Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Vi khuẩn Helicobacter pylori (H. pylori) là xoắn khuẩn Gram âm cư trú trong lớp chất nhầy bao phủ niêm mạc dạ dày người, được hai bác sĩ người Úc là Robin Warren và Barry Marshall phát hiện vào năm 1982 và định danh chính thức vào năm 1989. Đây là một trong số ít vi sinh vật có khả năng tồn tại và phát triển trong môi trường axit đậm đặc của dạ dày nhờ cơ chế tiết men urease trung hòa dịch vị. Vi khuẩn này phá hủy hàng rào niêm mạc bảo vệ, gây tổn thương biểu mô, dẫn tới viêm dạ dày, loét dạ dày - tá tràng và là nguyên nhân chính gây ung thư biểu mô dạ dày.

Trong thực tiễn y khoa, việc chẩn đoán nhiễm H. pylori dựa trên nhiều phương pháp lâm sàng như nội soi sinh thiết, mô bệnh học, thử nghiệm nhanh urease (RUT), thử nghiệm hơi thở ure, xét nghiệm kháng nguyên trong phân và xét nghiệm huyết thanh học. Tuy nhiên, các phương pháp truyền thống này tồn tại những hạn chế nhất định về tính xâm lấn, độ nhạy, nguy cơ âm tính giả hoặc dương tính giả và không thể cung cấp thông tin di truyền về độc lực của chủng vi khuẩn. Việc áp dụng các chỉ thị phân tử (gen nhân và gen ty thể) thông qua phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và giải trình tự nucleotide được đánh giá là phương pháp ưu việt, cho phép xác định chính xác tác nhân gây bệnh ở cấp độ phân tử và đánh giá mức độ nguy cơ bệnh sinh.

Độc lực của H. pylori phụ thuộc chủ yếu vào các yếu tố gây bệnh đặc hiệu, tiêu biểu là protein Cag A (Cytotoxin-associated gene A) nằm trên đảo gây bệnh Cag PAI (Cag Pathogenicity Island) và độc tố tạo không bào Vac A. Trong đó, protein Cag A là yếu tố độc lực trọng yếu, có kích thước và hoạt tính biến đổi tùy thuộc vào cấu trúc các motif lặp lại ở vùng đầu 3' của gen. Xuất phát từ bối cảnh đó, khóa luận thực hiện đề tài nhằm làm sáng tỏ cấu trúc phân tử của phân đoạn gen kháng nguyên Cag A từ các chủng vi khuẩn phân lập tại cơ sở y tế Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là phân tích được đặc điểm phân tử của phân đoạn gen kháng nguyên Cag A của một số chủng vi khuẩn H. pylori gây bệnh viêm dạ dày ở bệnh nhân Việt Nam năm 2021. Để đạt được mục tiêu này, nghiên cứu triển khai các nhiệm vụ cụ thể:

  1. Tách chiết DNA tổng số của các mẫu vi khuẩn H. pylori trong mảnh sinh thiết dạ dày của bệnh nhân được chỉ định nội soi tại Bệnh viện 19 - 8.
  2. Nghiên cứu thông tin về gen Cag A trên GenBank, thiết kế cặp mồi đặc hiệu và khuếch đại phân đoạn gen Cag A bằng phản ứng PCR.
  3. Giải trình tự nucleotide của vùng gen Cag A thu nhận được bằng phương pháp Sanger.
  4. Phân tích đặc điểm phân tử của gen Cag A, so sánh trình tự nucleotide và amino acid suy diễn với các chủng của Việt Nam và thế giới đã công bố trên GenBank; xây dựng cây phát sinh chủng loại của các chủng nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn H. pylori và phân đoạn gen kháng nguyên Cag A từ mẫu mô sinh thiết dạ dày của bệnh nhân viêm dạ dày. Phạm vi nghiên cứu về không gian bao gồm các mẫu bệnh phẩm thu nhận từ bệnh nhân nội soi tiêu hóa tại Bệnh viện 19 - 8 (Bộ Công an, Hà Nội); toàn bộ thực nghiệm sinh học phân tử được tiến hành tại Phòng Miễn dịch học thuộc Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phạm vi nghiên cứu về thời gian gồm các mẫu bệnh phẩm thu thập trong năm 2021, quá trình thực nghiệm và phân tích dữ liệu được thực hiện từ tháng 01/2022 đến tháng 07/2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Nghiên cứu được xây dựng trên hệ thống lý thuyết về hệ gen và cơ chế bệnh sinh phân tử của H. pylori. Hệ gen của H. pylori (đại diện là chủng tham chiếu 26695) là một nhiễm sắc thể tròn có kích thước khoảng 1,63 Mb, chứa khoảng 2.373 gen với hàm lượng G+C trung bình xấp xỉ 38,9%. Trong hệ gen có đảo gây bệnh Cag PAI với kích thước khoảng 40 kb gồm 31 khung đọc mở (ORF), được bao quanh bởi các đoạn lặp lại trực tiếp 31 bp và các trình tự chèn IS605, nằm giữa gen glr (mã hóa glutamate racemase) và orf5 (HP0519).

