Tổng quan luận án

Bệnh ký sinh trùng lây truyền từ động vật sang người (zoonoses) do sán lá gây nên là vấn đề y tế cộng đồng quan trọng trên quy mô toàn cầu. Theo các thống kê dịch tễ học, riêng nhóm sán lá truyền qua thức ăn như cá, tôm, cua và thực vật thủy sinh đã làm nhiễm khoảng 50 triệu người hàng năm và đặt khoảng 750 triệu người trước nguy cơ lây nhiễm. Nhóm sán lá ruột nhỏ (minute intestinal flukes - MIF) thuộc họ Heterophyidae lây nhiễm sang người qua đường tiêu hóa do tập quán ăn cá sống hoặc nấu chưa chín, với ước tính hơn 7 triệu người nhiễm, phân bố tập trung chủ yếu tại các quốc gia châu Á như Hàn Quốc, Trung Quốc, Đài Loan, Việt Nam, Lào, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philippines và Ấn Độ.

Việc phân loại và định danh sán lá ruột nhỏ truyền thống chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái học (HTH) thông qua soi kính hiển vi và nhuộm tiêu bản. Tuy nhiên, do kích thước cơ thể sán rất nhỏ (khoảng 0,5–2 mm × 0,2–1,0 mm) và sự tồn tại của các dạng biến thể, "loài ẩn" (cryptic species), "loài chị em" (sister species) hoặc các dạng ấu trùng đồng hình ở các giai đoạn phát triển khác nhau, phương pháp hình thái bộc lộ nhiều hạn chế trong việc phân biệt chính xác ở cấp độ loài và dưới loài. Việc ứng dụng sinh học phân tử (SHPT) thông qua các chỉ thị hệ gen ty thể (mitochondrial DNA - mtDNA) và đơn vị mã hóa ribosome (ribosomal transcription unit - rTU) từ hệ gen nhân là công cụ then chốt để xác định loài, phân tích quan hệ phả hệ và tiến hóa. Khi đề tài được tiến hành, cơ sở dữ liệu quốc tế (GenBank, GOBASE) chỉ mới ghi nhận một số lượng rất hạn chế trình tự mtDNA và rTU của họ Heterophyidae. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đó, luận án tiến sĩ chuyên ngành Hóa sinh học (Mã số: 9 42 01 16) của nghiên cứu sinh Lê Thị Việt Hà thực hiện đề tài: "Nghiên cứu đặc điểm hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của một số loài sán lá ruột thuộc họ Heterophyidae ký sinh gây bệnh trên người và động vật tại Việt Nam" dưới sự hướng dẫn của GS. Lê Thanh Hòa và PGS.TS. Đồng Văn Quyền tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (2021).

Mục tiêu chung của luận án là: "Thu nhận toàn bộ hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của một số loài sán lá ruột nhỏ thuộc họ Heterophyidae tại Việt Nam, phân tích đặc điểm các gen và hệ gen nhằm phục vụ nghiên cứu dịch tễ phân tử và ứng dụng trong chẩn đoán, phân loại".

Hai mục tiêu cụ thể được xác định:

  1. Nghiên cứu xác định trình tự hệ gen ty thể loài sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui, phân tích đặc điểm các gen và xây dựng cây phân loại phả hệ.
  2. Nghiên cứu xác định trình tự đơn vị mã hóa ribosome của một số loài sán lá ruột nhỏ (Haplorchis taichui, Haplorchis pumilio), phân tích đặc điểm các gen và xây dựng cây phân loại phả hệ.

