Nghiên cứu dầu sinh học omega-3-6 từ vi tảo Schizochytrium TB17 cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Nghiên cứu chi tiết luận án tiến sĩ về quá trình sản xuất dầu sinh học giàu axit béo omega 3, omega 6 từ chủng vi tảo biển Schizochytrium mangrovei TB17. Kết

• Tác giả: Lê Thị Thơm
• Người hướng dẫn: GS. Đặng Diễm Hồng
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 - 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan nghiên cứu dầu sinh học từ vi tảo Schizochytrium mangrovei TB17

Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3-6 từ vi tảo biển dị dưỡng là hướng đi mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Chủng Schizochytrium mangrovei TB17 được phân lập từ hệ sinh thái ngập mặn Việt Nam. Chủng này có khả năng sinh tổng hợp lipid với hàm lượng cao. Đặc biệt, dầu từ vi tảo chứa các axit béo không no chuỗi dài như DHA, EPA, DPA. Đây là những acid béo thiết yếu cho cơ thể người. Con người không thể tự tổng hợp được các acid béo này. Nguồn cung cấp truyền thống chủ yếu từ dầu cá biển sâu. Tuy nhiên, nguồn dầu cá đang bị khai thác quá mức. Ô nhiễm kim loại nặng trong dầu cá ngày càng gia tăng. Vi tảo biển dị dưỡng trở thành nguồn thay thế bền vững. Công nghệ nhân nuôi sinh khối vi tảo trên quy mô công nghiệp đã phát triển mạnh. Schizochytrium mangrovei TB17 cho năng suất lipid cao trong điều kiện dị dưỡng. Môi trường nhân nuôi sử dụng glucose làm nguồn carbon chính. Quy trình tách chiết dầu được tối ưu hóa để thu hồi tối đa các axit béo có giá trị. Nghiên cứu này mở ra hướng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe chất lượng cao từ nguồn nguyên liệu vi tảo trong nước.

1.1. Đặc điểm sinh học của chủng vi tảo Schizochytrium mangrovei TB17

Schizochytrium mangrovei TB17 thuộc họ Thraustochytridae, là vi tảo biển dị dưỡng. Chủng được phân lập từ vùng đất ngập mặn tại Việt Nam. Vi tảo này có khả năng tăng sinh nhanh trong môi trường giàu glucose. Tế bào tích lũy lipid nội bào với hàm lượng đạt trên 50% sinh khối khô. Thành phần axit béo chủ yếu gồm DHA (docosahexaenoic acid) và DPA (docosapentaenoic acid). Chủng TB17 thể hiện tính ổn định di truyền cao qua nhiều thế hệ. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng nằm trong khoảng 25-30 độ C. pH môi trường nhân nuôi lý tưởng từ 6,0 đến 7,5. Đặc tính dị dưỡng giúp vi tảo không cần ánh sáng mặt trời. Điều này tạo thuận lợi lớn cho sản xuất công nghiệp quy mô lớn.

1.2. Vai trò của axit béo omega 3 6 đối với sức khỏe con người

Axit béo omega 3 và omega 6 đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý. DHA là thành phần cấu trúc chính của não bộ và võng mạc. EPA có tác dụng chống viêm, giảm nguy cơ bệnh tim mạch. DPA tham gia vào quá trình tái tạo mô và điều hòa miễn dịch. Tỷ lệ omega 6/omega 3 trong chế độ ăn ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe. Chế độ ăn hiện đại thường có tỷ lệ omega 6/omega 3 quá cao. Điều này dẫn đến tăng nguy cơ viêm mạn tính và các bệnh chuyển hóa. Bổ sung omega 3 từ dầu vi tảo giúp cân bằng tỷ lệ này. Dầu vi tảo có ưu điểm không chứa kim loại nặng như dầu cá. Sản phẩm phù hợp cho người ăn chay và người dị ứng hải sản.

II. Phân tích quy trình nhân nuôi sinh khối vi tảo dị dưỡng Schizochytrium

Quy trình nhân nuôi sinh khối vi tảo Schizochytrium mangrovei TB17 được nghiên cứu kỹ lưỡng. Nhân nuôi theo mẻ là phương pháp cơ bản được áp dụng đầu tiên. Môi trường nuôi cấy chứa glucose làm nguồn carbon chính. Nguồn nitơ và phosphor được bổ sung theo tỷ lệ tối ưu. Quá trình nhân nuôi trải qua nhiều giai đoạn khác nhau. Giai đoạn đầu tiên tập trung vào tăng sinh tế bào nhanh. Giai đoạn thứ hai thúc đẩy tích lũy lipid nội bào. Sự thay đổi điều kiện môi trường giữa hai giai đoạn là then chốt. Giới hạn nguồn nitơ ở giai đoạn hai kích thích tổng hợp lipid. Tuy nhiên, điều kiện bất lợi có thể làm giảm sản lượng sinh khối tổng thể. Nghiên cứu xác định điều kiện cân bằng giữa tăng trưởng và tích lũy lipid. Nhân nuôi liên tục hai giai đoạn và ba giai đoạn cũng được thử nghiệm. Kết quả cho thấy nhân nuôi ba giai đoạn tăng lipid và DHA đáng kể. Hàm lượng oxy hòa tan được kiểm soát chặt chẽ trong suốt quá trình. Nhiệt độ và pH được duy trì ổn định ở mức tối ưu. Các thông số động học như tốc độ sinh trưởng đặc trưng được theo dõi liên tục. Phương pháp này đảm bảo sản lượng dầu cao và chất lượng đồng đều.

2.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sản lượng lipid

Thành phần môi trường nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản lượng lipid. Hàm lượng glucose ban đầu quyết định năng suất sinh khối và lipid. Nguồn nitơ hữu cơ như peptone cho kết quả tốt hơn nitơ vô cơ. Tỷ lệ C/N cao kích thích tế bào chuyển hóa carbon thành lipid dự trữ. Nồng độ muối khoáng ảnh hưởng đến hoạt động enzym tổng hợp axit béo. Bổ sung vitamin nhóm B tăng cường sinh trưởng tế bào. Môi trường có pH ban đầu từ 6,5 đến 7,0 là tối ưu. Thời gian nhân nuôi kéo dài 5-7 ngày cho sản lượng cao nhất. Nghiên cứu tối ưu hóa từng yếu tố bằng phương pháp bề mặt đáp ứng. Kết quả giúp xây dựng công thức môi trường nuôi cấy chuẩn cho chủng TB17.

2.2. Kỹ thuật kiểm soát quá trình nhân nuôi sinh khối công nghiệp

Nhân nuôi sinh khối công nghiệp yêu cầu kiểm soát chặt chẽ nhiều thông số. Hệ thống bể phản ứng sinh học được trang bị cảm biến theo dõi liên tục. Hàm lượng oxy hòa tan được duy trì ở mức 30-40% bão hòa. Tốc độ khuấy trộn ảnh hưởng đến phân tán chất dinh dưỡng và oxy. pH môi trường được điều chỉnh tự động bằng dung dịch axit và bazơ. Nhiệt độ được kiểm soát bằng hệ thống làm mát tuần hoàn. Quá trình cho ăn gián đoạn glucose giúp duy trì nồng độ carbon tối ưu. Phương pháp nhân nuôi liên tục ba giai đoạn cải thiện năng suất rõ rệt. So với nhân nuôi hai giai đoạn, lipid tăng 47,6% và DHA tăng 64,3%. Năng suất DHA tổng thể tăng 97,1% nhờ tối ưu hóa quy trình.

