Nghiên cứu squalene từ vi tảo Schizochytrium mangrovei PQ6 - Luận án tiến sĩ sinh học của Nguyễn Cẩm Hà

• Tác giả: Nguyễn Cẩm Hà
• Người hướng dẫn: GS.TS. Đặng Diễm Hồng
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƢỚNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE, MỸ PHẨM VÀ DƢỢC PHẨM
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về squalene từ vi tảo Schizochytrium mangrovei PQ6

Squalene là hợp chất triterpenoid có 30 nguyên tử carbon, tồn tại tự nhiên trong nhiều sinh vật. Hợp chất này đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp steroid và cholesterol. Nguồn truyền thống của squalene chủ yếu từ gan cá mập. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức gây ra vấn đề bảo tồn nghiêm trọng. Vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 được nghiên cứu như nguồn thay thế tiềm năng. Loài vi tảo này thuộc lớp Thraustochytrids, có khả năng tích lũy lipid cao trong tế bào. Đặc tính dị dưỡng cho phép vi tảo sử dụng glucose làm nguồn carbon chính. Quy trình nuôi cấy đơn giản hơn so với vi tảo quang dưỡng. Nghiên cứu tập trung định hướng sản xuất squalene làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm. Kết quả mở ra hướng phát triển bền vững cho ngành công nghiệp nguyên liệu sinh học.

1.1. Đặc điểm sinh học của vi tảo Schizochytrium mangrovei PQ6

Schizochytrium mangrovei PQ6 là vi tảo biển dị dưỡng được phân lập từ vùng ngập mặn Việt Nam. Loài này thuộc lớp Thraustochytrids, có khả năng tích lũy lipid cao. Tế bào hình cầu, kích thước 10-20 micromet. Tốc độ sinh trưởng nhanh với thời gian nhân đôi 8-12 giờ. Điều kiện nuôi cấy tối ưu: nhiệt độ 25-30°C, pH 6.0-7.5. Vi tảo sử dụng glucose và glycerol làm nguồn carbon. Hàm lượng lipid tổng số có thể đạt 70% khối lượng khô tế bào.

1.2. Vai trò của squalene trong đời sống và y tế

Squalene đóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực. Trong y tế, squalene là tá dược vắc-xin hiệu quả, kích thích đáp ứng miễn dịch. MF59 chứa squalene được sử dụng trong vắc-xin phòng cúm, viêm gan. Trong mỹ phẩm, squalene dưỡng ẩm, chống oxy hóa, bảo vệ da khỏi tia UV. Trong thực phẩm chức năng, squalene hỗ trợ sức khỏe tim mạch, có tác dụng chống viêm kháng khuẩn.

II. Thách thức trong nghiên cứu squalene từ vi tảo biển

Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển đối mặt nhiều thách thức. Hàm lượng squalene trong tế bào vi tảo thường thấp hơn so với gan cá mập. Điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sản lượng squalene. Các yếu tố như nhiệt độ, pH, nồng độ glucose cần được tối ưu hóa. Quy trình tách chiết squalene từ tế bào tảo phức tạp. Tế bào tảo có thành cứng, khó phá vỡ để giải phóng lipid. Chi phí sản xuất từ nguyên liệu đầu vào như glucose còn cao. Quy trình thu hoạch và xử lý sinh khối tảo đòi hỏi công nghệ chuyên biệt. Việc mở rộng quy mô từ phòng thí nghiệm sang công nghiệp gặp khó khăn. Chất lượng sản phẩm phải đáp ứng tiêu chuẩn dược phẩm quốc tế. Những thách thức này cần được giải quyết để thương mại hóa sản phẩm.

2.1. Giới hạn về hàm lượng squalene trong tế bào vi tảo

Hàm lượng squalene trong tế bào vi tảo chiếm tỷ lệ nhỏ, thấp hơn so với gan cá mập. Điều này ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế sản xuất. Các yếu tố như giai đoạn sinh trưởng, điều kiện môi trường tác động đến tích lũy squalene. Stress môi trường có thể kích thích tăng sinh tổng hợp lipid. Nghiên cứu cần tìm phương pháp tăng hàm lượng squalene. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy là giải pháp khả thi.