Đối tượng nghiên cứu của luận án là các loài sán lá ruột nhỏ thuộc họ Heterophyidae thu thập tại Việt Nam, trọng tâm là loài Haplorchis taichui (mẫu Htai-QT3-VN) và Haplorchis pumilio (mẫu Hpum-HPU8-VN), cùng mẫu đối chiếu Stellantchasmus falcatus (mẫu Sfal-QN2-VN) và các trình tự đối sánh quốc tế. Phạm vi nghiên cứu bao gồm việc thu thập mẫu tại các ổ dịch lưu hành ở Việt Nam (như Quảng Trị, Quảng Ninh, Nam Định...), giải trình tự toàn phần hệ gen ty thể, đơn vị phiên mã ribosome và thực hiện các phân tích tin sinh học phân tử trong giai đoạn từ các chương trình nghiên cứu tài trợ bởi Quỹ NAFOSTED (đề tài mã số 106-11 và 108.09) đến năm 2021.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế theo ba trục nội dung chính: phân loại và dịch tễ học họ Heterophyidae, đặc điểm hệ gen ty thể động vật ký sinh, và cấu trúc đơn vị phiên mã ribosome.

Về phân loại học và dịch tễ, họ Heterophyidae Leiper, 1909 thuộc bộ Opisthorchiida, phân bộ Opisthorchiata, liên họ Opisthorchioidea (cùng với họ Opisthorchiidae). Tác giả tổng hợp danh mục 29 loài sán lá ruột nhỏ lây nhiễm sang người qua đường ăn cá (theo Chai, Jung, 2017, 2020), phân chia thành 15 loài phổ biến và 14 loài ít phổ biến hơn. Chi Haplorchis có các loài chính gây bệnh trên người gồm H. taichui (Nishigori, 1924), H. pumilio (Looss, 1896, 1899), H. yokogawai (Katsuta, 1932) và H. vanissimus. Về mặt hình thái học, Pearson và Ow-Yang (1982) cùng De và Le (2011) mô tả các đặc điểm phân biệt giữa các loài Haplorchis chủ yếu dựa vào số lượng, hình dạng các gai móc câu (hooklets) trên giác bụng (ventral sucker): H. taichui có 12–16 gai móc xếp hình nải chuối; H. pumilio có 32–44 gai móc hình chữ U hoặc hở, kèm các gai nhỏ dài 2,5–5,0 μm; Stellantchasmus falcatus (Onji & Nishio, 1915) có hai tinh hoàn lớn đối diện nhau, túi tinh chia hai phần và kích thước trứng 20–24 × 10–13,5 μm (Đỗ Trung Dũng, 2015).

Về tình hình nghiên cứu dịch tễ tại Việt Nam, các công trình của Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa (2003, 2011), Dung và cộng sự (2007, 2013), Chi và cộng sự (2008), Thu và cộng sự (2007), Thien và cộng sự (2007), Lan-Anh và cộng sự (2009, 2010), Đỗ Trung Dũng (2015), Ngô Văn Thành (2016) đã ghi nhận sự lưu hành của sán lá ruột nhỏ tại 20 tỉnh, thành phố. Tại Nam Định, tỷ lệ nhiễm sán lá ruột nhỏ ở các hộ gia đình dao động từ 51,7% đến 64,8%, trong đó H. pumilio chiếm ưu thế. Trên vật chủ trung gian là cá nước ngọt, tỷ lệ nhiễm ấu trùng metacercariae tại Nghệ An là 44,6% (cá tự nhiên) và 38,4% (cá nuôi); tại Hà Nội (hồ Thanh Trì) là 55%, Nam Định (hồ Vị Xuyên) là 64,6%; các khảo sát tại khu vực sông Mê Kông cho thấy tỷ lệ nhiễm H. taichui là 4,3% và S. falcatus là 4,7%. Trên động vật nuôi, tỷ lệ nhiễm ở mèo là 48,4%, chó là 35% và lợn là 40,4%.

Về hệ gen ty thể và ribosome, các tác giả Boore (1999), Le và cộng sự (2000, 2001, 2002, 2004, 2016, 2020b), McManus và cộng sự (2004), Littlewood và cộng sự (2008), Lee và cộng sự (2013), Thaenkham và cộng sự (2010, 2011, 2012) đã chỉ ra rằng mtDNA của giun sán ký sinh là phân tử DNA mạch vòng kín (13–25 kb), gồm 12 gen mã hóa protein (PCG - thiếu gen atp8), 2 gen RNA ribosome ty thể (12S rRNA / rrnS và 16S rRNA / rrnL), 22 gen tRNA và vùng không mã hóa (NCR). Đơn vị phiên mã ribosome từ hệ gen nhân (rTU) gồm các gen 18S, 5.8S, 28S rRNA xen kẽ các vùng giao gen phiên mã nội (ITS-1, ITS-2).