III. Phương pháp tách chiết và làm giàu axit béo omega 3 6 từ vi tảo

Quy trình tách chiết lipit từ sinh khối vi tảo được xây dựng dựa trên phương pháp Bligh và Dyer. Phương pháp gốc được cải tiến phù hợp với điều kiện sản xuất tại Việt Nam. Bước đầu tiên là thu hoạch sinh khối vi tảo sau nhân nuôi. Sinh khối được làm khô bằng phương pháp sấy phun hoặc sấy đông khô. Tế bào vi tảo được phá vỡ bằng phương pháp vật lý và hóa học. Dung môi hỗn hợp chloroform-methanol được sử dụng để chiết lipit. Tỷ lệ dung môi được điều chỉnh cho phù hợp với đặc tính tế bào tảo. Lipit thu được trải qua quá trình tinh sạch để loại bỏ tạp chất. Hỗn hợp axit béo được làm giàu bằng phương pháp urea complexation. Phương pháp này tách riêng các axit béo no và không no. Axit béo omega 3-6 tạo phức với urea ở nhiệt độ thấp. Các axit béo bão hòa bị loại bỏ trong quá trình kết tinh. Hàm lượng DHA, EPA, DPA được tăng cường đáng kể sau làm giàu. Sản phẩm dầu được kiểm tra chất lượng theo tiêu chuẩn quốc gia. Quy trình sản xuất đạt quy mô pilot với khả năng nhân rộng cao.

3.1. Kỹ thuật phá vỡ tế bào vi tảo để thu hồi lipid nội bào

Phá vỡ tế bào vi tảo là bước quan trọng trong quy trình tách chiết lipid. Tế bào Schizochytrium có thành cellulosic dày, khó phá vỡ bằng phương pháp đơn giản. Phương pháp vật lý bao gồm siêu âm, áp suất cao và đông-thaw. Phương pháp hóa học sử dụng dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa. Kết hợp phương pháp vật lý và hóa học cho hiệu quả thu hồi cao nhất. Điều kiện siêu âm ở tần số 20kHz trong 15 phút phá vỡ trên 90% tế bào. Phương pháp enzym cellulase cũng được thử nghiệm với kết quả khả quan. Sau phá vỡ, hỗn hợp được ly tâm để tách pha dầu. Tỷ lệ thu hồi lipid đạt trên 85% so với tổng lipid trong tế bào. Kỹ thuật này được tối ưu hóa để áp dụng cho sản xuất quy mô lớn.

3.2. Quy trình làm giàu và tinh chế axit béo omega 3 6 không no

Làm giàu axit béo omega 3-6 là bước then chốt để tạo sản phẩm chất lượng cao. Phương pháp urea complexation dựa trên nguyên lý tạo phức tinh thể urea. Axit béo bão hòa hình thành phức bền với urea ở nhiệt độ thường. Axit béo không no chuỗi dài như DHA không tạo phức bền. Quá trình kết tinh ở 4 độ C giúp tách hiệu quả các axit béo bão hòa. Tỷ lệ urea/axit béo tối ưu là 3:1 theo khối lượng. Sau lọc và rửa, phần không tan chứa axit béo omega 3-6 giàu có. Hàm lượng DHA trong sản phẩm làm giàu đạt trên 40%. Sản phẩm được tinh chế thêm bằng phương pháp chưng cất phân tử. Dầu thành phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn thực phẩm Việt Nam.

IV. Kết luận và ứng dụng dầu vi tảo trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Luận án đã hoàn thành mục tiêu nghiên cứu đề ra ban đầu. Chủng vi tảo Schizochytrium mangrovei TB17 được xác định là nguồn nguyên liệu tiềm năng. Quy trình nhân nuôi sinh khối dị dưỡng được tối ưu hóa cho sản xuất công nghiệp. Công nghệ tách chiết và làm giàu axit béo omega 3-6 đạt hiệu quả cao. Dầu thành phẩm chứa hàm lượng DHA, EPA, DPA vượt trội so với yêu cầu. Sản phẩm được đóng viên nang mềm theo tiêu chuẩn dược phẩm. Thử nghiệm trên động vật thực nghiệm cho kết quả an toàn. Không phát hiện độc tính cấp và độc tính bán trường diễn. Dầu vi tảo giúp cải thiện lipid máu và chức năng nhận thức ở mô hình thử nghiệm. Sản phẩm phù hợp làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho nhiều đối tượng. Đặc biệt có giá trị cho trẻ em, phụ nữ mang thai và người cao tuổi. Nghiên cứu mở ra hướng sản xuất thương mại dầu tảo biển tại Việt Nam. Công nghệ này giảm phụ thuộc vào nguồn dầu cá nhập khẩu. Đóng góp vào chiến lược phát triển công nghệ sinh học quốc gia.

4.1. Đánh giá an toàn và hiệu quả của dầu vi tảo trên mô hình thực nghiệm

Đánh giá an toàn sản phẩm được thực hiện nghiêm ngặt trên động vật thực nghiệm. Thử nghiệm độc tính cấp trên chuột nhắt cho thấy không có biểu hiện ngộ độc. Liều lượng thử nghiệm lên đến 2000mg/kg thể trọng không gây tử vong. Thử nghiệm độc tính bán trường diễn kéo dài 90 ngày liên tục. Các chỉ số sinh hóa máu và chức năng gan thận đều trong giới hạn bình thường. Không phát hiện tổn thương mô bệnh học ở các cơ quan quan trọng. Hiệu quả giảm cholesterol toàn phần và LDL-cholesterol được ghi nhận rõ rệt. DHA từ dầu vi tảo cải thiện khả năng học tập và ghi nhớ ở chuột già. Kết quả khẳng định tính an toàn và hiệu quả của sản phẩm dầu vi tảo TB17.

4.2. Triển vọng thương mại hóa sản phẩm dầu tảo biển giàu omega 3 6

Sản phẩm dầu tảo biển giàu omega 3-6 có triển vọng thương mại hóa lớn. Thị trường thực phẩm chức năng toàn cầu đang tăng trưởng mạnh hàng năm. Xu hướng người tiêu dùng ưa chuộng sản phẩm nguồn gốc tự nhiên và bền vững. Dầu vi tảo có ưu điểm vượt trội so với dầu cá truyền thống. Không chứa kim loại nặng, không mùi tanh, phù hợp người ăn chay. Quy trình sản xuất có thể nhân rộng quy mô công nghiệp tại Việt Nam. Chi phí sản xuất giảm dần khi tối ưu hóa quy trình và tăng quy mô. Sản phẩm được bào chế dưới dạng viên nang tiện lợi cho người sử dụng. Công ty dược phẩm Novaco đã tham gia đóng gói và hoàn thiện sản phẩm. Chiến lược tiếp thị hướng đến phân khúc chăm sóc sức khỏe cao cấp.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Sự gia tăng gánh nặng bệnh lý mãn tính không lây nhiễm (tim mạch, suy giảm thoái hóa thần kinh, rối loạn chuyển hóa lipid) đã thúc đẩy nhu cầu cấp thiết về các hợp chất hoạt tính sinh học có giá trị cao, đặc biệt là các axit béo không bão hòa đa nối đôi chuỗi dài (LC-PUFAs) thuộc nhóm omega-3 và omega-6. Trong nhiều thập kỷ, dầu cá biển sâu (cá hồi, cá trích, cá thu) là nguồn cung ứng thương mại chính của axit docosahexaenoic (DHA; C22:6 ω-3) và axit eicosapentaenoic (EPA; C20:5 ω-3). Tuy nhiên, nguồn cung truyền thống này đang đối mặt với những thách thức nghiêm trọng: nguy cơ cạn kiệt tài nguyên biển do đánh bắt quá mức, biến động chất lượng theo mùa vụ/địa lý, và đặc biệt là sự tích tụ các độc chất tích sinh học nguy hại như polychlorinated biphenyls (PCBs), dioxin cùng các kim loại nặng (thủy ngân, chì, asen) (Sprague et al., 2016). Đồng thời, thực vật bậc cao chỉ có khả năng tổng hợp các axit béo mạch ngắn hơn hoặc bằng 18 carbon như axit α-linolenic (ALA; C18:3 ω-3) và axit linoleic (LA; C18:2 ω-6) do thiếu hụt phức hợp enzyme elongase và desaturase kéo dài chuỗi.

