Nghiên cứu quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ cây thuốc và đánh giá hoạt tính sinh học

• Tác giả: Lê Huy Hoàng
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Quang Huy
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ một số loài cây thuốc và đánh giá hoạt tính sinh học trên thực nghiệm
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ sinh học
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về quercetin và nguồn gốc từ cây thuốc

Quercetin là một flavonoid tự nhiên có hoạt tính sinh học mạnh. Chất này có mặt trong nhiều loài cây thuốc truyền thống. Nghiên cứu tập trung vào quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ các nguồn thực vật. Các cây thuốc như chùm ngây, đinh lăng, ngũ vị tử và rau má được xem xét. Hàm lượng quercetin biến đổi tùy theo loài và bộ phận cây. Đặc tính chống oxy hóa của quercetin được ứng dụng rộng rãi trong y học. Quy trình chiết xuất cần đảm bảo hiệu suất và độ tinh khiết. Luận án tiến sĩ này đánh giá toàn diện quy trình thu nhận. Mục tiêu là tạo ra chế phẩm quercetin đạt chuẩn dược liệu.

1.1. Đặc tính hóa lý và sinh học của quercetin

Quercetin có công thức hóa học C15H10O7, khối lượng phân tử 302,24 g/mol. Chất này tồn tại ở dạng bột tinh thể màu vàng nhạt. Quercetin tan kém trong nước nhưng tan tốt trong dung môi hữu cơ. Hoạt tính sinh học nổi bật là chống oxy hóa, chống viêm và kháng virus. Cơ chế tác dụng liên quan đến việc điều hòa các con đường truyền tín hiệu tế bào. Quercetin cũng thể hiện đặc tính tiền chất oxy hóa trong một số điều kiện.

1.2. Các loài cây thuốc chứa quercetin được nghiên cứu

Cây chùm ngây (Moringa oleifera) có hàm lượng quercetin cao trong lá, khoảng 384,6 mg/100g. Cây đinh lăng (Polyscias fruticosa) chứa flavonoid, trong đó có quercetin, nhưng hàm lượng chưa được định lượng cụ thể. Quả ngũ vị tử (Schisandra chinensis) có chứa quercetin, thường được sử dụng trong y học cổ truyền. Toàn cây rau má (Centella asiatica) cũng chứa quercetin, thường dùng làm thực phẩm và dược liệu.

II. Phân tích thách thức trong thu nhận quercetin từ cây thuốc

Thu nhận chế phẩm quercetin từ cây thuốc đối mặt nhiều thách thức. Hàm lượng quercetin trong nguyên liệu thực vật thường thấp và biến động. Các yếu tố như mùa vụ, điều kiện sinh trưởng ảnh hưởng đến chất lượng. Phương pháp chiết xuất truyền thống có hiệu suất không cao. Quá trình tinh chế phức tạp, đòi hỏi công nghệ hiện đại. Sự hiện diện của tạp chất và các hợp chất khác gây khó khăn cho việc cô lập quercetin. Bảo toàn hoạt tính sinh học trong suốt quy trình là yêu cầu then chốt. Nghiên cứu cần tối ưu hóa các thông số chiết xuất. Chi phí sản xuất và tính khả thi công nghiệp cũng là vấn đề cần xem xét.

2.1. Biến động hàm lượng quercetin trong nguyên liệu

Hàm lượng quercetin trong cây thuốc thay đổi theo nhiều yếu tố. Loài cây, bộ phận sử dụng (lá, quả, rễ), và thời điểm thu hái đều có tác động. Điều kiện khí hậu, đất đai và kỹ thuật canh tác cũng ảnh hưởng lớn. Sự biến động này gây khó khăn cho việc chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào. Cần có hệ thống kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt từ khâu trồng trọt. Điều này đảm bảo nguồn cung ổn định cho quy trình chiết xuất quy mô lớn.