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết là sự thiếu hụt dữ liệu phân tử toàn phần về mtDNA và rTU của các chủng sán lá ruột nhỏ lưu hành tại Việt Nam. Việc giải mã toàn bộ trình tự hệ gen ty thể của H. taichui và cấu trúc rTU của H. taichui, H. pumilio cung cấp cơ sở dữ liệu phân tử chuẩn để định loại chính xác, phân tích quan hệ di truyền phát sinh loài và phục vụ chẩn đoán dịch tễ học.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết sinh học phân tử, thuyết nội cộng sinh về nguồn gốc ty thể (Kuroiwa et al., 2006; Martin & Müller, 2007; Gray, 2012) và lý thuyết tiến hóa phân tử của hệ gen ty thể và hệ gen nhân ở ngành Sán dẹt (Platyhelminthes). Mã di truyền ty thể của sán lá được giải mã dựa trên bảng mã chuẩn "Echinoderm Mitochondrial Genetic Code" (Bảng mã số 9 trong cơ sở dữ liệu NCBI/GenBank).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai theo quy trình phân tích sinh học phân tử và tin sinh học định lượng:

  1. Thu thập mẫu và xử lý vật liệu sinh học: Mẫu sán lá ruột nhỏ trưởng thành được thu nhận từ người hoặc động vật qua tẩy xổ giun sán hoặc mổ khám ký sinh trùng; định loại sơ bộ bằng hình thái học qua kính hiển vi; bảo quản trong cồn 70–96% hoặc đông lạnh ở nhiệt độ -20°C.
  2. Kỹ thuật tách chiết DNA và khuếch đại gen: Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp chuẩn; sử dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp dài (Long-PCR / LPCR) kết hợp PCR thông thường với các cặp mồi chuyên biệt để khuếch đại các đoạn chồng lấp bao phủ toàn bộ hệ gen ty thể và đơn vị phiên mã ribosome.
  3. Giải trình tự và lắp ráp dữ liệu: Giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR bằng máy đọc trình tự tự động; lắp ráp chuỗi chung (consensus sequence) bằng các phần mềm tin sinh học chuyên dụng.
  4. Phân tích đặc điểm hệ gen ty thể (mtDNA):
    • Xác định ranh giới, vị trí và chiều dài của 12 gen PCG (cox1-3, nad1-6, nad4L, cob, atp6), 2 gen rRNA ty thể (rrnS, rrnL) và 22 gen tRNA.
    • Tính toán phương thức sử dụng nucleotide và giá trị độ lệch skewness: $$\text{AT-skew} = \frac{A - T}{A + T}$$ $$\text{GC-skew} = \frac{G - C}{G + C}$$
    • Phân tích thiên vị sử dụng bộ mã (codon usage), xác định bộ mã mở đầu (ATG, GTG...) và bộ mã kết thúc (TAG, TAA, bộ mã khuyết T, TA).
    • Dự đoán cấu trúc bậc hai của 22 tRNA (cấu trúc hình lá sồi hoặc cấu trúc biến đổi mất nhánh DHU/TΨC) và phân tích các tiểu vùng lặp (SRU, LRU) trong vùng không mã hóa (NCR).
  5. Phân tích đặc điểm đơn vị mã hóa ribosome (rTU):
    • Xác định ranh giới các gen 18S rRNA, 5.8S rRNA, 28S rRNA và các vùng phân cách ITS-1, ITS-2.
    • Phân tích độ dài, tỷ lệ nucleotide (A, T, G, C) và giá trị độ lệch skew trong rTU.
    • Mô hình hóa cấu trúc bậc hai của gen 5.8S rRNA và các vùng giao gen ITS-1, ITS-2 dựa trên mức năng lượng tự do tối thiểu (minimum free energy - MFE).
  6. Phân tích di truyền và xây dựng cây phát sinh loài (phả hệ):
    • Tính toán khoảng cách di truyền (genetic distance) dựa trên ma trận amino acid của tập hợp 3 gen (cob + nad1 + cox1) và toàn bộ 12 PCG ty thể giữa mẫu nghiên cứu với các loài thuộc họ Heterophyidae, Opisthorchiidae, Echinostomatidae, Fasciolidae.
    • Xây dựng cây phả hệ dựa trên chuỗi amino acid cộng hợp 3 PCG và 12 PCG ty thể.
    • Phân tích phả hệ dựa trên trình tự nucleotide của gen 28S rRNA toàn phần và chuỗi cộng hợp (18S + 28S rRNA) toàn phần của H. pumilio.

