Luận án tiến sĩ: Đánh giá đa dạng vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu ứng dụng metagenomics

Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu sử dụng metagenomics. Phân tích chi tiết hệ sinh thái độc lập trong môi trường nhiệt độ cao cực đoan.

• Tác giả: Trần Thanh Thủy
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Kim Thoa
• Trường học: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu đánh giá đa dạng vi sinh vật, sàng lọc, thu nhận và xác định tính chất của cellulase suối nước nóng Bình Châu, Việt Nam bằng kỹ thuật metagenomics
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về cellulase và đa dạng vi sinh vật trong suối nước nóng

Cellulase là một nhóm enzyme thủy phân cellulose, thành phần chính của lignocellulose. Enzyme này đóng vai trò quan trọng trong chu trình carbon tự nhiên. Suối nước nóng là môi trường khắc nghiệt với nhiệt độ cao và pH biến đổi. Những nơi này chứa hệ vi sinh vật đa dạng và độc đáo. Các vi sinh vật ưa nhiệt sản sinh cellulase có tính chất đặc biệt. Chúng có khả năng chịu nhiệt và bền vững trong điều kiện công nghiệp. Nghiên cứu này tập trung vào suối nước nóng Bình Châu, Việt Nam. Mục tiêu là đánh giá đa dạng vi sinh vật và tìm kiếm cellulase mới. Kỹ thuật metagenomics được áp dụng để phân tích mẫu môi trường. Phương pháp này cho phép tiếp cận vi sinh vật chưa nuôi cấy được trong phòng thí nghiệm. Kết quả thu được cung cấp dữ liệu quý giá về enzyme cellulase nhiệt ổn định.

1.1. Đặc điểm hóa sinh và phân loại cellulase

Cellulase bao gồm ba loại enzyme chính: endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Endoglucanase cắt các liên kết β-1,4-glycosidic bên trong chuỗi cellulose. Exoglucanase hoạt động ở đầu mút cellulose, giải phóng cellobiose. β-Glucosidase thủy phân cellobiose thành glucose. Enzyme cellulase từ vi sinh vật ưa nhiệt thường có nhiệt độ hoạt động tối ưu cao. Chúng cũng thể hiện độ ổn định pH rộng, phù hợp với môi trường kiềm. Các ion kim loại như Ca2+, Mg2+ có thể tăng cường hoạt tính enzyme. Nghiên cứu đã xác định nhiều cellulase mới từ metagenome của suối nước nóng.

1.2. Ứng dụng công nghệ sinh học của cellulase ưa nhiệt

Cellulase ưa nhiệt có tiềm năng ứng dụng lớn trong nhiều ngành công nghiệp. Trong sản xuất nhiên liệu sinh học, enzyme này giúp chuyển đổi biomass cellulose thành ethanol. Ngành dệt may sử dụng cellulase để xử lý vải denim và cải thiện chất lượng sợi. Trong công nghiệp giấy và bột giấy, enzyme hỗ trợ tẩy trắng và xử lý bột giấy. Các ứng dụng khác bao gồm thức ăn gia súc, chất tẩy rửa và xử lý chất thải. Cellulase nhiệt ổn định giảm chi phí quy trình do không cần làm mát. Nó cũng tăng hiệu suất trong các phản ứng ở nhiệt độ cao. Nghiên cứu tìm kiếm cellulase mới nhằm đáp ứng nhu cầu công nghiệp ngày càng tăng.

II. Phân tích thách thức trong nghiên cứu cellulase từ môi trường nhiệt độ cao

Nghiên cứu cellulase từ suối nước nóng đối mặt nhiều thách thức. Một vấn đề lớn là phần lớn vi sinh vật trong môi trường chưa được nuôi cấy. Các phương pháp truyền thống chỉ khai thác được một phần nhỏ đa dạng vi sinh vật. Điều này hạn chế khả năng tìm kiếm enzyme mới có tính chất ưu việt. Môi trường nhiệt độ cao cũng gây khó khăn trong bảo quản và vận chuyển mẫu. Hoạt tính cellulase bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như ion kim loại và pH. Ví dụ, ion Cu2+ và Zn2+ thường ức chế hoạt động enzyme. Cần có phương pháp tiếp cận mới để vượt qua các giới hạn này. Kỹ thuật metagenomics hứa hẹn giải quyết các thách thức trên một cách hiệu quả.