Trước bối cảnh đó, vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) thuộc họ Thraustochytriaceae, tiêu biểu là chi Schizochytrium, nổi lên như một hệ sinh học siêu tích lũy lipid nội bào (lên đến 70% sinh khối khô - SKK) và giàu LC-PUFAs tinh khiết, không bị nhiễm độc chất đại dương và có khả năng sản xuất sinh khối quy mô công nghiệp trong các nồi lên men kiểm soát nghiêm ngặt quanh năm (Ward & Singh, 2005; Lewis et al., 2016). Tuy nhiên, tại Việt Nam, phần lớn các nghiên cứu trước đây chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm hoặc khai thác các chủng phân lập (như Schizochytrium sp. PQ6) vốn có thành phần axit docosapentaenoic (DPA; C22:5 ω-6/ω-3) không ổn định hoặc hàm lượng rất thấp (<1% TFA) khi nâng quy mô nuôi cấy (Hoang et al., 2014).

Luận án tiến sĩ của NCS. Lê Thị Thơm với đề tài "Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 - 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người" (Chuyên ngành: Hóa sinh học, Mã số: 9 42 01 16, do GS. Đặng Diễm Hồng hướng dẫn khoa học tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2021) đã giải quyết triệt để khoảng trống nghiên cứu (research gap) này. Công trình thiết lập một lộ trình tích hợp hoàn chỉnh từ phân lập, định danh phân tử, tối ưu hóa công nghệ lên men bioreactor, kỹ thuật thu hoạch và tinh chế tạo phức urea làm giàu PUFAs, cho đến đánh giá tiền lâm sàng về độc tính bán trường diễn và hoạt tính cải thiện trí nhớ trên mô hình động vật thực nghiệm.

Câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học của luận án được xác lập:

1. RQ1: Chủng VTBDD bản địa nào tại rừng ngập mặn Việt Nam sở hữu đồng thời năng suất sinh khối cao, hàm lượng lipid vượt trội và tỷ lệ cân bằng bền vững giữa DHA, EPA và DPA?
   • Giả thuyết H1: Chủng Schizochytrium mangrovei TB17 phân lập tại Thái Bình có phổ axit béo omega-3/6 ưu việt và ổn định qua các cấp độ quy mô lên men.
2. RQ2: Các thông số công nghệ sinh học (nguồn cacbon/nitơ, tỷ lệ C:N, nồng độ muối, chế độ sục khí và nhiệt độ) ảnh hưởng như thế nào đến động học sinh trưởng và con đường sinh tổng hợp lipid nội bào trong hệ thống lên men pilot?
   • Giả thuyết H2: Việc tối ưu hóa môi trường bán tổng hợp sử dụng cao nấm men công nghiệp trong bioreactor 30L cho phép đạt mật độ tế bào >120 x 10^6 tế bào/mL và hàm lượng lipid >60% SKK.
3. RQ3: Quy trình tách chiết hóa học và làm giàu bằng phương pháp tạo phức urea có thể đạt độ tinh khiết omega 3-6 >85% mà không làm gãy mạch hay oxy hóa liên kết đôi nhạy cảm?
   • Giả thuyết H3: Sự phối hợp giữa thủy phân kiềm, tạo phức bao urea và bổ sung chất chống oxy hóa phenolic đạt hiệu suất thu hồi LC-PUFAs tinh khiết cao.
4. RQ4: Viên nang dầu sinh học vi tảo (AOO-3-6) có an toàn về mặt độc tính học và có tác dụng dược lý cải thiện khả năng học tập, ghi nhớ trên mô hình động vật hay không?
   • Giả thuyết H4: Viên nang AOO-3-6 an toàn tuyệt đối ở liều lặp lại 90 ngày và thúc đẩy tích cực chức năng nhận thức hệ thần kinh trung ương.

Khung lý thuyết của nghiên cứu dựa trên thuyết tiến hóa phát sinh loài của Stramenopiles/Labyrinthulea (Cavalier-Smith et al., 1994; Honda et al., 1998; Adl et al., 2005), lý thuyết song hành hai con đường sinh tổng hợp axit béo (Con đường hiếu khí desaturase/elongase và con đường kỵ khí Polyketide Synthase - PKS) (Metz et al., 2001; Qiu, 2003), và lý thuyết tính linh động màng sinh học (Membrane Fluidity Theory). Phạm vi nghiên cứu bao gồm sàng lọc 22 chủng vi tảo bản địa, thực nghiệm lên men từ bình tam giác 1L đến bioreactor 5L, 10L, 30L và 150L, kiểm nghiệm hóa lý - vi sinh theo tiêu chuẩn ISO/FDIS 5590:1998, và thử nghiệm in vivo trên 72 chuột nhắt trắng Swiss và 24 chuột cống trắng Wistar.

Literature Review và Positioning

Tổng quan y sinh học quốc tế chứng minh vai trò không thể thay thế của LC-PUFAs đối với sức khỏe con người. DHA chiếm tới hơn 90% tổng lượng PUFAs omega-3 trong chất xám não bộ và 50% trong võng mạc mắt, đóng vai trò sống còn trong phát triển myelin, dẫn truyền synap và điều hòa chức năng thụ thể màng (Hashimoto et al., 2017). Trong khi đó, DPA (C22:5) - đặc biệt là đồng phân omega-6 và omega-3 - đóng vai trò tiền chất của các docosanoid chống viêm mạnh mẽ, ức chế kết tập tiểu cầu, ngăn ngừa xơ vữa động mạch và có tác dụng hiệp đồng hiệp lực khi kết hợp cùng DHA để bảo vệ tế bào thần kinh chống lại thoái hóa Alzheimer (Calder, 2015; Drouin et al., 2019).

Trong lịch sử sinh học vi sinh vật, vị trí phân loại của thraustochytrids từng là tâm điểm của nhiều tranh luận học thuật kéo dài. Được phát hiện lần đầu năm 1934 (Sparrow), nhóm này từng bị xếp nhầm vào lớp nấm Phycomycetes hoặc Oomycetes do có cấu trúc thalli đơn tâm và khả năng giải phóng động bào tử có lông roi. Tranh luận chỉ được giải quyết khi Cavalier-Smith et al. (1994) và Honda et al. (1998) giải trình tự vùng gen 18S rRNA, chứng minh thraustochytrids là một nhánh đơn ngành thuộc ngành Sagenista, phân giới Heterokonta (Stramenopiles), hoàn toàn tách biệt với giới nấm (Fungi) dù chúng đã mất đi bào quan quang hợp (plastid) trong quá trình tiến hóa phân kỳ (Adl et al., 2005).

Về con đường sinh tổng hợp, một cuộc tranh luận học thuật kinh điển diễn ra giữa trường phái ủng hộ con đường hiếu khí cổ điển (Aerobic desaturase/elongase cascade) và trường phái ủng hộ con đường Polyketide Synthase (PKS) kỵ khí độc lập. Nghiên cứu của Qiu (2003) và Zhu et al. (2020) đã chứng minh rằng ở Schizochytrium, phức hợp PKS đóng vai trò chủ đạo trong việc tổng hợp trực tiếp DHA từ acetyl-CoA và malonyl-CoA mà không cần tiêu tốn oxy phân tử cho các bước khử bão hòa trung gian, trong khi con đường hiếu khí qua trung gian Δ4-desaturase đóng vai trò thứ cấp nhưng thiết yếu cho sự tổng hợp DPA và EPA khi thay đổi điều kiện nuôi dưỡng (Meesapyodsuk & Qiu, 2016).