Nguồn dữ liệu đối chiếu được trích xuất từ cơ sở dữ liệu quốc tế GenBank (NCBI) và GOBASE.

Hạng mục dữ liệu / Chỉ thị Đặc điểm phân tích
Hệ gen ty thể (mtDNA) 12 PCG (cox1-3, nad1-6, nad4L, cob, atp6), 2 MRG (12S, 16S rRNA), 22 tRNA, vùng NCR
Đơn vị ribosome (rTU) Gen 18S rRNA, vùng ITS-1, gen 5.8S rRNA, vùng ITS-2, gen 28S rRNA
Chỉ thị phả hệ ty thể Chuỗi amino acid cộng hợp 3 gen (cob+nad1+cox1) và 12 PCG toàn phần
Chỉ thị phả hệ ribosome Trình tự nucleotide toàn phần gen 28S rRNA và cộng hợp (18S+28S rRNA)

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương 1 tổng thuật chi tiết bối cảnh lý thuyết và thực tiễn của đề tài:

  • Phân loại và dịch tễ học họ Heterophyidae: Trình bày phân loại từ ngành Sán dẹt (Platyhelminthes), phân lớp Digenea, bộ Opisthorchiida, phân bộ Opisthorchiata đến họ Heterophyidae. Danh mục 29 loài sán lá ruột nhỏ lây nhiễm qua cá (Bảng 1.1) phản ánh tính đa dạng loài và phạm vi phân bố rộng tại châu Á, châu Phi, châu Mỹ và châu Âu.
  • Đặc điểm sinh học và vòng đời: Mô tả chu kỳ sinh học qua hai vật chủ trung gian (ốc nước ngọt/lợ và cá nước ngọt/lợ) trước khi xâm nhập vào vật chủ chính (người, động vật có vú, chim). Trình bày chi tiết hình thái của các loài H. taichui, H. pumilio, S. falcatus và H. yokogawai.
  • Thực trạng dịch tễ tại Việt Nam: Điểm lại các nghiên cứu ghi nhận sán lá ruột nhỏ tại 20 tỉnh thành, tập trung tại các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ; phân tích tỷ lệ nhiễm ở người, ốc, cá và các vật chủ tàng trữ (chó, mèo, lợn).
  • Cơ sở cấu trúc hệ gen ty thể và ribosome: Giới thiệu tổ chức mtDNA động vật ký sinh (12 PCG, thiếu gen atp8, 2 gen RNA ribosome ty thể, 22 tRNA và vùng NCR) và cấu trúc rTU nhân (các gen 18S, 5.8S, 28S rRNA cùng các vùng ITS-1, ITS-2, ETS, IGS/NTS).

