Nghiên cứu quy trình biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 phục vụ chẩn đoán nhiễm lao

• Tác giả: Hà Thị Hiên
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thái Sơn
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu quy trình biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 phục vụ việc chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. KHÁI QUÁT VỀ BỆNH LAO
• 1.2. VI KHUẨN LAO
• 1.2.1. Đặc điểm phân loại
• 1.2.2. Đặc điểm hình thái
• 1.2.3. Cấu trúc thành tế bào
• 1.2.4. Đặc điểm nuôi cấy
• 1.2.5. Môi trường và dạng khuẩn lạc
• 1.2.6. Chu kì tế bào
• 1.2.7. Khả năng gây bệnh
• 1.2.8. Đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao
• 1.2.9. Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosis
• 1.2.10. Đặc điểm di truyền của vùng gene biệt hóa RD1
• 1.3. PROTEIN ESAT6/CFP10
• 1.3.1. Cấu trúc phân tử của phức hệ protein ESAT6/CFP10
• 1.3.2. Kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6-CFP10 và tiềm năng ứng dụng
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 2.2.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử
• 2.2.2.1. Tách chiết ADN
• 2.2.2.2. PCR khuếch đại gen mã hóa protein ESAT6-CFP10
• 2.2.2.3. Tách dòng gen mã hóa protein ESAT6-CFP10
• 2.2.2.4. Giải trình tự ADN
• 2.2.2.5. Thiết kế vector tách dòng pGEMT chứa đoạn gen mã hóa protein CFP10/ESAT6
• 2.2.2.6. Thiết kế vector biểu hiện pET21a chứa đoạn gen mã hóa protein CFP10/ESAT6
• 2.2.2.7. Biểu hiện protein ESAT6-CFP10 trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3)
• 2.2.2.8. Tinh sạch protein ESAT6/CFP10
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ESAT6/CFP10
• 3.1.1. Xác định tính ổn định của gen mã hóa protein ESAT6/CFP10
• 3.1.2. Kết quả khuếch đại trình tự gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 của M.
• 3.1.3. Kết quả tách dòng
• 3.1.4. Kết quả khuếch đại, nối 2 gen mã hóa protein ESAT6-CFP10 của M.
• 3.1.5. Kết quả tách dòng
• 3.1.6. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen ESAT6-CFP10
• 3.1.7. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen pET21a+
• 3.1.8. Gắn đoạn gen đích vào vector biểu hiện pET21a+
• 3.1.9. Chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR- colonies
• 3.2. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN ESAT6/CFP10
• 3.2.1. Biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/ESAT6-CFP10 vào E.coli chủng BL21(DE3)
• 3.2.2. Kiểm tra sự biểu hiện gen CFP10/ESAT6
• 3.2.3. Tối ưu điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp CFP10-ESAT6
• 3.2.3.1. Kết quả tối ưu nhiệt độ cảm ứng
• 3.2.3.2. Kết quả tối ưu nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng trên gen CFP10/ESAT6
• 3.2.4. Tinh sạch protein ESAT6/CFP10
• 3.2.5. Kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm
• 3.2.6. Kết quả kiểm tra protein tái tổ hợp bằng kháng thể đặc hiệu
• 3.2.7. Xác định hoạt tính kháng nguyên
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về nghiên cứu quy trình biểu hiện gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6 CFP10

Nghiên cứu quy trình biểu hiện gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 là một bước tiến quan trọng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhiễm lao. Việc hiểu rõ về quy trình này không chỉ giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm sinh học mới. Kháng nguyên ESAT6 và CFP10 được mã hóa bởi gen nằm trong vùng RD1 của vi khuẩn lao, có vai trò quan trọng trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Nghiên cứu này không chỉ tập trung vào việc biểu hiện gen mà còn vào việc tối ưu hóa quy trình để đạt được sản phẩm protein có chất lượng cao.

1.1. Khái niệm về gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6 CFP10

Gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 là một phần quan trọng trong nghiên cứu chẩn đoán nhiễm lao. Hai kháng nguyên này được mã hóa bởi gen nằm trong vùng RD1 của Mycobacterium tuberculosis, có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch tế bào. Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp biểu hiện gen này sẽ giúp tạo ra các sản phẩm sinh học có giá trị trong chẩn đoán và điều trị bệnh lao.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu quy trình biểu hiện gen

Nghiên cứu quy trình biểu hiện gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao. Việc phát hiện sớm và chính xác bệnh lao sẽ giúp giảm thiểu tỷ lệ lây nhiễm trong cộng đồng. Hơn nữa, nghiên cứu này còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển vaccine phòng ngừa bệnh lao.