2.2. Khó khăn trong quy trình tách chiết và tinh chế

Quy trình tách chiết squalene từ tế bào tảo phức tạp do thành tế bào cứng. Phá vỡ tế bào đòi hỏi phương pháp vật lý hoặc hóa học. Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ kết hợp sắc ký silica gel để tinh chế. Quy trình nhiều bước làm tăng chi phí sản xuất. Squalene thu được phải đạt tiêu chuẩn nguyên liệu dược phẩm quốc tế.

III. Phương pháp nghiên cứu và tối ưu hóa quy trình sản xuất

Nghiên cứu áp dụng nhiều phương pháp để tối ưu hóa sản xuất squalene. Thiết kế thí nghiệm được xây dựng có hệ thống. Các yếu tố nuôi cấy được khảo sát độc lập và tương tác. Nhiệt độ nuôi cấy dao động từ 25-30 độ C. pH từ 6.0-7.5 được kiểm soát tự động. Nồng độ glucose từ 20-60 g/L được thử nghiệm. Thời gian nuôi cấy từ 5-7 ngày được theo dõi. Sinh khối tảo được thu hoạch bằng ly tâm. Quy trình tách chiết sử dụng chloroform-methanol. Sắc ký cột silica gel tinh chế squalene. Các kỹ thuật phân tích hiện đại được ứng dụng. GC-MS định lượng hàm lượng squalene. HPLC kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm. NMR xác nhận cấu trúc hóa học. Kết quả đánh giá qua hàm lượng và sản lượng squalene.

3.1. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy vi tảo

Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy là bước quan trọng trong nghiên cứu. Nhiệt độ 25-30°C ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng. pH 6.0-7.5 được kiểm soát bằng đệm phosphate. Nồng độ glucose 20-60 g/L là nguồn carbon chính. Thời gian nuôi cấy 5-7 ngày cho kết quả tối ưu. Các phép đo sinh khối và hàm lượng lipid được thực hiện định kỳ.

3.2. Quy trình tách chiết và phân tích squalene

Quy trình tách chiết squalene sử dụng hệ dung môi chloroform-methanol tỷ lệ 2:1. Phương pháp siêu âm hỗ trợ phá vỡ tế bào. Sắc ký cột silica gel tinh chế squalene với elution hexane-ethyl acetate. Phân tích GC-MS định lượng, HPLC kiểm tra độ tinh khiết trên 95%. NMR xác nhận cấu trúc hóa học của sản phẩm.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của squalene

Kết quả nghiên cứu đạt được nhiều thành tựu đáng ghi nhận. Hàm lượng squalene trong tế bào vi tảo được cải thiện rõ rệt. Điều kiện nuôi cấy tối ưu đã được xác định. Quy trình tách chiết cho sản phẩm đạt độ tinh khiết cao. Squalene từ Schizochytrium mangrovei PQ6 đáp ứng tiêu chuẩn quốc tế. Sản phẩm được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực thực tiễn. Trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe, squalene là thành phần chống oxy hóa. Trong mỹ phẩm, squalene dưỡng ẩm và bảo vệ da. Trong dược phẩm, squalene làm tá dược vắc-xin hiệu quả. Nghiên cứu tạo nền tảng cho sản xuất công nghiệp. Nguồn nguyên liệu từ vi tảo thân thiện với môi trường. Giải quyết vấn đề bảo tồn cá mập. Phát triển bền vững ngành công nghiệp sinh học.

4.1. Đánh giá chất lượng sản phẩm squalene thu được

Sản phẩm squalene được đánh giá chất lượng toàn diện. Hàm lượng trong tế bào đạt 3-5% khối lượng khô. Độ tinh khiết sau tinh chế đạt trên 95%. Phân tích GC-MS và NMR xác nhận cấu trúc chính xác. Sản phẩm không chứa kim loại nặng vượt ngưỡng. Đáp ứng tiêu chuẩn nguyên liệu dược phẩm quốc tế.

