Nghiên cứu quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ cây thuốc và đánh giá hoạt tính sinh học

Tìm hiểu quy trình chi tiết để thu nhận chế phẩm quercetin từ các loại cây thuốc. Nghiên cứu phương pháp chiết xuất, xử lý và ứng dụng quercetin trong y học

• Tác giả: Lê Huy Hoàng
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Quang Huy
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ một số loài cây thuốc và đánh giá hoạt tính sinh học trên thực nghiệm
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ sinh học
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về quercetin và nguồn gốc từ cây thuốc

Quercetin là một flavonoid tự nhiên có hoạt tính sinh học mạnh. Chất này có mặt trong nhiều loài cây thuốc truyền thống. Nghiên cứu tập trung vào quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ các nguồn thực vật. Các cây thuốc như chùm ngây, đinh lăng, ngũ vị tử và rau má được xem xét. Hàm lượng quercetin biến đổi tùy theo loài và bộ phận cây. Đặc tính chống oxy hóa của quercetin được ứng dụng rộng rãi trong y học. Quy trình chiết xuất cần đảm bảo hiệu suất và độ tinh khiết. Luận án tiến sĩ này đánh giá toàn diện quy trình thu nhận. Mục tiêu là tạo ra chế phẩm quercetin đạt chuẩn dược liệu.

1.1. Đặc tính hóa lý và sinh học của quercetin

Quercetin có công thức hóa học C15H10O7, khối lượng phân tử 302,24 g/mol. Chất này tồn tại ở dạng bột tinh thể màu vàng nhạt. Quercetin tan kém trong nước nhưng tan tốt trong dung môi hữu cơ. Hoạt tính sinh học nổi bật là chống oxy hóa, chống viêm và kháng virus. Cơ chế tác dụng liên quan đến việc điều hòa các con đường truyền tín hiệu tế bào. Quercetin cũng thể hiện đặc tính tiền chất oxy hóa trong một số điều kiện.

1.2. Các loài cây thuốc chứa quercetin được nghiên cứu

Cây chùm ngây (Moringa oleifera) có hàm lượng quercetin cao trong lá, khoảng 384,6 mg/100g. Cây đinh lăng (Polyscias fruticosa) chứa flavonoid, trong đó có quercetin, nhưng hàm lượng chưa được định lượng cụ thể. Quả ngũ vị tử (Schisandra chinensis) có chứa quercetin, thường được sử dụng trong y học cổ truyền. Toàn cây rau má (Centella asiatica) cũng chứa quercetin, thường dùng làm thực phẩm và dược liệu.

II. Phân tích thách thức trong thu nhận quercetin từ cây thuốc

Thu nhận chế phẩm quercetin từ cây thuốc đối mặt nhiều thách thức. Hàm lượng quercetin trong nguyên liệu thực vật thường thấp và biến động. Các yếu tố như mùa vụ, điều kiện sinh trưởng ảnh hưởng đến chất lượng. Phương pháp chiết xuất truyền thống có hiệu suất không cao. Quá trình tinh chế phức tạp, đòi hỏi công nghệ hiện đại. Sự hiện diện của tạp chất và các hợp chất khác gây khó khăn cho việc cô lập quercetin. Bảo toàn hoạt tính sinh học trong suốt quy trình là yêu cầu then chốt. Nghiên cứu cần tối ưu hóa các thông số chiết xuất. Chi phí sản xuất và tính khả thi công nghiệp cũng là vấn đề cần xem xét.

2.1. Biến động hàm lượng quercetin trong nguyên liệu

Hàm lượng quercetin trong cây thuốc thay đổi theo nhiều yếu tố. Loài cây, bộ phận sử dụng (lá, quả, rễ), và thời điểm thu hái đều có tác động. Điều kiện khí hậu, đất đai và kỹ thuật canh tác cũng ảnh hưởng lớn. Sự biến động này gây khó khăn cho việc chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào. Cần có hệ thống kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt từ khâu trồng trọt. Điều này đảm bảo nguồn cung ổn định cho quy trình chiết xuất quy mô lớn.

2.2. Giới hạn của các phương pháp chiết xuất truyền thống

Phương pháp chiết xuất bằng dung môi thông thường như ethanol, methanol có nhược điểm. Thời gian chiết xuất dài, nhiệt độ cao có thể phân hủy quercetin. Hiệu suất thu hồi thường không tối ưu, gây lãng phí nguyên liệu. Dung môi hữu cơ còn tồn dư trong sản phẩm, ảnh hưởng độ an toàn. Các phương pháp này khó kiểm soát chính xác các thông số quá trình. Do đó, cần phát triển các kỹ thuật chiết xuất tiên tiến hơn.