II. Thách thức trong việc chẩn đoán nhiễm lao hiện nay

Chẩn đoán nhiễm lao hiện nay gặp nhiều thách thức, đặc biệt là trong việc phát hiện các trường hợp nhiễm lao tiềm ẩn. Phương pháp truyền thống như TST có độ nhạy và độ đặc hiệu thấp, đặc biệt là ở những người đã tiêm vaccine BCG. Điều này dẫn đến việc nhiều bệnh nhân không được phát hiện kịp thời, tạo ra nguồn lây nhiễm trong cộng đồng. Hơn nữa, sự xuất hiện của các chủng lao kháng thuốc cũng làm cho việc chẩn đoán và điều trị trở nên khó khăn hơn.

2.1. Hạn chế của phương pháp chẩn đoán truyền thống

Phương pháp chẩn đoán truyền thống như TST có nhiều hạn chế, bao gồm độ nhạy thấp và không phân biệt được giữa nhiễm lao và phản ứng với vaccine BCG. Điều này dẫn đến việc nhiều trường hợp nhiễm lao không được phát hiện, gây khó khăn trong việc kiểm soát dịch bệnh.

2.2. Tác động của lao kháng thuốc đến chẩn đoán

Sự xuất hiện của các chủng lao kháng thuốc đã làm gia tăng độ phức tạp trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh lao. Các chủng này không chỉ gây khó khăn trong việc điều trị mà còn làm tăng nguy cơ lây nhiễm trong cộng đồng, đòi hỏi cần có các phương pháp chẩn đoán mới và hiệu quả hơn.

III. Phương pháp nghiên cứu quy trình biểu hiện gen kháng nguyên

Phương pháp nghiên cứu quy trình biểu hiện gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 bao gồm nhiều bước quan trọng, từ thiết kế vector đến biểu hiện và tinh sạch protein. Việc tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện là rất cần thiết để đạt được sản phẩm protein có chất lượng cao. Các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, tách dòng gen và tinh sạch protein sẽ được áp dụng trong nghiên cứu này.

3.1. Thiết kế vector biểu hiện gen

Thiết kế vector biểu hiện gen là bước đầu tiên trong quy trình nghiên cứu. Vector pET21a được sử dụng để biểu hiện gen mã hóa protein ESAT6/CFP10. Việc lựa chọn vector phù hợp sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả biểu hiện và thu nhận protein.

3.2. Kỹ thuật tinh sạch protein

Sau khi biểu hiện, protein ESAT6/CFP10 cần được tinh sạch để đảm bảo chất lượng cho các ứng dụng chẩn đoán. Các phương pháp như sắc ký lỏng và điện di sẽ được áp dụng để đạt được độ tinh khiết cao cho sản phẩm protein.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu trong chẩn đoán nhiễm lao

Nghiên cứu quy trình biểu hiện gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 không chỉ có giá trị trong lý thuyết mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong chẩn đoán nhiễm lao. Các sản phẩm sinh học được tạo ra từ nghiên cứu này có thể được sử dụng để phát triển các bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh và chính xác hơn, từ đó nâng cao hiệu quả trong việc phát hiện và điều trị bệnh lao.

4.1. Phát triển bộ sinh phẩm chẩn đoán

Các sản phẩm protein ESAT6/CFP10 có thể được sử dụng để phát triển bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao. Bộ sinh phẩm này sẽ giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác các trường hợp nhiễm lao, từ đó giảm thiểu tỷ lệ lây nhiễm trong cộng đồng.

4.2. Tăng cường hiệu quả điều trị bệnh lao

Việc phát hiện sớm và chính xác bệnh lao sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị. Các sản phẩm sinh học từ nghiên cứu này có thể hỗ trợ trong việc theo dõi và đánh giá hiệu quả điều trị, từ đó cải thiện kết quả cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu quy trình biểu hiện gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 mở ra nhiều triển vọng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhiễm lao hiệu quả hơn. Việc ứng dụng các công nghệ sinh học hiện đại sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán và điều trị bệnh lao. Tương lai của nghiên cứu này không chỉ dừng lại ở việc phát triển bộ sinh phẩm mà còn có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát triển vaccine phòng ngừa bệnh lao.

5.1. Triển vọng phát triển vaccine từ nghiên cứu

Nghiên cứu về gen kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 có thể dẫn đến việc phát triển vaccine phòng ngừa bệnh lao hiệu quả. Việc ứng dụng các công nghệ sinh học hiện đại sẽ giúp tạo ra các sản phẩm có khả năng bảo vệ cao cho cộng đồng.

5.2. Hướng đi mới trong nghiên cứu bệnh lao

Nghiên cứu này không chỉ góp phần vào việc phát triển các phương pháp chẩn đoán mà còn mở ra hướng đi mới trong việc nghiên cứu và điều trị bệnh lao. Các sản phẩm sinh học từ nghiên cứu có thể được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ y học đến công nghệ sinh học.