4.2. Tiềm năng ứng dụng và hướng phát triển

Squalene từ vi tảo có tiềm năng ứng dụng rộng rãi. Trong thực phẩm chức năng tăng cường miễn dịch. Trong mỹ phẩm chống lão hóa tự nhiên. Trong dược phẩm làm tá dược vắc-xin. Sản phẩm thay thế squalene từ gan cá mập, bảo vệ đa dạng sinh học. Hướng phát triển bao gồm tối ưu hóa công nghiệp và thương mại hóa quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN CẨM HÀ NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƢỚNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE, MỸ PHẨM VÀ DƢỢC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC Hà Nội - Năm 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN CẨM HÀ NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƢỚNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE, MỸ PHẨM VÀ DƢỢC PHẨM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS. TS Đặng Diễm Hồng Hà Nội – Năm 2020 i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. Đặng Diễm Hồng, nguyên Trưởng phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - người thầy đã định hướng, truyền dạy những kiến thức khoa học và giúp đỡ tôi vượt qua những trở ngại và khó khăn trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Ban Lãnh đạo và bộ phận đào tạo của Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu. Trong quá trình viết luận án tôi đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của TS. Hoàng Thị Lan Anh. Ngoài ra tôi cũng nhận được sự giúp đỡ của các đồng nghiệp làm việc tại phòng Công nghệ Tảo: TS. Hoàng Thị Minh Hiền, TS. Ngô Thị Hoài Thu, TS. Lưu Thị Tâm, ThS. Lê Thị Thơm. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. Nguyễn Hoàng Ngân- Học viện Quân Y, đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm, phân tích độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và tác dụng dược lý của squalene. Luận án được thực hiện trong khuôn khổ các đề tài Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia - Nafosted, Bộ Khoa học và Công nghệ “Nghiên cứu đánh giá và khai thác chất squalene làm dược phẩm từ vi tảo biển của Việt Nam” (2013-2016) do PGS. Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm, đề tài “Cơ chế điều hòa trao đổi lipid của các hợp chất từ thực vật biển Việt Nam trong phòng và điều trị bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu” (2014-2016) và đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi trồng lượng lớn sinh khối tảo Schizochytrium mangrovei PQ6 và tách chiết qualene đủ tiêu chuẩn nguyên liệu làm thực phẩm chức năng” (2014-2016) do TS. Hoàng Thị Minh Hiền làm chủ nhiệm. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả Nguyễn Cẩm Hà ii Lời cam đoan Tôi xin cam Ďoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần Ďã Ďược công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự Ďồng ý và cho phép của các Ďồng tác giả; Phần còn lại chưa Ďược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2020 Tác giả Nguyễn Cẩm Hà iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn……………………………………………………………………. i Lời cam Ďoan…………………………………………………………………. ii Mục lục………………………………………………………………………… iii Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt…………………………………………. viii Danh mục các bảng……………………………………………………. xi Danh mục các hình vẽ, Ďồ thị…………………………………………………. xii MỞ ĐẦU………………………………………………………………………. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………. Giới thiệu chung về squalene…………………………………. Tính chất hóa lý của squalene…………………………………. Nguồn gốc và cấu trúc của squalene…………………………….3 Các con Ďường sinh tổng hợp của squalene ở Ďộng vật, thực vật và vi sinh vật…………………………………………………….4 Ứng dụng của squalene…………………………………………. Các nguồn cung cấp squalene…………………………………. Công nghệ tách chiết và tinh sạch squalene……………. Công nghệ tách chiết squalene…………………………………. Các phương pháp Ďịnh lượng và tinh sạch squalene…………. Giới thiệu công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dƣỡng……… 29 1. Giới thiệu về chi vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium……….1 Đặc Ďiểm chung của chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium…. Tình hình nuôi trồng chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium cho sản xuất squalene…………………………………………… 37 1. Tình hình nuôi trồng chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium cho sản xuất squalene trên thế giới……………………………. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng Schizochytrium cho sản xuất squalene ở Việt Nam………………………………………………. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………. Các bộ kít sinh phẩm……………………………………………. Động vật thí nghiệm……………………………………………. Các dòng tế bào…………………………………………………. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm…………………………………. Môi trường nuôi cấy……………………………………………. Phƣơng pháp nghiên cứu……………………………………… 48 2. Nhóm phương pháp xác Ďịnh chủng/loài; Ďặc Ďiểm sinh học; Ďiều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng cho sản xuất squalene cao ………………. Phương pháp xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào và sinh khối khô………………………………………………………………… 48 2. Phương pháp chụp ảnh hình thái………………………………. Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng số trong sinh khối tảo………………………………………………………………………. Phương pháp nhuộm lipid bằng Nile Red…………………………. Phương pháp xác định đường khử bằng DNSA…………………… 49 2. Phương pháp xác định sơ bộ hàm lượng squalene………………. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu điều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng thuộc chi Schizochytrium cho sản xuất squalene cao …………………………………………………………. Nhóm phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch squalene từ S. Phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ sinh khối S. Phương pháp xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch squalene ở quy mô pilot từ sinh khối tảo S. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của squalene. Phương pháp xác định cấu trúc của squalene. Nhóm phương pháp xác Ďịnh các chỉ tiêu chất lượng của squalene tách chiết từ S. Nhóm phương pháp Ďánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên Ďộng vật thực nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro)………………….1 Nhóm phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vivo……………………………………………………………………… 58 2. Nhóm phương pháp đánh giá bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro…………………………………………………. Thống kê phân tích số liệu……………………………………… 63 2. Địa Ďiểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu…………… 63 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN…. Sàng lọc chủng vi tảo biển dị dƣỡng có tiềm năng sản xuất squalene………………………………………………………… 65 3. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 lên sinh trƣởng và hàm lƣợng squalene…………………………. Tối ưu Ďiều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 cho sản xuất squalene ở cấp Ďộ bình tam giác………………………………… 67 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác………………………………………………. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác …………………………… 69 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác……………………… 70 3. Ảnh hưởng của nồng độ tebinafine lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác …………………………… 72 3. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp vitamin lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác………….2 Tối ưu Ďiều kiện nuôi trồng chủng S. mangrovei PQ6 ở bình lên men 30 lít Ďể thu sinh khối tảo giàu squalene…………………. Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ trong hệ thống bình lên men 30 lít…………………………………………. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ trong hệ thống lên men 30 lít………………………………………………………….3 Ảnh hưởng của lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S.4 Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene từ S. Tối ưu Ďiều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ S. Tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S.2 Tách chiết lipid không xà phòng hóa từ lipid tổng số……………. Tinh sạch và định lượng squalene bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp…………………………………………………………. Tách chiết, tinh sạch và làm giàu squalene bằng phương pháp dung môi………………………………………………………………. Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene ở quy mô pilot từ S. Ảnh hưởng của các tác nhân lên hiệu quả tách chiết squalene từ sinh khối khô S. Tách chiết squalene từ dịch tế bào chủng S. mangrovei PQ6 sau quá trình nuôi cấy lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất ………… 97 3. Điều kiện tinh chế squalene bằng phương pháp sắc ký cột……. Xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch nguyên liệu squalene từ sinh khối tảo S. Tách chiết và tinh chế lượng lớn squalene từ S. Phân tích các chỉ tiêu về cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim loại của squalene tách chiết từ S. Tính an toàn và tác dụng dƣợc lý của squalene tách chiết từ vii S. mangrovei PQ6 trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro)……………………………… 107 3. Độc tính cấp của squalene trên mô hình Ďộng vật thực nghiệm…………………………………………………………. Độc tính bán trường diễn của squalene trên mô hình Ďộng vật thực nghiệm……………………………………………………. Ảnh hưởng của squalene lên tình trạng chung và sự thay đổi thể trọng của chuột cống trắng khi dùng dài ngày……………………. Ảnh hưởng của squalene đối với một số chỉ tiêu huyết học và sinh hóa của chuột……………………………………………………. Đánh giá mức độ tổn thương chức năng gan, thận chuột khi dùng squalene dài ngày………………………………………………. Tác dụng dược lý của squalene trên chuột nhắt trắng thí nghiệm…………………………………………………………. Bƣớc đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro……………………………………………………………. Đánh giá Ďộc tính của squalene trên các dòng tế bào…………… 117 3. Tác dụng giảm lipit của squalene lên tế bào gan và tế bào Ďại thụ thể…………………………………………………………… 118 3. Tối ưu hóa thời gian và nồng độ ủ squalene lên sự thay đổi hàm lượng lipid trong tế bào gan HepG2………………………………. Tác dụng của squalene lên sự thay đổi hàm lượng lipid nội bào trong tế bào gan HepG2 và RAW264.