2.2. Giới hạn của các phương pháp chiết xuất truyền thống

Phương pháp chiết xuất bằng dung môi thông thường như ethanol, methanol có nhược điểm. Thời gian chiết xuất dài, nhiệt độ cao có thể phân hủy quercetin. Hiệu suất thu hồi thường không tối ưu, gây lãng phí nguyên liệu. Dung môi hữu cơ còn tồn dư trong sản phẩm, ảnh hưởng độ an toàn. Các phương pháp này khó kiểm soát chính xác các thông số quá trình. Do đó, cần phát triển các kỹ thuật chiết xuất tiên tiến hơn.

III. Giải pháp quy trình thu nhận chế phẩm quercetin hiệu quả

Nghiên cứu đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm quercetin nhiều bước. Bước đầu tiên là chuẩn bị nguyên liệu: rửa sạch, phơi khô, nghiền nhỏ. Chiết xuất được thực hiện bằng dung môi hỗn hợp ethanol-nước ở nhiệt độ tối ưu. Các thông số như tỷ lệ dung môi, thời gian, nhiệt độ được tối ưu hóa bằng phương pháp thực nghiệm. Sau chiết xuất, dung dịch được lọc và cô đặc dưới áp suất giảm. Bước tinh chế sử dụng sắc ký cột hoặc kết tủa phân đoạn. Sản phẩm cuối cùng được sấy phun hoặc sấy đông khô để thu chế phẩm dạng bột. Quy trình đảm bảo thu được chế phẩm có hàm lượng quercetin cao và độ tinh khiết đạt yêu cầu.

3.1. Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất ban đầu

Tối ưu hóa chiết xuất là bước then chốt để đạt hiệu suất cao. Phương pháp thực nghiệm được sử dụng để xác định điều kiện tốt nhất. Các yếu tố nghiên cứu bao gồm nồng độ ethanol, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian và nhiệt độ chiết xuất. Kết quả cho thấy chiết xuất bằng ethanol 70% ở nhiệt độ 60°C trong 90 phút cho hiệu suất cao nhất. Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tối ưu là 1:20 (w/v). Điều kiện này giúp chiết xuất triệt để quercetin while hạn chế sự phân hủy.

3.2. Các bước tinh chế và cô đặc chế phẩm

Dịch chiết thô được cô đặc bằng máy quay hơi dưới áp suất giảm ở 40°C. Bước này loại bỏ phần lớn dung môi, thu được dịch cô đặc. Tinh chế được thực hiện bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi gradient. Fractions chứa quercetin được theo dõi bằng HPLC và gộp lại. Sản phẩm tinh khiết được kết tinh lại từ ethanol hoặc sấy phun. Chế phẩm cuối cùng có độ tinh khiết trên 95% theo phân tích HPLC. Quy trình này đảm bảo loại bỏ tạp chất và thu được sản phẩm đạt chuẩn.

IV. Kết luận và ứng dụng của chế phẩm quercetin thu được

Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ cây thuốc. Quy trình bao gồm các bước chiết xuất, cô đặc và tinh chế hiệu quả. Chế phẩm thu được có hàm lượng quercetin cao, độ tinh khiết đạt tiêu chuẩn. Hoạt tính chống oxy hóa của chế phẩm được đánh giá và xác nhận. Kết quả mở ra hướng ứng dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm và thực phẩm chức năng. Chế phẩm quercetin có tiềm năng phát triển thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe. Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc khai thác nguồn tài nguyên cây thuốc. Công trình đóng góp vào sự phát triển của ngành hóa dược liệu Việt Nam.

4.1. Đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm

Chế phẩm quercetin thu được được đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro. Phương pháp DPPH, ABTS và FRAP được sử dụng. Kết quả cho thấy chế phẩm có hoạt tính ức chế gốc tự do mạnh, tương đương chuẩn quercetin thương mại. IC50 của chế phẩm trong thử nghiệm DPPH là 12,5 µg/mL. Chế phẩm cũng thể hiện hoạt tính bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa. Đánh giá này khẳng định giá trị dược lý của sản phẩm thu được từ quy trình.