Chương 2. Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết phương pháp luận thực nghiệm:

  • Vật liệu và mẫu nghiên cứu: Mô tả quy trình thu thập mẫu sán lá ruột nhỏ thuộc họ Heterophyidae tại các địa phương Việt Nam (mẫu H. taichui Htai-QT3-VN thu tại Quảng Trị, mẫu H. pumilio Hpum-HPU8-VN, mẫu S. falcatus Sfal-QN2-VN thu tại Quảng Ninh).
  • Quy trình phân tích mtDNA: Trình bày thiết kế các cặp mồi cho kỹ thuật Long-PCR; quy trình giải trình tự toàn bộ hệ gen ty thể; phương pháp phân tích gen mã hóa protein (PCG), gen RNA ribosome (MRG), gen RNA vận chuyển (tRNA), vùng không mã hóa (NCR), tính toán độ lệch nucleotide (AT-skew, GC-skew) và thiên vị bộ mã (codon usage).
  • Quy trình phân tích rTU: Thiết kế mồi và khuếch đại phân đoạn mã hóa ribosome; phương pháp phân tích trình tự nucleotide, độ tương đồng, độ lệch skew; phương pháp mô hình hóa cấu trúc bậc hai của gen 5.8S rRNA và các vùng giao gen ITS-1, ITS-2 theo năng lượng tự do tối thiểu (MFE).
  • Phương pháp phân tích phát sinh loài: Trình bày thuật toán và ma trận tính khoảng cách di truyền, quy trình xây dựng cây phả hệ dựa trên 3 PCG (cob+nad1+cox1), 12 PCG ty thể, gen 28S rRNA toàn phần và chuỗi kết hợp (18S+28S rRNA).

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

  • Hệ gen ty thể loài Haplorchis taichui mẫu Việt Nam (Htai-QT3-VN):
    • Xác định toàn bộ trình tự mtDNA của H. taichui với tổng chiều dài 15.120 bp (đã đăng ký trên GenBank với mã số MG972809), so sánh với mẫu H. taichui của Lào (15.131 bp; GenBank KF214770) (Bảng 3.1).
    • Hệ gen gồm 12 PCG, 2 MRG (rrnS, rrnL), 22 tRNA và 1 vùng không mã hóa chính (NCR). Tất cả các gen đều được phiên mã theo cùng một chiều (one-way transcription).
    • Phân tích tỷ lệ nucleotide và giá trị độ lệch skew: Hệ gen giàu A+T; xác định độ lệch AT-skew và GC-skew trên từng gen PCG, rRNA và tRNA (Bảng 3.2).
    • Phân tích codon usage: Xác định các bộ mã khởi đầu (ATG, GTG) và bộ mã kết thúc (TAG, TAA cùng các bộ mã khuyết T, TA).
    • Cấu trúc tRNA: Mô tả cấu trúc bậc hai của 22 tRNA, ghi nhận các dạng biến đổi cấu trúc nhánh như mất nhánh DHU (DHU-replacement loop) hoặc mất nhánh TΨC (TΨC-replacement loop).
    • Khoảng cách di truyền và cây phả hệ: Ma trận khoảng cách di truyền dựa trên 3 gen (cob+nad1+cox1) (Bảng 3.4) và 12 PCG (Bảng 3.5) cho thấy sự tách biệt rõ ràng giữa các loài họ Heterophyidae (H. taichui, S. falcatus) với các loài thuộc họ Opisthorchiidae (Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini), Echinostomatidae và Fasciolidae. Cây phả hệ khẳng định vị trí phân loại của H. taichui trong họ Heterophyidae.
  • Đơn vị mã hóa ribosome của Haplorchis taichui và Haplorchis pumilio mẫu Việt Nam:
    • Xác định cấu trúc, trật tự sắp xếp và độ dài các gen 18S rRNA, 5.8S rRNA, 28S rRNA và các vùng giao gen ITS-1, ITS-2 của H. taichui (Htai-QT3-VN) và H. pumilio (Hpum-HPU8-VN, kích thước khoảng 7,7 kb) (Bảng 3.6).
    • Phân tích tỷ lệ nucleotide và độ lệch skew trong các vùng phiên mã ribosome (Bảng 3.7).
    • Phân tích cấu trúc bậc hai: Xác định cấu trúc bậc hai của gen 5.8S rRNA với các vùng xoắn (stem) và vòng (loop) bảo tồn; mô hình hóa cấu trúc bậc hai của ITS-1 và ITS-2 ở H. taichui và H. pumilio.
    • Phân tích tương đồng nucleotide giữa các loài sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae (H. taichui, H. pumilio, Cryptocotyle lingua, Euryhelmis costaricensis) (Bảng 3.8).
    • Phân tích phả hệ dựa trên chuỗi nucleotide gen 28S rRNA toàn phần và chuỗi cộng hợp (18S+28S rRNA) toàn phần của H. pumilio, làm rõ mối quan hệ phát sinh loài của chi Haplorchis trong họ Heterophyidae.
Loài / Mẫu nghiên cứu Kích thước phân tử Thành phần cấu trúc chính Mã số GenBank
Haplorchis taichui (Htai-QT3-VN) 15.120 bp (mtDNA) 12 PCG, 2 MRG (rrnS, rrnL), 22 tRNA, vùng NCR MG972809
Haplorchis taichui (mẫu Lào - đối sánh) 15.131 bp (mtDNA) 12 PCG, 2 MRG, 22 tRNA, vùng NCR KF214770
Haplorchis pumilio (Hpum-HPU8-VN) ~7,7 kb (rTU) 18S rRNA, ITS-1, 5.8S rRNA, ITS-2, 28S rRNA Dữ liệu luận án
Stellantchasmus falcatus (Sfal-QN2-VN) Đoạn gen PCG Chỉ thị cob, nad1, cox1 ty thể Dữ liệu luận án