2.1. Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính cellulase

Ion kim loại có vai trò kép đối với hoạt tính cellulase. Một số ion như Ca2+, Mn2+ và Mg2+ thường kích hoạt enzyme. Chúng đóng vai trò cofactor, ổn định cấu trúc enzyme hoặc tham gia phản ứng xúc tác. Ngược lại, các ion như Cu2+, Zn2+ và Hg2+ thường ức chế hoạt động. Sự ức chế có thể do tương tác với nhóm chức của amino acid trong site hoạt động. Nghiên cứu trên cellulase từ suối nước nóng cho thấy sự biến đổi này. Bảng tổng hợp từ tài liệu liệt kê ảnh hưởng cụ thể của từng ion. Việc xác định ảnh hưởng ion kim loại giúp tối ưu hóa điều kiện sử dụng enzyme trong công nghiệp.

2.2. Khó khăn trong sàng lọc cellulase từ vi sinh vật chưa nuôi cấy

Đa số vi sinh vật trong môi trường tự nhiên chưa thể nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Phương pháp sàng lọc truyền thống dựa trên nuôi cấy bỏ lỡ nhiều nguồn enzyme tiềm năng. Các gen cellulase từ cộng đồng vi sinh vật phức tạp rất khó tiếp cận. Thư viện metagenome chứa hàng triệu trình tự DNA, gây thách thức trong phân tích. Việc xác định đúng gen cellulase đòi hỏi công cụ sinh học tin học tiên tiến. Biểu hiện gen cellulase từ môi trường lạ trong hệ thống E. coli thường gặp khó khăn. Protein có thể không gập nếp đúng hoặc không hòa tan. Cần chiến lược sàng lọc và biểu hiện tối ưu để thu nhận enzyme hoạt động.

III. Giải pháp metagenomics trong sàng lọc và xác định tính chất cellulase

Kỹ thuật metagenomics cung cấp giải pháp hiệu quả cho nghiên cứu cellulase. Phương pháp này cho phép phân tích trực tiếp DNA từ mẫu môi trường mà không cần nuôi cấy vi sinh vật. Quy trình bao gồm thu thập mẫu, chiết xuất DNA metagenome và giải trình tự. Dữ liệu trình tự được phân tích để tìm kiếm gen cellulase bằng công cụ sinh học tin học. Các gen ứng viên được nhân dòng và biểu hiện trong hệ thống E. coli. Enzyme thu được sau đó được đặc tính hóa về nhiệt độ, pH và ảnh hưởng ion kim loại. Nghiên cứu này áp dụng metagenomics trên mẫu từ suối nước nóng Bình Châu. Kết quả xác định nhiều cellulase mới với tính chất nhiệt ổn định và bền kiềm.

3.1. Kỹ thuật metagenomics đánh giá đa dạng vi sinh vật

Metagenomics đánh giá đa dạng vi sinh vật thông qua phân tích trình tự DNA. Các marker gene như 16S rRNA được sử dụng để xác định thành phần loài. Dữ liệu giải trình tự shotgun cung cấp thông tin về chức năng gen. Phương pháp này tiết lộ sự phong phú và phân bố của gen cellulase trong cộng đồng. Công cụ như MG-RAST, QIIME được dùng để xử lý và phân tích dữ liệu. Kết quả cho thấy vi sinh vật nhiệt độ cao có đa dạng chức năng cao. Nhiều gen cellulase chưa được biết đến trước đây được phát hiện. Metagenomics mở ra cơ hội khai thác nguồn tài nguyên sinh học quý giá từ môi trường.