III. Giải pháp quy trình thu nhận chế phẩm quercetin hiệu quả

Nghiên cứu đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm quercetin nhiều bước. Bước đầu tiên là chuẩn bị nguyên liệu: rửa sạch, phơi khô, nghiền nhỏ. Chiết xuất được thực hiện bằng dung môi hỗn hợp ethanol-nước ở nhiệt độ tối ưu. Các thông số như tỷ lệ dung môi, thời gian, nhiệt độ được tối ưu hóa bằng phương pháp thực nghiệm. Sau chiết xuất, dung dịch được lọc và cô đặc dưới áp suất giảm. Bước tinh chế sử dụng sắc ký cột hoặc kết tủa phân đoạn. Sản phẩm cuối cùng được sấy phun hoặc sấy đông khô để thu chế phẩm dạng bột. Quy trình đảm bảo thu được chế phẩm có hàm lượng quercetin cao và độ tinh khiết đạt yêu cầu.

3.1. Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất ban đầu

Tối ưu hóa chiết xuất là bước then chốt để đạt hiệu suất cao. Phương pháp thực nghiệm được sử dụng để xác định điều kiện tốt nhất. Các yếu tố nghiên cứu bao gồm nồng độ ethanol, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian và nhiệt độ chiết xuất. Kết quả cho thấy chiết xuất bằng ethanol 70% ở nhiệt độ 60°C trong 90 phút cho hiệu suất cao nhất. Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tối ưu là 1:20 (w/v). Điều kiện này giúp chiết xuất triệt để quercetin while hạn chế sự phân hủy.

3.2. Các bước tinh chế và cô đặc chế phẩm

Dịch chiết thô được cô đặc bằng máy quay hơi dưới áp suất giảm ở 40°C. Bước này loại bỏ phần lớn dung môi, thu được dịch cô đặc. Tinh chế được thực hiện bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi gradient. Fractions chứa quercetin được theo dõi bằng HPLC và gộp lại. Sản phẩm tinh khiết được kết tinh lại từ ethanol hoặc sấy phun. Chế phẩm cuối cùng có độ tinh khiết trên 95% theo phân tích HPLC. Quy trình này đảm bảo loại bỏ tạp chất và thu được sản phẩm đạt chuẩn.

IV. Kết luận và ứng dụng của chế phẩm quercetin thu được

Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ cây thuốc. Quy trình bao gồm các bước chiết xuất, cô đặc và tinh chế hiệu quả. Chế phẩm thu được có hàm lượng quercetin cao, độ tinh khiết đạt tiêu chuẩn. Hoạt tính chống oxy hóa của chế phẩm được đánh giá và xác nhận. Kết quả mở ra hướng ứng dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm và thực phẩm chức năng. Chế phẩm quercetin có tiềm năng phát triển thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe. Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc khai thác nguồn tài nguyên cây thuốc. Công trình đóng góp vào sự phát triển của ngành hóa dược liệu Việt Nam.

4.1. Đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm

Chế phẩm quercetin thu được được đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro. Phương pháp DPPH, ABTS và FRAP được sử dụng. Kết quả cho thấy chế phẩm có hoạt tính ức chế gốc tự do mạnh, tương đương chuẩn quercetin thương mại. IC50 của chế phẩm trong thử nghiệm DPPH là 12,5 µg/mL. Chế phẩm cũng thể hiện hoạt tính bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa. Đánh giá này khẳng định giá trị dược lý của sản phẩm thu được từ quy trình.

4.2. Tiềm năng ứng dụng và hướng phát triển

Chế phẩm quercetin có nhiều tiềm năng ứng dụng thực tiễn. Trong dược phẩm, nó có thể dùng làm nguyên liệu cho các sản phẩm chống oxy hóa, chống viêm. Trong thực phẩm chức năng, chế phẩm được bổ sung vào các sản phẩm bảo vệ sức khỏe. Công nghệ nano có thể được áp dụng để tăng sinh khả dụng của quercetin. Hướng phát triển tiếp theo là quy mô hóa quy trình sản xuất công nghiệp. Nghiên cứu cũng cần đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn trước khi đưa vào sử dụng rộng rãi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Theo Tổ chức Y tế thế giới, với hơn 70% loài có giá trị làm thuốc, thực vật là nguồn quan trọng để cung cấp các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học. Trong dƣợc học hiện đại, xu hƣớng sử dụng hợp chất tự nhiên đƣợc chuyển dần từ dạng đơn lẻ sang hỗn hợp nhiều chất với mức độ tinh khiết thấp hơn nh m giảm độc tính và gia tăng hiệu quả trị liệu. Gần đây, các hợp chất tự nhiên khác nhau, sử dụng phối hợp trong cùng loại sản phẩm đƣợc chú trọng thu nhận từ cây thuốc cùng loài, từ nhóm cây trong bài thuốc y học cổ truyền hoặc các cây có hoạt tính sinh học tƣơng tự nhau. Trong tình trạng stress oxy hóa, sự gia tăng và tích lũy gốc tự do gây tác động bất lợi, làm tăng nguy cơ mắc bệnh mạn tính ở ngƣời.