Tiêu chí so sánh	Nguồn Dầu cá biển tự nhiên (Sprague et al., 2016)	Dầu vi tảo Crypthecodinium cohnii (DSM life'sDHA™) (Kyle, 2001)	Dầu vi tảo Schizochytrium sp. thương mại (Source-Omega, DSM)	Luận án: Schizochytrium mangrovei TB17 (Lê Thị Thơm, 2021)
Nồng độ DHA/TFA	10 - 20%	40 - 45%	35 - 40%	42,68 ± 1,76% (Thô) -> 53,10% (Làm giàu)
Hàm lượng DPA/TFA	1 - 3%	Rất thấp (<1%)	10 - 15% (ω-6 DPA)	11,02 ± 1,14% (Thô) -> 24,19% (Làm giàu)
Tổng PUFAs ω 3-6 sau tinh chế	Khó tinh sạch, lẫn nhiều tạp chất	~45%	~50 - 60%	86,33 ± 2,34% (Tối đa đạt 99,46%)
Độ an toàn sinh học	Nguy cơ nhiễm PCBs, Dioxin, Hg	An toàn thực phẩm	An toàn thực phẩm (GRAS)	Đạt chuẩn an toàn sinh học, kim loại nặng không phát hiện
Hiệu suất sinh khối (DCW)	Phụ thuộc đánh bắt tự nhiên	20 - 30 g/L	30 - 60 g/L (Fed-batch)	30,83 ± 0,25 g/L (Mẻ 30L)

Luận án đã định vị chính xác công trình nghiên cứu: Không chỉ là công trình đầu tiên tại Việt Nam phân lập và khảo sát hoàn chỉnh chủng S. mangrovei TB17 từ rừng ngập mặn Diêm Điền (Thái Bình), mà còn phát triển thành công quy trình công nghệ sinh học tích hợp tạo ra sản phẩm viên nang bảo vệ sức khỏe có phổ axit béo kép omega-3/omega-6 (DHA-EPA-DPA) vượt trội hơn hẳn các nghiên cứu đơn lẻ về chủng PQ6 trước đây (Hong et al., 2011; Hoang et al., 2014).

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mang lại những đóng góp nền tảng cho lý thuyết hóa sinh học vi sinh vật và sinh lý học lipid:

• Củng cố và mở rộng thuyết đa hình thái học và chuyển hóa lipid ở Labyrinthulea: Bằng việc ứng dụng hiển vi điện tử truyền qua (TEM) kết hợp nhuộm huỳnh quang đặc hiệu Nile Red, nghiên cứu chứng minh cơ chế tích lũy lipid nội bào diễn ra đồng thời với quá trình phân bào đa nhân liên tiếp (schizogeny), hình thành mạng lưới sagenogenetosome ngoại chất đặc trưng của chi Schizochytrium (Anderson & Cavalier-Smith, 2012).
• Làm sáng tỏ cơ chế điều hòa trao đổi chất Carbon/Nitrogen (C:N ratio theory): Nghiên cứu củng cố mô hình chuyển hóa của Wen & Chen (2002) và Ratledge (2004). Khi nguồn nitơ (cao nấm men) cạn kiệt trong pha sau của quá trình lên men, enzyme AMP-deaminase bị kích hoạt, làm cạn kiệt AMP nội bào, ức chế enzyme isocitrate dehydrogenase trong chu trình Krebs. Hệ quả là ion citrate tích tụ trong ty thể được vận chuyển ra tế bào chất và bị phân cắt bởi ATP-citrate lyase tạo thành lượng lớn Acetyl-CoA - tiền chất trực tiếp kích hoạt con đường PKS tổng hợp bùng nổ LC-PUFAs.
• Chứng minh tính dẻo sinh lý màng (Membrane Fluidity Homeostasis): Dưới tác động của sự thay đổi nhiệt độ và tỷ lệ oxy hòa tan trong các mẻ lên men, vi tảo tái cấu trúc thành phần phospholipid màng thông qua việc tăng tỷ lệ axit béo không no đa nối đôi (DHA 6 nối đôi, DPA 5 nối đôi) để duy trì trạng thái lỏng sinh lý của màng tế bào.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án kết hợp đa tầng lý thuyết:

1. Lý thuyết phát sinh chủng loại phân tử (Molecular Phylogenetics): Sử dụng chỉ thị gen vùng nhân 18S rRNA để phân loại chính xác chủng TB17 trong cấu trúc nhánh đơn ngành của họ Thraustochytriaceae.
2. Lý thuyết động học lên men vi sinh vật (Microbial Fermentation Kinetics): Mô hình hóa sinh trưởng theo các pha (pha lag, pha log lũy thừa, pha cân bằng tích lũy lipid) gắn liền với tốc độ tiêu thụ cơ chất glucose xác định qua phương pháp quang phổ Miller (1959).
3. Lý thuyết nhiệt động học tạo phức bao phân tử (Inclusion Compound Thermodynamics): Khai thác sự sai khác về cấu hình không gian giữa các axit béo bão hòa (SFA - chuỗi zíc zắc thẳng) và axit béo không no đa nối đôi dạng cis (PUFAs - chuỗi uốn cong không gian 30° tại mỗi liên kết đôi). Phân tử urea ($CH_4N_2O$) khi kết tinh trong dung môi cồn sẽ tự cuộn xoắn tạo thành các ống hình trụ lục giác có đường kính bên trong khoảng 5,67 Å. Các chuỗi SFA và MUFA thẳng dễ dàng chui vào lòng ống tạo phức kết tinh rắn lắng xuống, trong khi các phân tử DHA và DPA uốn cong cồng kềnh bị loại ra ngoài và duy trì ở pha lỏng, cho phép phân tách chọn lọc tuyệt đối.

• Điều kiện biên (Boundary conditions): Quy trình áp dụng tối ưu cho chủng S. mangrovei TB17 trong khoảng độ mặn 15-30‰, nhiệt độ nuôi cấy 25-28°C, và giới hạn tỷ lệ FFA:urea từ 1:2 đến 1:4 (w/w) ở nhiệt độ kết tinh 4°C.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án tuân thủ triết lý thực chứng (Positivism) với thiết kế thực nghiệm định lượng đa cấp độ (Multi-level Experimental Design), kết hợp kiểm chuẩn chéo (triangulation) từ sinh học phân tử, công nghệ lên men bioreactor, phân tích hóa lý phân tử đến dược lý học thực nghiệm in vivo.