3.2. Phương pháp biểu hiện gen và đặc tính hóa cellulase

Biểu hiện gen cellulase thường sử dụng hệ thống E. coli với vector pET. Gen mục tiêu được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi chuyên biệt. Fragment DNA được đưa vào vector và biến đổi vào tế bào chủ. Điều kiện biểu hiện được tối ưu hóa để protein hòa tan và hoạt động. Cellulase thu được được tinh sạch bằng sắc ký ái lực. Đặc tính hóa bao gồm đo hoạt động enzyme ở các nhiệt độ và pH khác nhau. Ảnh hưởng của ion kim loại cũng được khảo sát. Nghiên cứu xác định cellulase mới có nhiệt độ tối ưu cao và bền kiềm. Các enzyme này có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp xử lý biomass.

IV. Kết luận và ứng dụng tiềm năng của cellulase từ suối nước nóng

Nghiên cứu đã thành công đánh giá đa dạng vi sinh vật trong suối nước nóng Bình Châu. Kỹ thuật metagenomics xác định nhiều gen cellulase mới từ cộng đồng vi sinh vật. Hai gen cellulase được biểu hiện và đặc tính hóa chi tiết. Enzyme thể hiện tính chất nhiệt ổn định và bền kiềm, phù hợp ứng dụng công nghiệp. Kết quả đóng góp vào hiểu biết về hệ vi sinh vật môi trường nhiệt độ cao. Nghiên cứu cung cấp nguồn enzyme mới cho các quy trình sinh học. Ứng dụng tiềm năng bao gồm sản xuất nhiên liệu sinh học, xử lý chất thải và công nghiệp dệt. Công trình mở ra hướng nghiên cứu tiếp theo về enzyme từ môi trường cực đoan.

4.1. Kết quả chính của nghiên cứu cellulase từ metagenome

Nghiên cứu thu được nhiều gen cellulase từ metagenome suối nước nóng. Hai gen cellulase mới được chọn biểu hiện thành công trong E. coli. Enzyme đầu tiên là endoglucanase với nhiệt độ hoạt động tối ưu 70°C. Enzyme thứ hai là β-glucosidase bền vững ở pH kiềm. Cả hai enzyme đều chịu được nhiệt độ cao và duy trì hoạt tính. Đặc tính này phù hợp với quy trình công nghiệp đòi hỏi điều kiện khắc nghiệt. Kết quả xác nhận hiệu quả của metagenomics trong khai thác enzyme mới. Nghiên cứu cũng bổ sung dữ liệu về đa dạng chức năng vi sinh vật nhiệt độ cao.

4.2. Ứng dụng trong công nghiệp và bảo vệ môi trường

Cellulase nhiệt ổn định có nhiều ứng dụng công nghiệp quan trọng. Trong sản xuất ethanol cellulose, enzyme giúp chuyển đổi biomass phế thải thành nhiên liệu. Công nghiệp giấy sử dụng cellulase để tẩy trắng và cải thiện chất lượng bột giấy. Ứng dụng trong xử lý chất thải cellulose giúp giảm ô nhiễm môi trường. Enzyme cũng được dùng trong sản xuất thức ăn gia súc và chất tẩy rửa. Tính chất bền kiềm mở rộng phạm vi ứng dụng trong điều kiện pH cao. Việc khai thác enzyme từ nguồn bản địa Việt Nam có ý nghĩa kinh tế và khoa học. Nghiên cứu góp phần phát triển công nghệ sinh học bền vững tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khu hệ vi sinh vật trong suối nước nóng Suối nước nóng đã được nghiên cứu từ thế kỷ XIX. Các nghiên cứu đầu tiên về suối nước nóng chỉ tập trung vào nghiên cứu tính chất hóa lý và đặc điểm địa chất, còn nghiên cứu về vi sinh vật sống trong hệ sinh thái này chỉ mới bắt đầu vào giữa thế kỷ XX (Marsh và Larsen, 1953). Nhiệt độ trong suối nước nóng thường vượt quá giới hạn phát triển của sinh vật nhân thật.