Chương 4. Bàn luận kết quả

Chương 4 thảo luận sâu các kết quả thu được:

  • Về hệ gen ty thể của Haplorchis taichui: Đánh giá kích thước 15.120 bp của chủng Việt Nam so với chủng Lào (15.131 bp), thảo luận về sự bảo tồn trật tự sắp xếp gen, đặc điểm phiên mã một chiều, sự thiếu vắng gen atp8 phù hợp với quy luật chung của ngành Sán dẹt. Thảo luận về hiện tượng gối lồng nucleotide giữa các gen kế cận và cấu trúc các tiểu vùng lặp trong vùng không mã hóa (NCR).
  • Về ứng dụng mtDNA trong di truyền và phả hệ: So sánh độ nhạy và giá trị phân loại của các chỉ thị đơn gen (cox1, nad1, cob) và tập hợp đa gen (12 PCG). Khẳng định việc sử dụng toàn bộ 12 PCG ty thể giúp giải quyết triệt để các vị trí phân nhánh còn tranh cãi trong phân loại sán lá ruột nhỏ.
  • Về đặc điểm đơn vị mã hóa ribosome: Thảo luận về mức độ biến dị của các vùng giao gen ITS-1, ITS-2 so với tính bảo tồn cao của các gen 18S và 28S rRNA. Phân tích vai trò của cấu trúc bậc hai 5.8S rRNA và các vùng ITS trong việc duy trì chức năng xử lý tiền chất rRNA.
  • Về đóng góp cơ sở dữ liệu: Đánh giá ý nghĩa của việc bổ sung các trình tự hoàn chỉnh mtDNA và rTU của các chủng phân lập tại Việt Nam vào ngân hàng gen quốc tế, tạo tiền đề cho các nghiên cứu dịch tễ học phân tử tiếp theo.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án tự tổng kết các đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn:

  1. Đóng góp mới về khoa học và lý luận:

    • Giải mã và công bố toàn bộ trình tự hệ gen ty thể hoàn chỉnh của loài sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui phân lập tại Việt Nam (mẫu Htai-QT3-VN) với kích thước 15.120 bp (GenBank: MG972809). Xác định đầy đủ vị trí, ranh giới, chiều phiên mã của 12 gen PCG, 2 gen rRNA ty thể, 22 gen tRNA và vùng NCR.
    • Giải mã và xác định cấu trúc toàn phần đơn vị mã hóa ribosome (rTU) của hai loài Haplorchis taichui và Haplorchis pumilio tại Việt Nam; xác định đặc điểm nucleotide, độ lệch skew và mô hình hóa thành công cấu trúc bậc hai của gen 5.8S rRNA, vùng ITS-1 và ITS-2.
    • Cung cấp dữ liệu khoảng cách di truyền định lượng và xây dựng hệ thống cây phát sinh loài tin cậy dựa trên các chỉ thị đa gen ty thể (tổ hợp 3 gen cob+nad1+cox1, 12 PCG) và chỉ thị ribosome (28S rRNA toàn phần, tổ hợp 18S+28S rRNA), làm rõ quan hệ tiến hóa giữa chi Haplorchis, chi Stellantchasmus với các nhóm sán lá khác trong liên họ Opisthorchioidea.

  2. Đóng góp mới về thực tiễn:

    • Cung cấp tập hợp các chỉ thị phân tử chuẩn xác phục vụ công tác giám định loài, chẩn đoán phân biệt các loài sán lá ruột nhỏ có hình thái tương đồng gây bệnh ở người và động vật.
    • Bổ sung cơ sở dữ liệu trình tự gen chuẩn cho Việt Nam trên cơ sở dữ liệu GenBank quốc tế, hỗ trợ các nghiên cứu dịch tễ học phân tử và kiểm soát nguồn lây nhiễm từ cá.

  3. Kiến nghị:

    • Tiếp tục mở rộng nghiên cứu giải mã toàn bộ hệ gen ty thể và đơn vị ribosome cho các loài sán lá ruột nhỏ khác thuộc họ Heterophyidae lưu hành tại Việt Nam như Centrocestus formosanus, Stictodora lari, Procerovum varium...
    • Ứng dụng các đoạn mồi và chỉ thị phân tử từ mtDNA và rTU của luận án vào việc xây dựng quy trình PCR/Real-time PCR phát hiện nhanh ấu trùng metacercariae trên các nguồn cá thực phẩm và cá nuôi thương phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Luận án tập trung phân tích sâu trên hệ gen ty thể toàn phần của loài H. taichui và đơn vị rTU của H. taichui, H. pumilio. Một số loài sán lá ruột nhỏ khác cùng họ thu thập tại Việt Nam (như Stellantchasmus falcatus) mới chỉ dừng lại ở mức độ phân tích các chỉ thị đơn gen hoặc cộng hợp một số gen PCG nhất định, chưa giải mã hoàn chỉnh toàn bộ mtDNA.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Mở rộng thu thập mẫu sán lá ruột nhỏ trên nhiều vùng địa lý sinh thái khác nhau tại Việt Nam (miền Trung và miền Nam) để đánh giá đa dạng di truyền quần thể nội loài.
    • Giải mã hoàn chỉnh hệ gen ty thể của H. pumilio, S. falcatus và các chi khác thuộc họ Heterophyidae nhằm hoàn thiện cơ sở dữ liệu so sánh hệ gen học ty thể (comparative mitogenomics).

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị chuyên môn đối với:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học, giảng viên và nhà nghiên cứu chuyên ngành Hóa sinh học, Sinh học phân tử, Ký sinh trùng học và Động vật học: Cung cấp phương pháp luận chi tiết về kỹ thuật Long-PCR khuếch đại hệ gen ty thể, quy trình phân tích tin sinh học về codon usage, RNA secondary structure, nucleotide skewness và các phương pháp xây dựng cây phả hệ đa gen.
  • Cán bộ ngành Y tế dự phòng và Thú y: Cung cấp dữ liệu dịch tễ học phân tử, thông tin về các loài sán lá truyền qua cá gây bệnh ở người và động vật, cùng các chỉ thị phân tử phục vụ công tác giám sát, chẩn đoán và phòng chống bệnh ký sinh trùng lây truyền từ động vật sang người tại cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

1. Kích thước và thành phần cấu tạo hệ gen ty thể hoàn chỉnh của Haplorchis taichui (mẫu Việt Nam) được xác định trong luận án là bao nhiêu?
Hệ gen ty thể hoàn chỉnh của Haplorchis taichui mẫu Việt Nam (ký hiệu Htai-QT3-VN) có kích thước 15.120 bp (mã số GenBank: MG972809), gồm 12 gen mã hóa protein (PCG), 2 gen RNA ribosome ty thể (12S rRNA và 16S rRNA), 22 gen tRNA và 1 vùng không mã hóa chính (NCR). Tất cả các gen đều được phiên mã theo cùng một chiều.