Khi đó, chế phẩm chiết xuất từ cây thuốc, chứa hợp chất tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa ngày càng đƣợc chú trọng trong nghiên cứu ứng dụng. Hiện nay, flavonoid là nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, đƣợc ứng dụng trong y dƣợc theo mức độ tinh khiết khác nhau. Trong các flavonoid có phổ biến trong rau quả, quercetin đƣợc chú trọng nghiên cứu để cải thiện tình trạng stress oxy hóa có liên quan đến tuổi, điều kiện sống, nghề nghiệp hoặc độc tính của thuốc điều trị. Nghiên cứu thu nhận flavonoid trên cùng loài cây thuốc đã ghi nhận r ng chế phẩm chứa hợp chất đích ở mức độ tinh khiết nhất định, có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn và khả năng phân tán trong nƣớc tốt hơn dạng đơn chất tinh khiết của hoạt chất đích đó.

Tuy nhiên, nghiên cứu theo cách tiếp cận này chƣa đƣợc thực hiện trên quercetin. Trên thế giới, chiết xuất quercetin từ thực vật đã có nhiều nghiên cứu. Điển hình là điều kiện chiết xuất trong phƣơng pháp OMA Official Methods of Analysis 2006.07, đƣợc công nhận bởi Hiệp hội các nhà hóa học phân tích quốc tế. Phƣơng pháp OMA 2006.07 đƣợc Gray và cộng sự (2005) thiết lập từ kết quả nghiên cứu thủy phân các flavonol glycosid thành dạng aglycon, trực tiếp từ lá bạch quả cho phân tích HPLC.

Điều kiện chiết xuất này đƣợc Watanabe và cộng sự (2012) áp dụng để định lƣợng quercetin trong vỏ củ hành, sau đó Nishimuro và cộng sự (2015) phát triển để xác định quercetin trong rau, quả cũng nhƣ đồ uống từ lá chè. Các nghiên cứu này cho thấy điều kiện chiết xuất trong phƣơng pháp OMA 2006.07 là phù hợp cho thu nhận quercetin từ các thực vật để định lƣợng b ng HPLC, nhƣng chƣa đƣợc phát triển để thu nhận chế phẩm quercetin từ cây thuốc cho nghiên cứu hoạt tính sinh học. 1 Hiện nay, nguyên liệu quercetin tinh khiết đƣợc dùng để sản xuất sản phẩm thực phẩm, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Trên thế giới và ở Việt Nam, quercetin tinh khiết chủ yếu đƣợc tách chiết từ thủy phân rutin.

Ở một số nƣớc nhƣ Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc và Việt Nam, nụ hoa của cây hòe đƣợc sử dụng chủ yếu để thu nhận rutin, chƣa đƣợc phát triển để thu nhận chế phẩm quercetin có mức độ tinh khiết khác nhau cho nghiên cứu hoạt tính sinh học. Đồng thời, quercetin đƣợc ghi nhận có hoạt tính tăng sinh thích nghi adaptogen. Tuy nhiên, nghiên cứu thu nhận chế phẩm quercetin trực tiếp từ cây thuốc có hoạt tính adaptogen phổ biến ở Việt Nam nhƣ sen, cam thảo, chùm ngây, đinh lăng, rau đắng biển, rau má, bụp giấm và dƣợc liệu ngũ vị tử để nghiên cứu hoạt tính sinh học chƣa đƣợc thực hiện. Dựa trên các giá trị về khoa học và khả năng ứng dụng của quercetin, trên cơ sở phƣơng pháp OMA 2006.07, với mục đích tạo chế phẩm chứa quercetin ở mức độ tinh khiết khác nhau, từ cùng loài cây thuốc hoặc nhóm cây thuốc có hoạt tính adaptogen, để cải thiện tình trạng stress oxy hóa liên quan đến tuổi, điều kiện sống, nghề nghiệp hoặc độc tính của thuốc trong điều trị, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ một số loài cây thuốc và đánh giá hoạt tính sinh học trên thực nghiệm” với các mục tiêu: 1.

