HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: GIẢI MÃ VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ VÙNG GEN Cag A CỦA VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI GÂY BỆNH VIÊM DẠ DÀY Ở NGƢỜI TẠI BỆNH VIỆN 19 – 8 HÀ NỘI, 07/2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: GIẢI MÃ VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ VÙNG GEN Cag A CỦA VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI GÂY BỆNH VIÊM DẠ DÀY Ở NGƢỜI TẠI BỆNH VIỆN 19 – 8 Ngƣời thực hiện : LÊ CÔNG TOÁN Khoá : 63 Ngành : Công nghệ sinh học :TS. Đoàn Thị Thanh Hƣơng Ngƣời hƣớng dẫn TS. Trần Thị Bình Nguyên HÀ NỘI, 07/2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là kết quả công trình nghiên cứu của riêng bản thân. Các số liệu, kết quả trong luận văn này là trung thực, chính xác và chƣa từng đƣợc công bố trong các luận văn, luận án hay các công trình nghiên cứu khoa học trƣớc đây.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ trong quá trình hoàn thành luận văn này đều đã đƣợc cảm ơn và mọi trích dẫn trong luận văn này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc theo đúng quy định. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Hà Nội, ngày … tháng … năm 2022 Sinh viên Lê Công Toán i LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. oàn Thị Thanh Hƣơng – Trƣờng phòng Miễn dịch học (Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam) đã trực tiếp hƣớng dẫn và truyền đạt kiến thức để tôi có thể thuận lợi hoàn thành tốt Khoá luận tốt nghiệp này. Tiếp đến, tôi xin g i lời cảm ơn chân thành tới TS.
Tr n Thị ình Nguyên – Trƣởng Bộ môn CNSH ộng vật đã giúp đỡ và hƣớng dẫn nhiệt tình cho tôi trong suốt thời gian hoàn thiện Khoá luận tốt nghiệp vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ làm việc tại Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam cùng với các Th y/Cô trong Bộ môn CNSH ộng vật đã luôn tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành Khoá luận tốt nghiệp này. Lời cuối, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và tất cả những ngƣời thân yêu đã luôn tin tƣởng, ủng hộ và hết lòng động viên những lúc tôi gặp khó khăn trong quá trình hoàn thành Khoá luận tốt nghiệp vừa qua. Một l n nữa, tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày … tháng … năm 2022 Sinh viên Lê Công Toán ii MỤC LỤC LỜI CAM OAN .ii MỤC LỤC.
iii DANH MỤC HÌNH.vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.
Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn. Những đóng góp mới của đề tài. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.
Tổng quan về vi khuẩn H. Giới thiệu về vi khuẩn H. ặc điểm hình thái và khả năng gây bệnh viêm dạ dày của H. Cơ chế bệnh sinh và lây truyền bệnh.
Các phƣơng pháp chẩn đoán nhiễm H. Thông tin về gen Cag A. Giới thiệu về gen Cag A. Motif EPIYA – vị trí của quá trình phosphoryl hóa tyrosine Cag A.
ảo gây bệnh PAI và cơ chế gây bệnh của gen Cag A. Tình hình nghiên cứu về gen ở vi khuẩn H. pylori trong và ngoài nƣớc. Tình hình nghiên cứu về gen của vi khuẩn H.
pylori trên Thế giới. Tình hình nghiên cứu về gen của vi khuẩn H. pylori tại Việt Nam.24 iii Phần III. VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu. Hoá chất và thiết bị. Dụng cụ và thiết bị.
Nội dung nghiên cứu. Phƣơng pháp nghiên cứu. Thu thập và x lý mẫu bệnh phẩm. Tách chiết DNA tổng số từ mảnh sinh thiết dạ dày.
Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR thu nhận trình tự nucleotide vùng 3‟ gen Cag A của H. Kỹ thuật PCR. Kỹ thuật điện di để kiểm tra sản phẩm PCR. Phƣơng pháp giải trình tự.
Phƣơng pháp thu thập dữ liệu và x lý số liệu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Kết quả thu mẫu, tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân viêm dạ dày thu nhận tại bệnh viện 19 – 8. Kết quả tách chiết DNA tổng số.
Kết quả xác định vi khuẩn H. pylori bằng kỹ thuật PCR khuyếch đại vùng gen 16S rDNA. Kết quả thu nhận sản phẩm PCR vùng gen Cag A của 5 mẫu H. Kết quả phân tích đặc điểm phân t của vùng gen Cag A phân lập từ mẫu H.
Kết quả xác định type gen. Bảng so sánh tƣơng đồng nucletide. Kết quả phân tích phả hệ nguồn gốc của các chủng H. pylori Việt Nam trong nghiên cứu.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .56 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH Ã CÔNG Ố LIÊN QUAN ẾN LUẬN VĂN .57 TÀI LIỆU THAM KHẢO .58 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Các mốc thời gian chính trong nghiên cứu vi khuẩn H. pylori trong dạ dày. Các yếu tố sinh học với đặc tính sinh bệnh.
Ƣu/nhƣợc điểm của một số phƣơng pháp chẩn đoán nhiễm H. Thông tin về mồi s dụng trong kỹ thuật PCR. Hoá chất dùng trong chất điện di. Dụng cụ s dụng trong nghiên cứu.
Thiết bị s dụng trong nghiên cứu. Quy trình tách chiết DNA từ mảnh sinh thiết dạ dày s dụng Bộ Dneasy Blood & Tissue Kits (QIAGEN). Thành ph n phản ứng PCR. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR.
Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR s dụng Bộ GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific – Mỹ). Bảng thông tin về các chủng thu thập đƣợc từ GenBank. Thông tin 5 chủng đƣợc s dụng để giải trình tự và so sánh với các chủng trên thế giới. Tỉ lệ tƣơng đồng (%) về thành ph n nucleotide của các trình tự vùng 3‟ gen Cag A giữa các chủng nghiên cứu và Thế giới.52 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.
Sự lây lan theo thời gian của H. pylori ở các lục địa. Thông tin phân loại khoa học của vi khuẩn H. pylori lấy trên Hệ thống thông tin phân loại tích hợp (ITIS).
Cấu trúc của H. Thông tin về hệ gen của vi khuẩn H. Hình thái của vi khuẩn H. pylori và cơ chế bệnh sinh.
Giải phẫu phân t của vùng chứa EPIYA -A, - và -C của Cag A. So sánh vùng chứa EPIYA giữa các loài Cag A phƣơng Tây (Western Cag A) và ông Á (East Asian Cag A). ại diện cho đảo gây bệnh PAI của H. Cơ chế hoạt động của Cag A.
Tƣơng tác và chức năng giữa Cag A và SHP – 2. Tỷ lệ nhiễm H. pylori trên toàn Thế giới. Ảnh điện di DNA tổng số thu đƣợc từ các mẫu sinh thiết dạ dày nhiễm H.
pylori trên Agarose 1%. Kết quả điện di sản phẩm PCR thu nhận vùng gen 16S rDNA của 05 mẫu bệnh phẩm H. pylori với cặp mồi Hp-16S-F và Hp-16S-R dùng để chẩn đoán. Sản phẩm PCR đã tinh sạch chạy bằng cặp mồi Cag A3F và Cag A3R.
Trình tự amino acid (suy diễn, thu gọn) thu đƣợc từ trình tự vùng 3‟ gen Cag A của 5 chủng H. pylori nghiên cứu. Mối quan hệ phả hệ của các chủng H. pylori của Việt Nam và thế giới dựa trên trình tự đ u 3‟ của gen Cag A .55 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết Giải thích thuật ngữ Giải thích thuật ngữ STT tắt Tiếng Anh Tiếng Việt Adherence – associated 1 Alp A Protein bám dính loại A proteins type A Adherence – associated 2 Alp B Protein bám dính loại B proteins type B 3 bp base pair Cặp base nito Gen mã hoá cho prrotein Cag 4 Cag A Cytotoxin Associated gene A Gen mã hoá protein điều hoà 5 Csk Carboxy SRC kinase kinase của họ Src.
6 DNA Deoxyribonucleic acid acid deoxyribonucleic 7 E. coli Escherichia coli V khuẩn E. coli Gen mã hoá họ protein 8 Glr Glutamate Receptor family glutamate 9 H. felis Helicobacter felis Vi khuẩn H.
10 Helicobacter heilmannii Vi khẩn H. heilmannii heilmannii Họ protein gồm Hps 70 và Hps 11 Hop Hps 70 and Hps 90 90 H. pylori outer membrane Protein màng ngoài của H. 12 Hop Z protein pylori 13 Hps A Heat shock proteins A Protein sốc nhiệt loại A 14 Hps B Heat shock proteins B Protein sốc nhiệt loại B 15 Hps 60 Heat shock proteins 60 Protein sốc nhiệt 60 16 IS Insertion sequece elements Trình tự chèn IL – 8 Interleukin 8 Một chemokine đƣợc sản xuất 17 bởi đại thực bào 18 kb Kilo base pair 1000bp viii 19 kDa Kilodaltons Kilo Daltons 20 Lab A lacdiNAc – binding adhesin Chất kết dính gắn LacdiNAc 21 Mp Mega base pair 1000000bp Protein kích hoạt bạch c u 22 NAP Neutrophil – activating protein trung tính 23 OM Outer membrane Màng ngoài 24 OMPs Outer membrane proteins Các protein màng ngoài 25 ORF Open reading frame Khung đọc mở 26 ORF5 open reading frame 5 Khung đọc mở số 5 Gen mã hoá Phosphatidylinositol Glycan 27 Pig A phosphatidylinositol glycan Anchor Biosynthesis Class A lớp A Gen mã hoá Phosphatidylinositol Glycan 28 Pig B phosphatidylinositol glycan Anchor Biosynthesis Class B lớp A 29 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng lặp 30 RNA Ribonucleic Acid Acid ribonucleic Gen mã hoá cho hành viên của 31 Src Sex combs reduced phức hợp Antennapedia (ANT- C) 32 TAE Tris-acetate-EDTA 33 tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển 34 T4SS Type IV secretory system Hệ thống bài tiết loại 4 35 Ure A Urease type A Urease loại A 36 Ure B Urease type B Urease loại B 37 Ure E Urease type E Urease loại E 38 Ure H Urease type H Urease loại H 39 Ure I Urease type I Urease loại I 40 UTDD Ung thƣ dạ dày 41 Vac A Vacuolating Cytotoxin Gen mã hoá cho protein Vac A ix Associated gene 42 WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới 43 16S rDNA 16S ribosomal DNA DNA 16S của Ribosome 44 16s rRNA 16S ribosomal RNA RNA 16S Ribosome x TÓM TẮT H.
pylori là một trong số ít vi khuẩn có khả năng tồn tại ở trong môi trƣờng axit đậm đặc của dạ dày, sản sinh ra chất gây phá hủy niêm mạc dạ dày, từ đó làm tổn thƣơng dạ dày gây ra viêm loét dạ dày và đây cũng là nguyên nhân chính gây nên tình trạng ung thƣ dạ dày.