2. Điểm đặc thù về số lượng gen mã hóa protein trong hệ gen ty thể của sán lá ruột nhỏ so với động vật có xương sống là gì?
Hệ gen ty thể của sán lá ruột nhỏ (và ngành Sán dẹt nói chung) chỉ có 12 gen mã hóa protein, hoàn toàn không có gen atp8 (gen ATPase subunit 8 vốn hiện diện ở động vật có xương sống và người). 12 gen PCG gồm có: cox1-3, nad1-6, nad4L, cob và atp6.

3. Tỷ lệ nhiễm sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae tại một số địa phương ở Việt Nam được ghi nhận như thế nào trong luận án?
Luận án ghi nhận sán lá ruột nhỏ có mặt tại 20 tỉnh thành ở Việt Nam. Tại Nam Định, tỷ lệ nhiễm ở người tại một số hộ gia đình từ 51,7% đến 64,8% (trong đó H. pumilio chiếm ưu thế). Trên cá nước ngọt, tỷ lệ nhiễm ấu trùng metacercariae tại Nghệ An là 44,6% (cá tự nhiên) và 38,4% (cá nuôi); tại Hà Nội (hồ Thanh Trì) là 55%, Nam Định (hồ Vị Xuyên) là 64,6%. Trên động vật nuôi, tỷ lệ nhiễm ở mèo là 48,4%, chó là 35% và lợn là 40,4%.

4. Bảng mã di truyền nào được sử dụng để dịch mã các gen PCG trong hệ gen ty thể của sán lá ruột nhỏ?
Các gen mã hóa protein (PCG) trong hệ gen ty thể của sán lá ruột nhỏ được dịch mã dựa trên bảng mã di truyền ty thể "Echinoderm Mitochondrial Genetic Code" (Bảng mã số 9 trong cơ sở dữ liệu GenBank/NCBI), trong đó bộ mã mở đầu có thể là ATG hoặc GTG, bộ mã kết thúc là TAG, TAA hoặc bộ mã khuyết (T, TA), và mã TGA mã hóa cho amino acid Tryptophan (W) thay vì mã kết thúc.

5. Luận án đã sử dụng những tập hợp chỉ thị phân tử nào để phân tích phả hệ và khoảng cách di truyền?
Luận án sử dụng các tập hợp chỉ thị gồm: chuỗi amino acid cộng hợp 3 gen PCG ty thể (cob+nad1+cox1), chuỗi amino acid cộng hợp toàn bộ 12 PCG ty thể, trình tự nucleotide toàn phần của gen 28S rRNA và chuỗi nucleotide cộng hợp hai gen (18S+28S rRNA) toàn phần từ đơn vị mã hóa ribosome nhân.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Lê Thị Việt Hà đã hoàn thành việc giải mã và phân tích cấu trúc hệ gen ty thể toàn phần của loài sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui (15.120 bp) và đơn vị phiên mã ribosome của H. taichui và H. pumilio phân lập tại Việt Nam. Công trình đã làm rõ đặc điểm tổ chức gen, phương thức sử dụng bộ mã, cấu trúc bậc hai của các RNA chức năng và xác lập cây phát sinh loài tin cậy cho họ Heterophyidae trong phân bộ Opisthorchiata. Các kết quả đạt được cung cấp cơ sở dữ liệu phân tử chuẩn mực, phục vụ trực tiếp cho công tác chẩn đoán, giám định loài và nghiên cứu dịch tễ học bệnh sán lá truyền qua thức ăn tại Việt Nam.