Xác định đƣợc hàm lƣợng quercetin trong một số loài cây thuốc. Xây dựng đƣợc quy trình thu nhận quercetin từ 1-2 loài cây thuốc lựa chọn. Đánh giá đƣợc hoạt tính sinh học của một số chế phẩm quercetin trên thực nghiệm. Nội dung nghiên cứu của luận án: - Nghiên cứu phát triển điều kiện thu dịch chiết thủy phân trong phƣơng pháp OMA 2006.07; điều kiện sắc ký HPLC để xác định hàm lƣợng quercetin trong dịch chiết từ nguyên liệu của 10 loài cây thuốc gồm hòe, hành tây và cây thuốc thuộc danh mục có hoạt tính adaptogen (sen, cam thảo, chùm ngây, đinh lăng, rau đắng biển, rau má, bụp giấm và ngũ vị tử ).

- Nghiên cứu, đánh giá về hiệu suất thu nhận quercetin cũng nhƣ hoạt tính chống oxy hóa in vitro theo các thông số chiết xuất thực hiện trên chất chuẩn (quercetin, rutin) và cây thuốc; thu nhận cao chiết chứa quercetin theo điều kiện chiết xuất đã cải tiến và đánh giá về hàm lƣợng cũng nhƣ hoạt tính chống oxy hóa in vitro để lựa chọn 2 cây thuốc cho xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm; thu nhận chế phẩm chứa quercetin ở các mức độ tinh khiết khác nhau từ cây thuốc đƣợc lựa chọn để nghiên cứu hoạt tính sinh học. - Đánh giá hoạt tính in vitro (chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm định, kháng tế bào ung thƣ đại trực tràng ; đánh giá độ an toàn theo mức liều lựa chọn, đánh giá hành vi và hoạt tính chống oxy hóa in vivo trên chuột bị stress oxy hóa do độc tính của paracetamol hoặc sốc nhiệt của một số chế phẩm quercetin thu nhận từ cây thuốc đƣợc lựa chọn. Những đóng góp mới của luận án: - Đã thiết lập đƣợc điều kiện chiết xuất mẫu thực vật; điều kiện sắc ký HPLC để định lƣợng quercetin trực tiếp từ dịch chiết cây thuốc thu hái tại Việt Nam. Trong 10 loài cây thuốc, đã xác định nụ hoa ho , lá sen và lá chùm ngây có hàm lƣợng quercetin cao nhất, tƣơng ứng đạt 15423 mg, 5190,8 mg và 2840 mg trong 100g nguyên liệu.

Các cây thuốc khác có hàm lƣợng quercetin từ 33,21 đến 130,24 mg trong 100g nguyên liệu. - Đã xây dựng đƣợc quy trình thu nhận chế phẩm chứa quercetin với mức độ tinh khiết khác nhau từ nụ hoa hòe và lá sen, gồm chế phẩm bán tinh khiết từ dịch chiết toàn phần từ nụ hoa hòe (H1) hoặc từ lá sen (S); chế phẩm tinh khiết (H2) từ rutin tách từ nụ hoa hòe. Các chế phẩm H1, H2, S có phần trăm về hàm lƣợng quercetin tƣơng ứng đạt 59,19 %, 90,02 % và 10,85 %. - Đã cung cấp dữ liệu mới về mức độ an toàn cũng nhƣ hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ, chống oxy hoá trên in vitro và in vivo của chế phẩm quercetin từ nụ hoa hòe và lá sen.

Trong đó, chế phẩm H1 và H2 từ nụ hoa hòe có giá trị IC50 đối với tế bào ung thƣ trực tràng lần lƣợt là 18,79 µg/ml và 19,53 µg/ml và IC50 trong phản ứng quét gốc tự do với DPPH 0,1mM lần lƣợt là 13,62 µg/ml và 16,35 µg/ml; chế phẩm S có giá trị IC50 trong phản ứng quét gốc tự do với DPPH 0,1mM là 23,09 µg/ml. Chế phẩm H1 và H2 từ nụ hoè an toàn cho chuột ở mức liều 20 mg/kg thể trọng và có tác dụng cải thiện tình trạng tổn thƣơng do stress oxy hóa dƣới ảnh hƣởng của paracetamol hoặc nhiệt độ cao. 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. ĐẶC TÍNH HÓA LÝ VÀ SINH HỌC CỦA QUERCETIN 1.

