn nguyên thường gặp nhất gây tử vong do các bệnh truyền nhiễm; và khuynh hướng hiện tại cho thấy, vi khuẩn lao vẫn là một trong 10 nguyên nhân gây gánh nặng bệnh tật toàn cầu đến năm 2020 [70]. Tổ chức Y tế thế giới WHO đang phấn đấu đến năm 2015 sẽ giảm 1 nửa số người nhiễm và tử vong do lao [67,68].

Ngày Thế giới phòng chống lao (24/3) được tổ chức hàng năm nhằm nâng cao nhận thức về dịch bệnh lao toàn cầu và nỗ lực loại trừ bệnh lao. Bệnh lao vẫn tiếp tục là một trong ba căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới cùng với hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) và sốt rét [6, 52]. Điều này đã một lần nữa khơi dậy các nghiên cứu sâu hơn trong phương pháp phát hiện (chẩn đoán) và điều trị bệnh lao. TÌNH HÌNH BỆNH LAO TẠI VIỆT NAM Việt Nam hiện vẫn là nước có gánh nặng bệnh lao cao, đứng thứ 12 trong 22 nước có tình hình dịch tễ lao cao nhất trên toàn cầu, đồng thời đứng thứ 14 trong số 27 nước có gánh nặng bệnh lao kháng đa thuốc cao nhất thế giới [68].

Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt Nam đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một trong những Chương trình Y tế Quốc gia trọng điểm [6]. Năm 1996, Việt Nam đã đạt mục tiêu toàn cầu về tìm và điều trị bệnh lao, nhưng số ca bệnh báo cáo không thuyên giảm. Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục tiêu của TCYTTG là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi AFB (+) với tỷ lệ khỏi là 92% [6, 15]. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Năm 2002, khu vực Tây-Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới.

Trong đó, số bệnh nhân do CTCLQG Việt Nam phát hiện chiếm 12% bệnh nhân các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi AFB(+) mới [6].000 ca mắc lao mới được phát hiện, trên 8.000 bệnh nhân lao cũ cần tái điều trị và gần 30.000 người chết vì bệnh lao. Tổng số bệnh nhân lao hiện mắc là 300. Năm 2012, tổng số người mắc lao là 161.000, trong đó số người mắc lao mới khoảng 149.000, số người mắc lao thứ phát là 12. Mỗi năm, Chương trình chống lao quốc gia phát hiện 100.000 bệnh nhân lao và chữa khỏi cho 92% [4].

Bên cạnh sự gia tăng đáng lo ngại thì tình trạng lao kháng thuốc là một vấn đề cấp bách. Theo nghiên cứu của CTCLQG có 32,5% các trường hợp bệnh lao mới có mang vi trùng lao kháng thuốc, trong đó có kháng SM 25,1%, tiếp theo là INH 20.0%, đây là hai loại thuốc phổ biến trong điều trị bệnh lao [73]. Vấn đề đồng nhiễm HIV và lao không chỉ làm tăng số bệnh nhân lao mà còn làm giảm hiệu quả điều trị bệnh, tăng tỷ lệ tử vong. Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% nhưng trên thực tế có thể còn cao hơn, như vậy các con số nêu trên có thể còn lớn hơn [6].

Việc chẩn đoán nhiễm lao, phát triển một vacxin có hiệu quả bảo vệ cao từ gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 được coi là một hướng đi mới ở nước ta. VI KHUẨN LAO 1. Đặc điểm phân loại Tên khoa học: Mycobacterium tuberculosis [3, 7] Chi(genus): Mycobacterium Họ(familia): Mycobacteriaceae Phân bộ(subordo): Corynebacterineae Bộ(ordo): Actinomycetales Ngành(philum): Actinobacteria Giới(regnum): Bacteria 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Các chủng vi khuẩn thuộc chi Mycobacterium được chia làm 2 nhóm  Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) gồm: M. bovis gây bệnh lao điển hình.

 Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm: M. Nhóm này không gây bệnh lao [57, 60]. Đặc điểm hình thái Trực khuẩn lao có hình que, kích thước 2-3 µm, dầy 0,3 µm, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành hình chữ N, Y, V hoặc thành dãy phân nhánh như cành cây (hình 1. Tuy nhiên tùy thuộc vào điều kiện và thời gian nuôi cấy mà có sự thay đổi về hình dạng, kích thước, từ cầu- trực khuẩn đến trực khuẩn dài [7, 20, 57].

Vi khuẩn không di động, không sinh bào tử, khó bắt màu các thuốc nhuộm thông thường do có lớp sáp ở thành tế bào. Mycobacterium tuberculosis được xếp vào nhóm vi khuẩn Gram dương, tuy nhiên khi nhuộm Gram vi khuẩn bắt màu rất yếu hoặc không giữ được màu thuốc nhuộm [3, 7, 8]. Nhuộm theo phương pháp Ziehl- Neelsen, trực khuẩn lao không bị cồn và axit làm mất màu của cacbonfuchsin, bắt màu đỏ [8, 20], (hình 1. Vi khuẩn lao M.

tuberculosis trên kính hiển vi điện tử [57]. 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. tuberculosis sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen [57]. Cấu trúc thành tế bào Lớp vách của trực khuẩn có vai trò rất quan trọng.

Cấu trúc của lớp này ngoài đảm bảo cho sự tồn tại của trực khuẩn, làm cho trực khuẩn bền vững đối với hiện tượng thực bào, khi xâm nhập vào cơ thể trực khuẩn lao khó bị tiêu diệt, ảnh hưởng rất lớn đến khả năng gây bệnh của trực khuẩn [8]. Mycobacterium tuberculosis có cấu trúc vách tế bào phức tạp, được chia thành 4 lớp (hình 1. 1- Lipid ngoài 2- Axit mycolic 3- Polysaccharides (arabinogalactan) 4- Peptidoglycan 5- Màng sinh chất 6- Lipoarabinomannan (LAM) 7- Phosphatidylinositol mannoside 8- Khung thành tế bào Hình 1. Cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn lao [72].