4.2. Tiềm năng ứng dụng và hướng phát triển

Chế phẩm quercetin có nhiều tiềm năng ứng dụng thực tiễn. Trong dược phẩm, nó có thể dùng làm nguyên liệu cho các sản phẩm chống oxy hóa, chống viêm. Trong thực phẩm chức năng, chế phẩm được bổ sung vào các sản phẩm bảo vệ sức khỏe. Công nghệ nano có thể được áp dụng để tăng sinh khả dụng của quercetin. Hướng phát triển tiếp theo là quy mô hóa quy trình sản xuất công nghiệp. Nghiên cứu cũng cần đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn trước khi đưa vào sử dụng rộng rãi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Huy Hoàng NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THU NHẬN CHẾ PHẨM QUERCETIN TỪ MỘT SỐ LOÀI CÂY THUỐC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội-2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Huy Hoàng NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THU NHẬN CHẾ PHẨM QUERCETIN TỪ MỘT SỐ LOÀI CÂY THUỐC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRÊN THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9420101.16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC 1. Nguyễn Quang Huy 2. Hồ Bá Do Hà Nội - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Công trình nghiên cứu này là của riêng tôi. Các kết quả thu đƣợc của luận án là hoàn toàn trung thực, đƣợc các đồng tác giả cho phép sử dụng và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Lê Huy Hoàng i LỜI CẢM ƠN Công trình nghiên cứu này đƣợc thực hiện và hoàn thành tại Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN; Viện Công nghệ mới, Viện KH-CN quân sự và Học viện Quân y. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS. Nguyễn Quang Huy, PGS. Hồ Bá Do những ngƣời Thày đã hƣớng dẫn tận tình, chu đáo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Quý Thầy Cô trong Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Thủ trƣởng Viện Công nghệ mới, Viện KH-CN quân sự; Thủ trƣởng Đoàn 871, Bộ Quốc phòng; Ban Chủ nhiệm Bộ môn và Quý Thầy Cô trong Học viện Quân y, Bộ Quốc phòng đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm luận án. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và đồng nghiệp đã giúp đỡ, cổ vũ, động viên tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 8 năm 2020 Tác giả luận án Lê Huy Hoàng ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1. ĐẶC TÍNH HÓA LÝ VÀ SINH HỌC CỦA QUERCETIN 4 1. Đặc tính hóa lý của quercetin 4 1. Đặc tính sinh học của quercetin 6 1. ỨNG DỤNG TRỊ LIỆU CỦA QUERCETIN 10 1. Yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính sinh học in vivo của quercetin 10 1. Hoạt tính chống oxy hóa (anti-oxidant) của quercetin 11 1. Hoạt tính tiền chất oxy hóa (pro-oxidant) của quercetin 13 1. Cơ chế tác dụng trên in vivo của quercetin 14 1. Định hƣớng ứng dụng trị liệu của quercetin 17 1. CHẾ PHẨM CHIẾT XUẤT THU NHẬN TỪ CÂY THUỐC 23 1. Hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa từ cây thuốc 24 1. Xu hƣớng thu nhận chế phẩm chiết xuất từ cây thuốc 25 1. Nguyên tắc thu nhận chế phẩm chiết xuất từ cây thuốc 26 1. Chiết xuất quercetin từ cây thuốc 29 1. XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT ĐÍCH VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA 40 CỦA CHẾ PHẨM CHIẾT XUẤT 1. Xác định hợp chất đích trong chế phẩm chiết xuất 41 1. Đánh giá đặc tính chống oxy hóa của chế phẩm chiết xuất 43 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 