Do đó, vi sinh vật trong hệ sinh thái này chủ yếu là nhóm vi khuẩn, cổ khuẩn và virus (López-López và cs. Vi sinh vật sống ở nhiệt độ cao được phân vào hai nhóm chính là vi sinh vật ưa nhiệt - thermophiles (nhiệt độ sinh trưởng tối ưu > 50ºC) và vi sinh vật siêu ưa nhiệt - hyperthermophiles (nhiệt độ sinh trưởng tối ưu > 80ºC). Các vi sinh vật này đóng vai trò trung tâm trong chu trình phân hủy các hợp chất hữu cơ và chu trình hóa sinh địa (Merino và cs. Vi sinh vật trong suối nước nóng thường không đa dạng và phong phú bằng các môi trường thủy vực khác.

Để nghiên cứu khu hệ vi sinh vật trong suối nước nóng, các nhà khoa học có thể tiếp cận bằng phương pháp nuôi cấy và/ hoặc không thông qua nuôi cấy. Sử dụng phương pháp nuôi cấy, nhiều loài vi khuẩn và cổ khuẩn đã được phân lập từ các suối nước nóng khác nhau trên thế giới. Từ các suối nước nóng nằm trong công viên quốc gia Yellowstone (Mỹ), các nhà khoa học đã phân lập được nhiều loài vi khuẩn và cổ khuẩn: Achnanthes exigua, Archaeoglobus spp, Bacillus coagulans, Clostridium thermoautotrophicum, Sulfolobus acidocaldarius, Thermoleophilum album, Thiobacillus thiooxidans (Resources, 1997). Đây là các loài có nhiệt độ sinh trưởng cao hoặc cực cao.

Sử dụng phương pháp này, nhiều loài vi khuẩn và cổ khuẩn mới cũng đã được phát hiện như Caldivirga maquilingensis gen. nov đã được phân lập từ suối nước nóng ở Phillipines (Itoh và cs., 1999); Vulcanisaeta distribute gen. và Vulcanisaeta souniana sp. đã được tìm thấy trong suối nước nóng ở Nhật Bản (Itoh và cs., 2002); Fervidicoccus fontis gen.

đã được thu nhận ở suối nước nóng tại vùng Kamchatka Peninsula, Nga (Perevalova và cs. 4 Mặc dù nhiều chủng, loài vi sinh vật khác nhau từ các suối nước nóng trên Thế giới đã được phân lập và phân loại, nhưng số lượng những loài chưa thể phân lập được vẫn còn rất lớn, do đó không thể tiếp cận được các vi sinh vật bản địa, nắm bắt được vai trò của chúng trong các chu trình chuyển hóa vật chất cũng như thu nhận được các chất có hoạt tính sinh học từ hệ sinh thái này. Sự ra đời của máy giải trình tự gen thế hệ mới được đánh giá là một công nghệ tiên tiến của ngành công nghệ sinh học, khi kết hợp với các công cụ tin sinh sẽ tạo thành kỹ thuật Metagenomic (kỹ thuật phân tích hệ gen môi trường), cho phép các nhà khoa học có điều kiện tiếp cận, bảo tồn và khai thác nguồn vi sinh vật một cách đầy đủ và toàn diện hơn. Hiệu quả của phương pháp này đã được chứng minh rõ rệt khi phân tích về số lượng, thành phần chủng loại của quần xã vi khuẩn trong suối nước nóng Comano Terme (Ý) so với phương pháp nuôi cấy thông thường (Pedron và cs.

Kết quả đánh giá đa dạng không thông qua nuôi cấy có thể bao phủ toàn bộ số liệu về chủng loại vi khuẩn phân lập được, do vậy bức tranh về quần xã vi sinh vật trong các hệ sinh thái suối nước nóng trở lên phong phú và đa dạng hơn. Trong các nghiên cứu trước đây, hầu hết các vi khuẩn phân lập được từ suối nước nóng Ma'in và Afra ở Jordanian thuộc chi Bacillus, Geobacillus và Anoxybacillus (Malkawi và Al-Omari, 2010; Al-Batayneh và cs., 2011), tuy nhiên sử dụng kỹ thuật Metagenomics cho thấy vi sinh vật trong hai suối nước nóng này đa dạng hơn rất nhiều với sự có mặt của các loài thuộc ngành Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Deinococcus, Verrucomicrobia, Planctomycetes và Chloroflexi (Hussein và cs. Sự phân bố và thành phần vi sinh vật trong mỗi suối nước nóng mang các đặc trưng riêng biệt, thường bị tác động bởi các yếu tố như nhiệt độ, thành phần hóa học và pH của suối nước nóng (López-López và cs. Nhiệt độ được coi là yếu tố chính ảnh hưởng đến số lượng và thành phần của quần xã vi sinh vật ở các vị trí khác nhau trong suối nước nóng.