Gen Cag A có kích thước khoảng 3,5 kb nằm ở đầu 3' của đảo Cag PAI, mã hóa cho protein Cag A có khối lượng phân tử biến thiên từ 120 đến 145 kDa tùy thuộc số lượng các đoạn lặp lại. Cơ chế gây bệnh của Cag A diễn ra qua hệ thống bài tiết loại IV (T4SS) để tiêm trực tiếp protein vào tế bào biểu mô dạ dày. Sau khi vào tế bào chất, Cag A khu trú tại mặt trong màng sinh chất và trải qua quá trình phosphoryl hóa gốc tyrosine tại các motif Glu - Pro - Ile - Tyr - Ala (EPIYA) bởi kinase họ Src (c-Src, c-Abl) của vật chủ. Cag A đã phosphoryl hóa liên kết với phosphatase SHP-2, kích hoạt quá mức dòng tín hiệu Erk MAP kinase, gây biến đổi hình thái tế bào thành "kiểu hình chim ruồi" (hummingbird phenotype), làm mất tính phân cực tế bào và kích thích tế bào biểu mô tiết interleukin-8 (IL-8). Dựa vào trình tự flanking quanh motif EPIYA, vùng carboxyl-terminal của protein Cag A được chia thành 4 loại phân đoạn: EPIYA-A, EPIYA-B, EPIYA-C (đặc trưng cho các chủng phương Tây - Western type) và EPIYA-D (đặc trưng cho các chủng Đông Á - East Asian type). Các chủng mang motif EPIYA-D có ái lực gắn kết với SHP-2 mạnh hơn đáng kể so với motif EPIYA-C, do đó có độc tính tế bào cao hơn và liên quan chặt chẽ hơn đến nguy cơ ung thư dạ dày.

Về phương pháp thực nghiệm, nghiên cứu sử dụng quy trình sinh học phân tử chuẩn kết hợp công cụ tin sinh học:

  • Xử lý mẫu bệnh phẩm: 40 mẫu mảnh sinh thiết niêm mạc dạ dày dương tính với urease từ Bệnh viện 19 - 8 được làm bất hoạt nhiệt ở 100°C trong 20 phút nhằm đảm bảo an toàn sinh học, sau đó bảo quản ở -80°C.
  • Tách chiết DNA: Sử dụng bộ kít thương mại DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Mỹ), áp dụng quy trình ly giải mô bằng đệm ATL và enzyme Proteinase K tại 56°C, gắn DNA lên cột silica, rửa loại tạp chất bằng đệm AW1, AW2 và hòa tan DNA tổng số bằng đệm AE.
  • Kỹ thuật PCR: Sử dụng bộ hóa chất DreamTaq PCR Master Mix 2X (Thermo Scientific, Mỹ) trên máy PCR Astec 32 giếng (model 322, Nhật Bản). Thẩm định mẫu nhiễm H. pylori bằng cặp mồi khuếch đại đoạn gen 16S rDNA (kích thước 0,5 kb). Khuếch đại vùng biến đổi đầu 3' gen Cag A bằng cặp mồi đặc hiệu tự thiết kế (Cag A-F và Cag A-R, kích thước sản phẩm 1,2 kb).
  • Tinh sạch và kiểm tra sản phẩm: Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific, Mỹ) và kiểm tra kích thước phân tử bằng điện di trên gel agarose 1% pha trong đệm TAE 1X, nhuộm Ethidium Bromide 0,1%, quan sát và chụp ảnh trên hệ thống Dolphin-DOC (Wealtec, Mỹ).
  • Giải trình tự và phân tích dữ liệu: Sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự theo phương pháp Sanger trên máy đọc tự động ABI-3100 Avant Genetic Analyzer. Dữ liệu chromatogram (.ab1) và chuỗi nucleotide thô (.txt) được biên tập bằng các phần mềm Chromas và BioEdit. Căn chỉnh chuỗi và suy diễn chuỗi amino acid bằng phần mềm GENEDOC 2.7. Phân tích ma trận tương đồng nucleotide và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA X theo phương pháp liên kết láng giềng (Neighbor-Joining). Nguồn dữ liệu đối sánh gồm 34 trình tự tham chiếu thu thập từ cơ sở dữ liệu GenBank (16 chủng Việt Nam và 18 chủng quốc tế).

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Đặt vấn đề

Chương này phân tích tính cấp thiết của nghiên cứu dựa trên tỷ lệ nhiễm H. pylori cao tại các nước đang phát triển và mối đe dọa trực tiếp của loài vi khuẩn này đối với sức khỏe cộng đồng qua các bệnh lý dạ dày nghiêm trọng. Tác giả nhấn mạnh tính ưu việt của chẩn đoán phân tử so với các kỹ thuật lâm sàng truyền thống, chỉ rõ vai trò trung tâm của protein Cag A trong cơ chế bệnh sinh, từ đó xác lập mục tiêu, nội dung và ý nghĩa khoa học - thực tiễn của đề tài trong việc cung cấp dẫn liệu phân tử phục vụ nghiên cứu và phát triển công cụ chẩn đoán chuyên biệt tại Việt Nam.