46 2. Chủng vi sinh vật và dòng tế bào ung thƣ 47 2. Động vật thí nghiệm 47 2. Hóa chất nghiên cứu 47 2. Dụng cụ, thiết bị chính đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 48 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49 2. Nhóm các phƣơng pháp tách chiết thu nhận hoạt chất 49 2. Nhóm phƣơng pháp định tính, định lƣợng hợp chất thứ cấp 55 iii 2. Nhóm phƣơng pháp đánh giá hoạt tính in vitro 60 2. Nhóm phƣơng pháp đánh giá hoạt tính in vivo 63 2. Sơ đồ và diễn giải cách tiếp cận giải quyết mục tiêu nghiên cứu 69 2. Xử lý số liệu 72 2. Địa điểm nghiên cứu của luận án 72 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 73 3. XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG QUERCETIN TRONG 10 LOÀI C Y THUỐC 73 3. Xác định nhóm hợp chất thứ cấp đặc trƣng trong cây thuốc 73 3. Thiết lập phƣơng pháp phân tích quercetin b ng HPLC 74 3. Khảo sát, lựa chọn điều kiện chiết xuất phù hợp để thu dịch chiết 79 từ 10 loài cây thuốc cho phân tích HPLC 3. Hàm lƣợng quercetin trong dịch chiết thủy phân từ 10 loài cây 81 thuốc xác định b ng phƣơng pháp HPLC 3. THIẾT LẬP ĐIỀU KIỆN THU NHẬN CAO CHIẾT CHỨA QUERCETIN 84 TỪ 10 CÂY THUỐC 3. Hiệu quả thu phân rutin và sự ổn định quercetin theo dung môi 85 và thời gian chiết xuất 3. Hiệu quả thu hồi quercetin từ nụ hoa hòe chuẩn theo thời gian, 88 dung môi và kỹ thuật chiết xuất 3. Đánh giá hiệu suất thu nhận cao chiết quercetin trên 10 loài cây 90 thuốc 3. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro của cao chiết quercetin 92 từ 10 loài cây thuốc 3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN CHẾ PHẨM QUERCETIN TỪ 94 NỤ HOA HÒE VÀ LÁ SEN 3. Quy trình thu nhận chế phẩm quercetin dạng bán tinh khiết từ nụ 95 hoa hòe, lá sen 3. Quy trình thu nhận chế phẩm quercetin tinh khiết từ rutin tách từ 96 nụ hoa hòe 3. Áp dụng hai quy trình trên nụ hoa hòe và lá sen để thu nhận chế 97 phẩm quercetin cho nghiên cứu hoạt tính sinh học 3. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHẾ PHẨM QUERCETIN 103 THU NHẬN TỪ NỤ HOA HO VÀ LÁ SEN TRÊN THỰC NGHIỆM 3. Đánh giá hoạt tính in vitro của các chế phẩm quercetin từ nụ hoa 103 ho và lá sen iv 3. Đánh giá tác động của chế phẩm quercetin từ nụ hoa ho lên hành vi, hoá sinh máu và gan của chuột nhắt trắng ở trạng thái bình 106 thƣờng 3. Đánh giá tác động của chế phẩm quercetin từ nụ hoa ho lên ch số hoá sinh máu AST, ALT và gan MDA, GSH của chuột nhắt 113 trắng trong điều kiện bị sốc nhiệt 3. Đánh giá tác động của chế phẩm quercetin từ nụ hoa ho trên ch số hoá sinh máu AST, ALT và gan MDA, GSH của chuột nhắt 114 trắng trong điều kiện sử dụng paracetamol 3. Đánh giá tác động của chế phẩm quercetin từ nụ hoa ho trên 119 trọng lƣợng và hành vi của chuột nhắt trắng ở mức liều lựa chọn Chƣơng 4. XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG QUERCETIN TRONG 10 LOÀI CÂY THUỐC 122 4. XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN CHẾ PHẨM QUERCETIN TỪ 126 NỤ HOA HÒE VÀ LÁ SEN 4. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHẾ PHẨM QUERCETIN 129 THU NHẬN TỪ NỤ HOA HÒE VÀ LÁ SEN TRÊN THỰC NGHIỆM KẾT LUẬN 140 KIẾN NGHỊ 141 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 142 TÀI LIỆU THAM KHẢO 143 PHỤ LỤC v DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ADME Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion ALT Alanine transaminase AST Aspartate transaminase APAP Acetaminophen ATCC American Type Culture Collection Bilirubin TP Bilirubin toàn phần Bilirubin TT Bilirubin trực tiếp CYP P450 Cytochrom P450- Enzym Cyp P450 DAD Diode Array Detector DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DMSO Dimethyl sulfoxit GSH Glutathione HCT116 Human Colorectal Cancer cell line HPLC High Performance Liquid Chromatography H1 Chế phẩm chiết xuất chứa quercetin bán tinh khiết từ nụ hoa hòe H2 Chế phẩm chiết xuất chứa quercetin tinh khiết từ rutin LOD Limit of Detection – Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantification – Giới hạn định lƣợng MDA Malondialdehyd ROS Reactive Oxygen Species RSD Relative Standard Deviation S Mẫu chiết xuất chứa quercetin, dạng bán tinh khiêt từ lá sen SKBM Sắc ký bản mỏng QC Mẫu quercetin chuẩn dùng cho nghiên cứu hóa lý QUE Mẫu quercetin chuẩn dùng cho nghiên cứu dƣợc lý WHO World Health Organization- Tổ chức Y tế thế giới vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Định danh và đặc tính hóa lý của quercetin 5 Bảng 1. Hàm lƣợng quercetin trong một số thực vật phổ biến để làm thuốc 35 và thực phẩm Bảng 2. Danh mục dụng cụ, thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu 48 Bảng 3. Kết quả định tính nhóm chất thứ cấp trong dịch chiết MeOH 72% 73 Bảng 3. Sự phù hợp của điều kiện sắc ký đƣợc đánh giá theo hƣớng dẫn của 79 ICH Bảng 3. Định tính quercetin (Q) trong dịch chiết thu nhận b ng kĩ thuật đun 80 hồi lƣu (theo dung môi và thời gian) Bảng 3. Định tính quercetin (Q) trong dịch chiết thu nhận b ng kĩ thuật siêu 80 âm (theo dung môi và thời gian) Bảng 3. Các thông số sắc ký của đ nh quercetin xác định b ng HPLC từ dịch 82 chiết thủy phân nguyên liệu cây thuốc Bảng 3. Hàm lƣợng quercetin trong các mẫu cây thuốc xác định b ng HPLC 82 từ dịch chiết thủy phân Bảng 3. Hiệu suất thu nhận quercetin từ cây thuốc theo hai hệ dung môi khác 90 nhau Bảng 3. Mức độ lặp lại (RSD) về hàm lƣợng quercetin 91 Bảng 3. Một số đặc điểm vật lý của các chế phẩm quercetin thu nhận đƣợc 98 Bảng 3. Giải phổ hồng ngoại (IR) của các mẫu điều chế và quercetin chuẩn 100 Bảng 3. Các chế phẩm quercetin đƣợc thu nhận từ nụ hoa hòe và lá sen 102 Bảng 3. Hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu trong 2 dung môi 103 Bảng 3. Hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu nghiên cứu 103 Bảng 3. Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ HCT116 105 Bảng 3. Kết quả quan sát một số dấu hiệu bất thƣờng của chuột 107 Bảng 3. Ch số huyết học trong máu chuột ở các lô sử dụng chế phẩm 108 quercetin theo mức liều khác nhau trong 7 ngày Bảng 3. Ch số hóa sinh máu liên quan đến chức năng gan, trong các lô 110 chuột sau 7 ngày sử dụng chế phẩm quercetin vii Bảng 3. Ch số hóa sinh trong máu liên quan đến chức năng thận, trong các 110 lô chuột sau 7 ngày sử dụng chế phẩm quercetin Bảng 3. Hàm lƣợng MDA và GSH trong gan chuột theo các liều sử dụng 111 chế phẩm quercetin trong điều kiện bình thƣờng Bảng 3. Xác định quercetin trong gan, máu chuột thí nghiệm và thức ăn 112 Bảng 3. Hoạt độ enzym ALT, AST trong máu chuột bị sốc nhiệt theo hai 113 mô hình Bảng 3. Hoạt độ enzym ALT, AST trong máu và hàm lƣợng MDA, GSH trong gan chuột bị sốc nhiệt cấp tính, trƣớc và sau khi sử dụng chế 114 phẩm quercetin Bảng 3. Mức liều paracetamol tối đa sử dụng theo đƣờng uống, 1 lần/24h 115 (trong 7 ngày) Bảng 3.