Quy trình nghiên cứu rigorous

• Định danh phân tử: DNA tổng số tách bằng kit ZR Plant/Seed DNA MiniPrep (Thermo Scientific). Khuếch đại gen 18S rRNA kích thước ~1,8 kb bằng cặp mồi đặc hiệu 18S001 (5'-AACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3') và 18S13 (5'-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT-3'). Giải trình tự trên máy tự động ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer sử dụng BigDye® Terminator v3.1. Phân tích cây phát sinh chủng loại bằng MEGA7 và BLAST NCBI.
• Động học sinh trưởng và phân tích lipid: Mật độ tế bào (MĐTB) đếm qua buồng đếm hồng cầu Bürker-Türk (lặp lại 5 khu vực x 6 lần). Sinh khối khô (SKK) xác định bằng phương pháp sấy nhiệt độ 105°C đến khối lượng không đổi. Glucose dư định lượng bằng phản ứng DNSA đo quang phổ kế Hitachi U1100 tại bước sóng 540 nm (phương trình đường chuẩn $Y = 2,915X - 1,325$). Cấu trúc giọt mỡ nội bào xác nhận qua hiển vi huỳnh quang với thuốc thử Nile Red (kích thích 450-490 nm, phát xạ 540-640 nm) và siêu cấu trúc hiển vi điện tử truyền qua JEOL 1010 (mẫu đúc khối Epon, cắt lát siêu mỏng 60-70 nm, nhuộm uranyl acetate và chì citrate).
• Thu hoạch sinh khối: So sánh phương pháp ly tâm lạnh (3.000 vòng/phút, 10 phút) với phương pháp keo tụ bằng Chitosan (hòa tan trong axit acetic 0,4%, nồng độ tối ưu 200 mg/L dịch nuôi, lắng 30 phút).
• Tách chiết, xà phòng hóa và làm giàu PUFAs: Chiết lipid tổng số theo phương pháp Bligh & Dyer (1959) cải tiến. Tối ưu hóa điều kiện xà phòng hóa giải phóng axit béo tự do (FFA) với nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian phản ứng. Tạo phức urea phân đoạn với các dải tỷ lệ FFA:Urea và Urea:Ethanol ở 4°C.
• Phân tích thành phần axit béo: Chuyển hóa axit béo thành dạng methyl ester (FAME) và phân tích trên hệ thống sắc ký khí khối phổ HP-6890 kết nối Agilent 5973 MSD, cột mao quản DB-23 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), khí mang Heli, chương trình nhiệt 80°C (1 min) -> tăng 4°C/min đến 150°C -> tăng 10°C/min đến 260°C (giữ 10 min). Thư viện phổ chuẩn WILEY275 theo tiêu chuẩn quốc tế ISO/FDIS 5590:1998.
• Thử nghiệm độc tính và dược lý in vivo:
  • Mẫu động vật: 72 chuột nhắt trắng Swiss (18-22 g) và 24 chuột cống trắng Wistar (160-180 g) từ Học viện Quân Y.
  • Độc tính bán trường diễn (90 ngày): Đánh giá thể trọng, chức năng tạo máu (máy phân tích huyết học Humancount 30TS), hoạt độ enzyme gan (AST, ALT), protein/albumin huyết tương, cholesterol toàn phần (máy sinh hóa Biochemical Systems Evolution 3000), điện tâm đồ (Fukuda FX 7102) và kiểm tra mô bệnh học vi thể nhuộm HE (gan, thận, lách) dưới kính hiển vi quang học x400.
  • Dược lý hành vi: Đánh giá khả năng học tập và cải thiện trí nhớ qua mê lộ nước Morris (Morris water maze) và mê lộ chữ Y.

Data và phân tích

Toàn bộ số liệu thực nghiệm được thu thập từ tối thiểu 3-5 lần lặp lại độc lập ($n \ge 3$). Xử lý thống kê mô tả, phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) và so sánh cặp bằng Duncan test/Tukey HSD trên phần mềm SPSS 20.0 và Excel. Mức ý nghĩa thống kê được xác lập tại $p < 0,05$ và $p < 0,01$.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Tuyển chọn và định danh thành công chủng vi tảo ưu việt Schizochytrium mangrovei TB17: Trong số 22 chủng phân lập từ rừng ngập mặn Việt Nam, chủng TB17 (thu thập tại Diêm Điền, Thái Bình) thể hiện tiềm năng sinh học vượt trội nhất. Phân tích gen 18S rRNA khẳng định chủng thuộc loài Schizochytrium mangrovei. Chủng có hàm lượng lipid tổng số đạt 65,96 ± 0,31% SKK; trong đó thành phần axit béo thô chứa DHA đạt 42,68 ± 1,76% TFA và DPA đạt 11,02 ± 1,14% TFA.
2. Xác lập bộ thông số công nghệ lên men tối ưu quy mô bioreactor:
   • Môi trường tối ưu M12: Glucose 90 g/L, cao nấm men công nghiệp 10 g/L, muối biển nhân tạo 17,5 g/L, pH 6,0-6,5, nhiệt độ 28°C.
   • Tại hệ thống lên men 30L: Đạt mật độ tế bào 128,42 ± 0,27 x 10^6 tế bào/mL, sinh khối khô (SKK) đạt 30,83 ± 0,25 g/L, hàm lượng lipid đạt 65,96% SKK, tổng axit béo omega 3-6 đạt 47,35 ± 1,39% TFA, và năng suất sinh tổng hợp DHA đạt 40,17 ± 1,75 mg/L/giờ. Khẳng định tính khả thi vượt bậc khi thay thế cao nấm men phòng thí nghiệm đắt tiền bằng cao nấm men công nghiệp giá thành thấp mà không làm suy giảm năng suất.
3. Đột phá trong công nghệ làm giàu PUFAs bằng kỹ thuật tạo phức Urea: Tối ưu hóa điều kiện kết tinh bao phân tử với tỷ lệ FFA:urea là 1:3 (w/w), tỷ lệ urea:ethanol là 1:4 (w/v) tại nhiệt độ 4°C trong 16 giờ giúp nâng hàm lượng tổng các axit béo omega 3-6 (DHA + EPA + DPA) từ mức 47,35% lên đến 86,33 ± 2,34% TFA, với các mẻ tinh chế cao điểm đạt độ tinh khiết tuyệt đối 99,46 ± 2,66% TFA. Tỷ lệ DHA sau làm giàu tăng từ 42,68% lên 53,10% TFA và DPA tăng từ 11,02% lên 24,19% TFA.
4. Công thức bảo quản tối ưu ngăn ngừa peroxy hóa lipid: Đánh giá động học oxy hóa thông qua chỉ số peroxide (Peroxide Value - PV) chứng minh việc bổ sung chất chống oxy hóa tự nhiên $\alpha$-tocopherol (Vitamin E) ở nồng độ 0,0075% giúp kìm hãm chỉ số peroxide duy trì ổn định dưới mức cho phép (<5 meq/kg) trong suốt thời gian bảo quản, an toàn tuyệt đối cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe con người so với các chất tổng hợp (BHA/BHT).
5. Chứng thực độ an toàn tuyệt đối và hoạt tính cải thiện trí nhớ in vivo:
   • Thử nghiệm độc tính bán trường diễn 90 ngày trên chuột cống trắng Wistar ở 2 mức liều (liều tương đương người và liều gấp 5 lần) cho thấy: Không có sự biến đổi bất thường về cân nặng, các chỉ số huyết học (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu), hoạt độ enzyme gan AST ($p > 0,05$), ALT ($p > 0,05$), nồng độ Albumin và Cholesterol huyết tương. Hình thái giải phẫu đại thể và cấu trúc vi thể mô bệnh học (nhuộm HE x400) của gan, thận, lách bình thường, không ghi nhận hiện tượng thoái hóa, hoại tử hay viêm nhiễm.
   • Thử nghiệm mê lộ nước Morris: Chuột uống viên nang AOO-3-6 có thời gian tìm thấy bục ẩn (escape latency) rút ngắn có ý nghĩa thống kê ($p < 0,01$) và số lần bơi qua vị trí bục tăng vượt trội so với lô đối chứng, minh chứng tác dụng dược lý kích thích tái tạo synap và tăng cường trí nhớ, khả năng tiếp thu bài học.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Cung cấp dẫn liệu khoa học chuẩn mực đầu tiên tại Việt Nam về sinh tổng hợp lipid của chi Schizochytrium, khẳng định sự hiện diện cân bằng của cả hai dòng sản phẩm PKS (DHA) và desaturase/elongase hiếu khí (DPA, EPA) trên chủng vi tảo dị dưỡng bản địa.
• Về mặt phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình khép kín từ khâu công nghệ thu hoạch sinh khối bằng keo tụ chitosan thân thiện môi trường (thay thế ly tâm tiêu tốn năng lượng), xà phòng hóa dị pha, đến làm giàu bằng urea không sử dụng hóa chất độc hại, có thể nhân rộng làm khung tham chiếu cho các chủng vi sinh vật biển dị dưỡng khác.
• Về mặt ứng dụng thực tiễn: Tạo tiền đề sản xuất nguyên liệu dầu vi tảo dạng viên nang mềm "Algae Oil Omega 3-6" (AOO-3-6) đạt các tiêu chuẩn khắt khe của Bộ Y tế và Dược điển Việt Nam, mở ra giải pháp tự chủ nguồn nguyên liệu thực phẩm chức năng cao cấp thay thế hoàn toàn dầu cá nhập ngoại.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả xuất sắc, luận án vẫn tồn tại một số giới hạn nghiên cứu mang tính khách quan:

1. Quy mô lên men bioreactor: Nghiên cứu đã thực hiện tối ưu chi tiết ở quy mô 30L và sơ bộ ở 150L, tuy nhiên chưa mở rộng lên quy mô công nghiệp pilot-plant hàng nghìn lít (vốn đòi hỏi giải quyết các thách thức cơ học chất lỏng phức tạp về truyền khối $k_La$ và biến dạng cơ học màng tế bào dưới cánh khuấy).
2. Kỹ thuật phân tử chuyên sâu: Nghiên cứu tập trung định danh dựa trên gen chỉ thị 18S rRNA và đặc tính sinh hóa, chưa thực hiện giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) cũng như lập hồ sơ phiên mã (Transcriptomics) để định lượng chính xác mức độ biểu hiện gen của từng tiểu phần trong phức hợp enzyme PKS.
3. Mô hình bệnh học chuyên biệt: Thử nghiệm tiền lâm sàng đánh giá trên chuột bình thường trong các bài test nhận thức không gian; chưa khảo sát trên các mô hình chuột chuyển gen mắc bệnh Alzheimer (như APP/PS1) hoặc mô hình gây tổn thương thoái hóa thần kinh do Scopolamine.

Định hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Ứng dụng kỹ thuật kỹ thuật chuyển hóa (Metabolic Engineering) và công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để bất hoạt các gen cạnh tranh sinh tổng hợp SFA, định hướng dòng carbon tập trung 100% vào chuỗi PUFAs.
• Thử nghiệm mở rộng quy mô lên men công nghiệp dạng mẻ-bổ sung-cơ-chất (Fed-batch) với hệ thống tự động kiểm soát nồng độ oxy hòa tan liên tục (DO-stat) nhằm nâng mật độ sinh khối khô vượt ngưỡng 100 g/L.
• Triển khai thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng (Randomized Controlled Trials - RCT) trên người để đánh giá tác dụng bảo vệ tim mạch và tăng cường khả năng tập trung nhận thức của viên nang AOO-3-6.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật (Academic Impact): Công trình đặt nền móng vững chắc cho hướng nghiên cứu công nghệ sinh học vi tảo biển dị dưỡng tại Việt Nam. Các bài báo công bố từ luận án trên các tạp chí chuyên ngành uy tín trong nước và quốc tế tạo nguồn trích dẫn quan trọng cho cộng đồng nghiên cứu Hóa sinh học, Công nghệ sinh học biển và Dược liệu học.
• Chuyển đổi công nghiệp (Industry Transformation): Luận án cung cấp công nghệ lõi sẵn sàng chuyển giao cho các tập đoàn dược phẩm và dinh dưỡng (như Công ty Cổ phần Dược phẩm Novaco), mở ra phân khúc thị trường sản phẩm chăm sóc sức khỏe thuần chay (vegan omega-3) không chứa kim loại nặng, phục vụ đa dạng đối tượng từ trẻ sơ sinh, phụ nữ có thai đến người cao tuổi.
• Lợi ích xã hội và Môi trường: Giảm áp lực khai thác cá biển tự nhiên, góp phần bảo tồn đa dạng sinh học hệ sinh thái đại dương; đồng thời khai thác bền vững nguồn tài nguyên vi sinh vật bản địa tại các vùng rừng ngập mặn ven biển Việt Nam.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giới học thuật: Tiếp cận cơ sở dữ liệu toàn diện về đặc tính sinh lý, phát sinh loài và phương pháp phân tích hóa sinh lipid chuyên sâu của vi sinh vật biển dị dưỡng.
• Doanh nghiệp Dược phẩm & Thực phẩm chức năng: Tiếp nhận quy trình công nghệ chiết xuất, tinh sạch và công thức bảo quản dầu tảo giàu DHA/DPA đạt độ tinh khiết cao, sẵn sàng thương mại hóa với chi phí sản xuất cạnh tranh.
• Nhà hoạch định chính sách: Có thêm cơ sở khoa học thực tiễn để phê duyệt, xây dựng tiêu chuẩn quốc gia cho các sản phẩm dầu sinh học nguồn gốc từ vi tảo tại Việt Nam.
• Người tiêu dùng: Tiếp cận nguồn sản phẩm bổ sung omega 3-6 chất lượng cao, an toàn tuyệt đối, không có mùi tanh khó chịu của cá và không nguy cơ tích tụ độc chất đại dương.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào?

Trả lời: Đóng góp độc đáo nhất là việc chứng minh sự tồn tại đồng thời và cơ chế điều hòa chuyển hóa kép của hai hệ sinh tổng hợp lipid: hệ thống Polyketide Synthase (PKS kỵ khí) tạo ra hàm lượng vượt trội của DHA (42,68% TFA) song song với con đường desaturase/elongase hiếu khí tổng hợp DPA (11,02% TFA) và EPA trên chủng bản địa Schizochytrium mangrovei TB17. Kết quả này mở rộng trực tiếp Lý thuyết chuyển hóa lipid vi sinh vật (Microbial Oleaginous Theory) của Ratledge (2004) và lý thuyết phát sinh chủng loại Stramenopiles của Cavalier-Smith (1994).

2. Điểm đổi mới phương pháp luận khi so sánh với các nghiên cứu tiền nhiệm?

Trả lời: So sánh với nghiên cứu của Nakahara et al. (1996) và Hoang et al. (2014), luận án đã tạo bước đột phá phương pháp luận ở 3 khâu: (1) Thay thế môi trường dinh dưỡng đắt tiền bằng môi trường M12 sử dụng cao nấm men công nghiệp nhưng vẫn đạt sinh khối kỷ lục (30,83 g/L; 65,96% lipid) trong bioreactor 30L; (2) Ứng dụng thành công keo tụ chitosan 200 mg/L loại bỏ công đoạn ly tâm tiêu tốn năng lượng; (3) Tối ưu hóa phương pháp tạo phức urea dị pha nâng độ tinh khiết LC-PUFAs lên tới 86,33% - 99,46% TFA mà không làm biến tính đồng phân cis.

3. Phát hiện bất ngờ nhất từ tập dữ liệu thực nghiệm là gì?

Trả lời: Phát hiện bất ngờ nhất là hàm lượng axit béo hiếm DPA (C22:5) trong chủng TB17 đạt tỷ lệ rất cao và ổn định (11,02% ở dầu thô và đạt tới 24,19% sau tinh chế) qua tất cả các cấp độ nuôi cấy từ 1L đến 30L. Đây là đặc tính hiếm thấy ở các chủng Schizochytrium thông thường (vốn chỉ chứa vết DPA hoặc DPA bị suy giảm nghiêm trọng khi mở rộng thể tích nuôi cấy như trường hợp chủng PQ6).