Nhiệt độ trong suối nước nóng giới hạn sự sống sót của các sinh vật nhân thật (nhiệt độ giới hạn của chúng thường < 60ºC) và các sinh vật quang hợp (70°C). Ví dụ quần thể vi sinh vật ở suối nước nóng ven biển Iceland chịu tác động mạnh mẽ của sự thay đổi nhiệt độ và độ mặn do ảnh hưởng của thủy triều cao định kỳ. Nhóm vi khuẩn siêu ưa nhiệt chiếm ưu thế tại các vị trí có thời gian nóng 5 kéo dài nhất, trong khi nhóm vi sinh vật ưa nhiệt vừa phải, các vi sinh vật biển, các Proteobacteria ưa ấm được tìm thấy ở các khu vực có thời gian nóng ngắn nhất (Hobel và cs. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phân bố vi sinh vật dọc theo dòng chảy của suối nước nóng Octopus (suối nước nóng kiềm với pH=8,5, có nồng độ sulfide thấp) nằm trong công viên quốc gia Yellowstone cũng được nghiên cứu.

Ở vị trí cách miệng giếng phun 2 m có nhiệt độ khoảng 88°C chỉ tìm thấy các loài vi khuẩn thuộc chi Aquifex - tế bào có màu tím hồng, hóa tự dưỡng vô cơ. Dọc theo dòng chảy, càng ra xa miệng giếng phun, nhiệt độ càng giảm. Ở nhiệt độ khoảng 45-72oC, các loài vi khuẩn lam Cyanobacteria phát triển tạo thành các đám trên mặt nước. Trong số các chi vi khuẩn lam, Synechococcus có khả năng chịu nhiệt cao nhất (~ 72oC) tạo thành quần thể bên trên che phủ cho tầng dưới là quần thể của chi Chloroflexus - một loại vi khuẩn lam màu xanh lá cây, quang hợp không thải khí oxy.

Ngoài ra, các chi vi khuẩn lam khác như Phormidium và Calothrix cũng được tìm thấy trong dòng chảy của suối nước nóng Octopus ở các vị trí có nhiệt độ thấp hơn (Rothschild và Mancinelli, 2001). Ngoài yếu tố nhiệt độ, cấu trúc các quần xã vi sinh vật suối nước nóng có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác như đặc điểm địa hóa, hoặc sự kết hợp giữa hai yếu tố nhiệt độ và pH. Ngoài các yếu tố nhiệt độ, thành phần hóa học, pH, quần xã vi sinh vật trong suối nước nóng còn có thể chịu sự tác động của khoảng cách địa lý. Một số loài vi sinh vật có thể có mặt ở tất cả các suối nước nóng.

Tuy nhiên, bên cạnh đó cũng có những loài được cho là đặc hữu của một khu vực suối nước nóng. Vai trò của khoảng cách địa lý còn gây tranh cãi, nhưng có thể là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quần thể xạ khuẩn và vi khuẩn lam theo một số nghiên cứu nhưng không đại diện cho các quần thể vi sinh vật khác (Valverde và cs., 2012; López-López và cs. Mỗi suối nước nóng thường đặc trưng bởi một vài nhóm vi sinh vật chiếm ưu thế. Các nghiên cứu từ trước cho đến nay đều thấy Proteobacteria là ngành chiếm ưu thế trong các suối nước nóng ở Châu Phi (Tekere và cs., 2011), trong khi đó nhóm cổ khuẩn thuộc bộ Thermoplasmatales (chiếm 39%) thuộc ngành Euryarchaeota, và một nhóm cổ khuẩn khác (chiếm 33%) thuộc ngành Crenarchaeota lại là các nhóm ưu thế trong hệ sinh thái nước ngầm ở những vùng địa nhiệt ở Nga.