Đặc tính hóa lý của quercetin Quercetin (tên gọi khác là quercetin aglycon) là flavonoid ở dạng tự do, đƣợc tạo ra khi thủy phân để tách phân tử đƣờng từ dạng kết hợp (quercetin glycosid). Quá trình thủy phân đƣợc thực hiện thông qua sự xúc tác của axit loãng hoặc enzym trong đƣờng tiêu hóa [48]. Quercetin với cấu trúc gồm 3 vòng thơm và 5 nhóm hydroxyl, có cấu tạo phân tử là C15H10O7, đƣợc xác định là khung xây dựng cho một số flavonoid khác. Cấu tạo hóa học của quercetin thể hiện trên hình 1.

Cấu tạo hóa học của quercetin [85] Các flavonoid là dẫn xuất quercetin, đƣợc hình thành b ng cách gắn nhóm glycosyl là đƣờng đơn nhƣ glucose, rhamnose hoặc rutinose) thay thế cho một trong các nhóm –OH. Trong đó, dẫn xuất của quercetin tại hai nhóm –OH ở vị trí số 3 hoặc số 7 thƣờng có trong chế độ ăn giàu flavonoid [86]. Trong số 180 flavonoid đƣợc phát hiện từ thực vật, rutin (quercetin-3-O-rutinoside đƣợc hình thành khi gốc đƣờng thay thế nhóm OH ở vị trí số 3, là dạng kết hợp phổ biến nhất của quercetin [51]. Công thức cấu tạo của rutin là C27H30O16, đƣợc thể hiện trên hình 1.

Cấu tạo hóa học của rutin [2] 4 Các tính đặc trƣng của quercetin ứng dụng trong chiết xuất và xác định b ng các phƣơng pháp hóa lý, đƣợc tóm tắt trên bảng 1. Định danh và đặc tính hóa lý của quercetin Tên IUPAC 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4- [17] one Định danh 5280343 [17] PubChem Định danh quốc tế 1S/C15H10O7/c16-7-4-10(19)12-11(5-7)22- 15(14(21)13(12)20)6-1-2-8(17)9(18)3-6/h1-5,16- [17] 19,21H Tên đồng nghĩa 3,3‟,4‟,5,7-pentahydroxyflavone; dikvertin [17] Tên thƣờng Sophoretin; Xanthaurine; Meletin [17] Khối lƣợng phân tử 302,2357 g/mol [17,128] Công thức phân tử C15H10O7 [17,128] Tính chất vật lý Tinh thể màu vàng, bột vàng. Chuyển hóa thành dạng anhydrous tại 203-207độ F. Dung dịch có cồn vị hơi [17] đắng.

Trọng lƣợng 1,779 g/cm3 [17] Màu sắc Tinh thể màu vàng [2, [17] Nhiệt độ sôi Cao Nhiệt độ nóng chảy 316,5 oC [17] o Độ hòa tan Trong nƣớc: 60 mg/mL tại 16 C; < 1 mg/mL tại 70 o F. Tan nhiều trong ete, metanol; tan đƣợc trong [17] ethanol, aceton, pyridin, axit axetic. Áp suất bay hơi 2,81x10-14 mmHg tại 25 oC [17] Sự phân hủy Khi đun sôi, bốc ra khói hăng và kích ứng. 128, 136] 13 Phổ C-NMR của C2 (160), C3(136,6), C4 (178,3), C4a (105,5), C5 quercetin chuẩn từ (163,9), C6 (98,3), C7 (166,4), C8 (98,0), C8a [17, 128, thực nghiệm 160,1 , C1‟ 124,4 , C2‟ 116,5 , C3‟ 147,2 , C4‟ 136] 148 , C5‟ 117,2 , C6‟ 122.

Phổ IR của OH tự do (3218,09-3411 cm-1), OH phenol (1663 cm- quercetin chuẩn từ 1), C=O (1608 cm-1), C=C (1523 cm-1), C-H (1496 cm- [17, 128, 1 thực nghiệm ), mặt phẳng uốn (1383 cm-1), C-O aryl (1318 cm-1), 136] -1 C-O phenol (1203 cm ). Quercetin có màu vàng, tinh thể hình kim, nhiệt độ nóng chảy khoảng 316,5 °C. Với tính chất phân cực kém, quercetin không tan trong nƣớc lạnh, tan kém trong nƣớc 5 nóng nhƣng tan tốt trong dung môi hữu cơ nhƣ ethanol, methanol và lipid.