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?

Trả lời: Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ quy trình tái lập thực nghiệm chuẩn xác: Thành phần môi trường nuôi cấy (M1, M12, GPY), trình tự mồi PCR 18S rRNA, thông số vận hành bioreactor (nhiệt độ, pH, DO, tốc độ khuấy, lưu lượng khí nén), tỷ lệ hóa chất xà phòng hóa và tạo phức urea, thông số cột GC-MS DB-23 và quy trình thử nghiệm độc tính bán trường diễn 90 ngày theo quy định của Bộ Y tế và OECD.

5. Khung lộ trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình như thế nào?

Trả lời: Lộ trình 10 năm được xác lập qua 3 giai đoạn: (1) Giai đoạn 1-3 năm: Giải mã toàn bộ hệ gen (WGS), tái cấu trúc con đường chuyển hóa bằng sinh học tổng hợp; (2) Giai đoạn 4-6 năm: Hoàn thiện công nghệ lên men bioreactor công nghiệp 1.000 - 10.000L theo phương thức Fed-batch/Continuous; (3) Giai đoạn 7-10 năm: Triển khai thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm và thương mại hóa toàn cầu các dòng dược phẩm chuyên biệt điều trị suy giảm trí nhớ và bệnh lý võng mạc.

Kết luận

1. Phân lập, định danh và xác lập thành công chủng vi tảo biển dị dưỡng bản địa Schizochytrium mangrovei TB17 có tiềm năng sinh học vượt bậc với hàm lượng DHA đạt 42,68 ± 1,76% TFA và DPA đạt 11,02 ± 1,14% TFA.
2. Tối ưu hóa thành công quy trình lên men mẻ trong bioreactor 30L sử dụng môi trường M12 gốc cao nấm men công nghiệp, đạt mật độ tế bào 128,42 ± 0,27 x 10^6 TB/mL, sinh khối khô 30,83 ± 0,25 g/L, hàm lượng lipid 65,96 ± 0,31% SKK, tổng omega 3-6 đạt 47,35 ± 1,39% TFA và năng suất DHA 40,17 ± 1,75 mg/L/giờ.
3. Làm chủ quy trình thu hoạch sinh khối bằng keo tụ Chitosan 200 mg/L và công nghệ tinh sạch bằng kỹ thuật tạo phức Urea, nâng tổng hàm lượng LC-PUFAs lên 86,33 ± 2,34% (cực đại đạt 99,46 ± 2,66% TFA).
4. Thiết lập công thức chống oxy hóa bảo quản dầu sinh học tối ưu bằng Vitamin E (0,0075% $\alpha$-tocopherol), duy trì chỉ số peroxide an toàn theo chuẩn quốc tế.
5. Sản xuất thành công viên nang mềm "Algae Oil Omega 3-6" (AOO-3-6), chứng minh tính an toàn tuyệt đối qua thử nghiệm độc tính bán trường diễn 90 ngày và khẳng định tác dụng dược lý vượt trội trong việc cải thiện trí nhớ, tăng cường phản xạ học tập trên mô hình động vật thực nghiệm.
6. Công trình tạo bước đột phá học thuật và ứng dụng công nghệ sinh học biển tại Việt Nam, mở ra hướng đi độc lập, tự chủ trong sản xuất nguồn thực phẩm chức năng bảo vệ sức khỏe con người mang tầm vóc quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về axit béo, vai trò, nguồn gốc và con đường sinh tổng hợp axít béo Các axít béo ω 3 - 6 có nhiều chức năng sinh học như: cải thiện hiệu quả bệnh tim mạch; giảm nguy cơ loạn nhịp tim (có thể dẫn tới đột tử); có hiệu quả rõ rệt trong điều trị suy nhược; giảm nguy cơ hình thành khối u tuyến tiền liệt (có thể dẫn đến đau tim và đột quỵ); làm chậm tốc độ tăng trưởng của mảng xơ vữa động mạch; cải thiện chức năng nội mô; hạ huyết áp (nhẹ) và giảm phản ứng viêm. Chính những đặc điểm trên mà các axít béo ω 3 - 6 ngày càng được ứng dụng trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người. Do vậy, những đặc điểm chính về axít béo ω 3 - 6 sẽ được trình bày khái quát dưới đây.

Giới thiệu chung về axit béo Axít béo có công thức tổng quát: CH3-(CH2)n-COOH. PUFAs là các axít béo mạch dài (18 - 22 nguyên tử cacbon) có chứa hai hoặc nhiều hơn các liên kết đôi. Mạch hydrocarbon có 2 đầu: một đầu là nhóm methyl và một đầu là nhóm cacboxyl. Chúng được phân loại theo vị trí của liên kết đôi đầu tiên tính từ gốc methyl hay gốc cacboxyl.

Để chỉ vị trí nối đôi đầu tiên trên mạch cacbon được tính từ đầu methyl người ta có thể sử dụng ký hiệu “n” hoặc “ω”. Các liên kết đôi trong PUFAs cũng có thể được tính từ gốc carboxyl và được ký hiệu “Δ”. Những nhóm ω-3, ω-6 hay ω-9 PUFAs có liên kết đôi đầu tiên tương ứng tại vị trí cacbon số 3, 6 hay 9 tính từ gốc methyl [1]. Mạch cacbon của axít béo no thường có dạng zíc zắc, kéo thành chuỗi dài không cong.

Các axít béo không no, có một liên kết đôi dạng cis thì mạch cacbon bị uốn cong 30°, càng có nhiều liên kết đôi, mạch cacbon càng bị uốn cong nhiều hơn. Có giả thiết cho rằng mạch cacbon của axít béo không no dạng cis có ý nghĩa quan trọng đối với màng sinh học. Theo nghiên cứu của Kelter và cộng sự (1999) [2] cho thấy các phân tử không thể chuyển từ dạng cis- sang dạng trans- hoặc ngược lại trong trường hợp bình thường. Kiểu đồng phân cis- hoặc trans- là nguyên nhân dẫn đến tính chất khác nhau của các axít béo.

Vị trí của các nối đôi trong chuỗi cacbon của PUFAs tạo nên một sự khác biệt lớn trong việc cơ thể con người chuyển hóa chúng. Các tế bào của cơ thể con người chỉ có thể tạo nối đôi C = C tổng hợp axít béo kể từ cacbon thứ 9 trở đi. Điều này có nghĩa là con người không thể tự tổng hợp được axít béo ω - 3 và ω - 6. Do đó hai loại axít béo này chỉ có thể được lấy qua chế độ ăn uống hàng ngày [3].

Hoạt 5 tính sinh học của các axít béo phụ thuộc vào các dạng cấu trúc hóa học đặc trưng của chúng. Axít béo có một số dạng cấu trúc chính như ethyl este (EE), axít béo tự do (free fatty acid - FFA) và triacylglycerols (TAGs). Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng các axít béo dạng EE có hoạt tính sinh học thấp hơn so với dạng FFA và TAG [4]. Sự hấp thụ EPA ở dạng triglycerid là 90% trong khi ở dạng ethyl ester chỉ là 60% [5].

Có hai nhóm axít béo không thay thế quan trọng là ω - 3 và ω - 6. Các axít béo ω - 3 quan trọng nhất là: ALA (C18:3), EPA, DHA, DPA. Các axít béo ω - 6 chính là: axit linoleic (LA; C18:2 ω-6), gama linoleic (GLA - C18:3), eicosadienoic, dihomo-gamma-linoleic (DGLA), ARA (C20:4), DPA [6]. Axít docosahexaenoic (DHA) DHA có công thức phân tử C22H32O2, là một axít béo ω - 3 không bão hòa đa nối đôi.