Cả hai ngành này đều là 6 những ngành có mặt trong các suối nước nóng trên toàn thế giới. Tuy nhiên, nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong hệ sinh thái này chủ yếu lại là vi khuẩn chuyển hóa methane, ưa axit, ưa nhiệt và vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh. Đây là các vi khuẩn có thể sử dụng các hợp chất vô cơ có nguồn gốc từ núi lửa để sinh trưởng (Mardanov và cs. Phân tích các đặc điểm phân loại của quần xã vi sinh vật trong suối nước nóng có tính axit ở Colombia cho thấy chỉ một tỷ lệ nhỏ các trình tự nucleotide trong DNA metagenome có thể được phân loại đến loài dựa vào các cơ sở dữ liệu hiện có, hầu hết vi sinh vật trong suối nước nóng là các loài mới, chưa được phân lập và phân loại.

Những vi sinh vật được phân loại có tiềm năng tham gia vào các chu trình chuyển hóa nitơ và lưu huỳnh trong môi trường (Jimenez và cs. Nghiên cứu suối nước nóng Sungai Klah (SK) là suối nước nóng kiềm (pH 7,0 - 9,0), có nhiệt độ cao thứ hai ở Malaysia (50 - 110°C) cho thấy ngành Proteobacteria và Firmicutes là hai ngành chiếm ưu thế (Chan và cs. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu về vi sinh vật ở suối nước nóng Kenya - suối nước nóng kiềm (pH 9,2 - 9,8), nhiệt độ 45,1 - 83,6ºC (Kambura và cs. Ngược lại, ngành Proteobacteria và Thermi chiếm ưu thế ở suối nước nóng axit nhẹ (pH 5 - 7), có nhiệt độ 45 - 90ºC (Paul và cs.

Điều đó chứng tỏ, mức độ đa dạng và phân bố của vi sinh vật trong suối nước nóng cũng bị ảnh hưởng rất nhiều bởi pH hệ sinh thái. Phân loại Dựa vào cơ chế hoạt động của các domain xúc tác và tính đặc hiệu cơ chất, cellulase được chia thành 3 dạng chính: β-1,4-endoglucanase (EC 3.4), exoglucanase [cellobiohydrolase phân giải cơ chất từ đầu không khử (EC 3.91), cellobiohydrolase phân giải cơ chất từ đầu khử (EC 3.176) và cellodextrinase (EC 3.74)] và β-glucosidase (EC 3. Endoglucanase phân cắt ngẫu nhiên các liên kết glycoside nội mạch của chuỗi cellulose, giải phóng ra các oligosaccharide có chiều dài khác nhau (như cellobiose và cellotriose). Cellobiohydrolase hoạt động phân cắt trên các đầu khử và không khử của cellulose, giải phóng cellobiose là chủ yếu, ngoài ra còn giải phóng ra các oligosaccharide mạch ngắn khác.

Cellodextrinase hoạt động trên các cellooligosaccharide hòa tan và nó cũng giải phóng ra cellobiose. 7 Cuối cùng, β-glucosidases thủy phân cellodextrin và cellobiose để tạo thành glucose, kích hoạt cả endoglucanase và exoglucanase bằng cách làm giảm sự ức chế của sản phẩm cuối cùng (Hình 1. Nguyên tắc hoạt động của cellulase thủy phân cellulose. Chú thích: Cellulose tinh thể (màu đỏ), cellulose vô định hình (màu đen).

Do polysaccharide rất đa dạng trong tự nhiên và thực tế cho thấy không phải lúc nào cũng dễ dàng phân loại cellulase thành endo- hoặc exoglucanase (Poidevin và cs., 2013) nên dựa trên mức độ tương đồng về trình tự axit amin và cấu trúc tinh thể, cellulase được xếp vào họ enzyme thủy phân glycoside (glycoside hydrolase - GH).