Nó có 22 nguyên tử cacbon trong chuỗi hydrocarbon, có 6 liên kết đôi ở các vị trí cacbon số 4, 7, 10, 13, 16 và 19, có công thức tổng quát là: CH3(CH2CH = CH)6(CH2)2COOH và được kí hiệu là C22:6 ω-3 [7]. DHA có thể được chuyển thành docosanoids. Các liên kết đôi (- C = C -) có cấu hình cis (- C/C = C\C -) để hoạt động sinh lý. Cấu trúc không bão hòa đa nối đôi (= CH - CH2 - CH =) xoay quanh là các liên kết đơn (C - C) liền kề.

Do đó, nó làm tăng khả năng liên kết hơn so với phân tử không có liên kết đôi nào. Điều này làm tăng tính linh hoạt của phân tử rất nhiều [8]. Trọng lượng phân tử của DHA là 328,6 g/mol. Ở điều kiện chuẩn, DHA tồn tại dạng lỏng, không tan trong nước, tan trong dung môi không phân cực.

Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của DHA được trình bày trên Hình 1. Cấu trúc hóa học (A) và cấu trúc không gian (B) của DHA [7] 1. Axít eicosapentaenoic (EPA) EPA có công thức phân tử C20H30O2, là một axít béo ω-3 không bão hòa đa nối đôi. Nó có 20 nguyên tử cacbon trong chuỗi hydrocarbon, có 5 liên kết đôi ở các vị trí cacbon số 5, 8, 11, 14 và 17, có công thức tổng quát là: CH3(CH=CH=CH)5 (CH2)3COOH và ký hiệu là C20:5 ω-3.

Trọng lượng phân tử của EPA là 302,451 g/mol. EPA tồn tại dạng lỏng ở điều kiện chuẩn, bay hơi ở 439oC, khối lượng riêng 6 0,943g/cm3. Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của EPA được trình bày trên Hình 1. Cấu trúc hóa học (A) và cấu trúc không gian (B) của EPA [9] 1.

Axít docosapentaenoic (DPA) DPA có công thức phân tử C22H34O2. Trọng lượng phân tử của DPA là 330,5 g/mol. DPA là một axít béo không bão hòa đa nối đôi. Nó có 22 nguyên tử cacbon trong chuỗi hydrocarbon, có 5 liên kết đôi.

DPA có hai dạng đồng phân: all - cis - 4,7,10,13,16 - docosapentaenoic axít và all - cis - 7,10,13,16,19 - docosapentaenoic axít (Hình 1. Chúng thường được gọi là ω-6 DPA và ω-3 DPA, tương ứng; chỉ vị trí của liên kết đôi là 6 hoặc 3 nguyên tử cacbon gần nhất với cacbon ở đầu methyl của phân tử. Động vật có vú, kể cả con người, không thể tổng hợp được hai axít béo này và do đó phải thu nhận qua con đường thức ăn để duy trì sức khỏe bình thường. Cấu trúc hóa học của ω - 6 DPA và ω - 3 DPA được trình bày trên Hình 1.

Vai trò và ứng dụng của PUFAs Hiện nay, PUFAs như ALA, EPA và DHA đang được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất bởi chúng có ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe con người và động vật. Đặc biệt là DHA rất đa dạng về chức năng cũng đã được chứng minh bởi Hashimoto và cộng sự (2017) [11]. Vai trò của PUFAs đối với sức khoẻ con người PUFAs có một số vai trò sinh học chủ yếu: PUFAs tham gia vào sự điều hòa quá trình trao đổi lipit, vận chuyển và hướng tới các mô. Ví dụ, các hoạt động bao gồm sự ức chế quá trình sinh tổng hợp triacylglycerol (TAG) ở gan bởi  - 3 PUFAs.

Bên cạnh đó, PUFAs còn tham gia vào thành phần cấu trúc nên thành tế bào. Sự có mặt của chúng trong thành phần phospholipit góp phần tạo nên tính linh động của màng. Điều này góp phần quan trọng trong việc điều chỉnh hoạt động của các protein màng. PUFAs là thành phần quan trọng cấu tạo nên tế bào não, đặc biệt đối với trẻ nhỏ từ 0 - 2 tuổi.

Axít béo này cũng có ảnh hưởng quan trọng theo hướng tích cực đến hoạt động của hệ thống thần kinh trung ương, cần thiết cho sự phát triển chức năng não bộ và thị giác ở trẻ nhỏ, não bộ không thể duy trì hoạt động nếu như không có những axít béo quan trọng này [12]. Để duy trì màng tế bào, chức năng não và truyền các xung thần kinh, các axít béo ω 3 - 6 cũng tham gia vào việc chuyển oxy trong quá trình tổng hợp hemoglobin và phân chia tế bào [13]. PUFAs góp phần cải thiện hiệu quả bệnh tim mạch: giảm nguy cơ loạn nhịp tim; có hiệu quả rõ rệt trong điều trị suy nhược; giảm nguy cơ hình thành khối u tuyến tiền liệt; làm chậm tốc độ tăng trưởng của mảng xơ vữa động mạch; cải thiện chức năng nội mô; hạ huyết áp (nhẹ) và giảm phản ứng viêm [12]. So với các cơ quan khác hàm lượng DHA trong não và mắt cao hơn.

DHA đặc biệt tập trung vào chất xám của não và võng mạc. Trong não, DHA có liên quan đến tín hiệu thần kinh, trong khi ở mắt nó có liên quan đến chất lượng thị lực. DHA được tích lũy trong não và mắt vào giai đoạn phôi thai sớm và cuối thai kỳ. Hàm lượng DHA thấp làm giảm sự phát triển nhận thức và chức năng thị giác [7].

Axít béo ω - 3 cũng đã được điều tra tính hiệu quả trong rất nhiều các nghiên cứu về sức khỏe con người bao gồm các loại ung thư khác nhau như: đại tràng, vú, và tuyến tiền liệt. Nhiều kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy việc sử dụng các axít béo ω - 3 để cải thiện tình trạng bệnh tiểu đường thai kỳ, có lợi trong việc điều hòa chức năng trao đổi chất của mẹ và thai nhi [14]. Trong chế độ ăn chứa LA (ω - 6) và ALA (ω - 3) đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì hàm lượng PUFAs ω 3 - 6 của tế bào nội mô. Việc chuyển ALA thành EPA và DHA phụ thuộc vào một số yếu tố di truyền, chế độ ăn uống (tỷ lệ LA và ALA), giới tính và các enzyme desaturase và elongases [15].

Các axit béo ω - 6 như linoleic và DPA có tác dụng chống viêm dây thần kinh trong cơ thể người ở các mô hình về bệnh Alzheimer. Trong đó, axit linoleic ω - 6 có trong khẩu phần ăn sẽ làm tăng chất chuyển hóa DPA ω - 6 trong não và có tác dụng thúc đẩy quá trình 8 chống viêm dây thần kinh dẫn đến làm giảm bệnh Alzheimer [16]. Ngoài ra, DPA ω - 6 đã được chứng minh có tác dụng chống viêm, giảm phù nề và tăng cường tác dụng khi kết hợp với DHA [17], giảm co thắt mạch máu và kết tụ tiểu cầu [15]. Vai trò của PUFAs đối với nuôi trồng thủy sản (NTTS) PUFAs như axít EPA, ARA và DHA cũng là thành phần rất quan trọng bởi nó cần thiết cho sự phát triển và biến thái của ấu trùng.

Tuy nhiên, cần chú ý là tỷ lệ giữa DHA, EPA và ARA có thể còn quan trọng hơn rất nhiều so với hàm lượng của chúng. Các loài vi tảo có hàm lượng dinh dưỡng rất cao, đặc biệt là các axít béo [18].