Phần II: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa toàn diện các công trình nghiên cứu về H. pylori trên thế giới và tại Việt Nam:

  • Lịch sử và nguồn gốc phát sinh: Tóm lược tiến trình nghiên cứu từ các phát hiện vi khuẩn xoắn ốc thế kỷ 19 đến thực nghiệm tự nhiễm của Marshall và giải Nobel Y học năm 2005. So sánh phát sinh loài cho thấy vi khuẩn đã di cư cùng quần thể người từ châu Phi khoảng 58.000 năm trước và cư trú trong dạ dày người trên 115.000 năm.
  • Đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh: Mô tả hình thái vi khuẩn (dạng xoắn hoặc chữ S, dài 1,5 - 5 µm, dày 0,3 - 1 µm, có 4 - 7 roi đơn cực có vỏ bọc với móc hình sao giúp di chuyển xuyên qua lớp nhầy); hệ enzym urease thủy phân ure tạo lớp đệm amoniac trung hòa axit dạ dày; các protein màng ngoài (OMPs) như HopS, HopT (BabA, SabA) hỗ trợ bám dính vào kháng nguyên nhóm máu Lewis b; độc tố Vac A tạo không bào và hệ thống bài tiết loại IV.
  • Phương pháp chẩn đoán: Bảng tổng hợp ưu và nhược điểm của 8 phương pháp chẩn đoán xâm lấn và không xâm lấn (test thở ure, test phân, huyết thanh học, nội soi, test nhanh urease, nuôi cấy, mô bệnh học và PCR).
  • Cấu trúc gen Cag A và đảo Cag PAI: Cơ chế tương tác của Cag A sau phosphoryl hóa với phosphatase SHP-2 và kinase Csk; cấu trúc phân tử các motif EPIYA và sự khác biệt giữa hai nhóm kiểu gen phương Tây (EPIYA-ABC) và Đông Á (EPIYA-ABD).
  • Tình hình nghiên cứu dịch tễ và kiểu gen: Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn theo khu vực địa lý toàn cầu (châu Phi 70,1%, Nam Mỹ 69,4%, Tây Á 66,6%, Tây Âu 34,3%); các công trình nghiên cứu biến thể Cag A tại Iraq, Trung Quốc, Malaysia, Maroc, Thái Lan. Tại Việt Nam, tổng thuật các nghiên cứu dịch tễ của Nguyễn Văn Bàng trên trẻ em (tỷ lệ nhiễm chung 37,6%), nghiên cứu của Bùi Chí Nam về kiểu gen Cag A phương Tây ở người Ê đê tại Đắk Lắk (77,1%), và các nghiên cứu của Lê Quý Hưng, Trần Việt Hùng, Trần Thiện Trung về mối liên quan giữa Cag A, Vac A với ung thư dạ dày.

Phần III: Vật liệu, phương pháp và nội dung nghiên cứu

Nội dung chương trình bày chi tiết quy cách thu thập và thiết kế thực nghiệm:

  • Đối tượng và hóa chất: 40 mẫu mô sinh thiết dạ dày; thông số các bộ kít thương mại (QIAGEN, Thermo Scientific); thông tin hóa chất điện di (Agarose, TAE, Loading Dye, Ethidium Bromide).
  • Quy trình thực nghiệm: Mô tả chi tiết 9 bước tách chiết DNA mô sinh thiết bằng bộ DNeasy Blood & Tissue Kit. Trình bày thông số cặp mồi, thành phần hóa chất phản ứng PCR 25 µl và chu trình nhiệt chuẩn.
  • Quy trình tinh sạch và giải trình tự: 5 bước tinh sạch sản phẩm PCR bằng cột lọc silica; thao tác điện di gel agarose 1% ở hiệu điện thế 110V trong 25 - 30 phút; quy trình giải trình tự Sanger tự động trên máy ABI-3100.
  • Phương pháp tin sinh học: Danh mục 34 chủng H. pylori tham chiếu từ GenBank kèm mã số truy cập (Việt Nam 16 chủng như HN021, HC061, VietnamHP-No23; Nhật Bản 6 chủng; Indonesia 4 chủng; Trung Quốc, Thái Lan, Colombia, Mexico, Kenya, Peru, Úc, Paraguay); phương pháp phân tích và căn chỉnh chuỗi bằng phần mềm GENEDOC 2.7; thuật toán Neighbor-Joining trên phần mềm MEGA X để dựng cây phả hệ.

Phần IV: Kết quả và thảo luận

Chương thực nghiệm cung cấp các dữ liệu định lượng và phân tích hình ảnh:

  • Kết quả tách chiết DNA tổng số: Điện di kiểm tra trên gel agarose 1% đối với 5 mẫu đại diện (Hp5, Hp13, Hp102a, Hp9, Hp201) so với thang chuẩn DNA phage Lambda cắt bằng HindIII cho thấy các vạch DNA kích thước lớn, sáng rõ, ít bị đứt gãy và không nhiễm tạp chất, đạt tiêu chuẩn làm khuôn cho phản ứng PCR.
  • Kết quả khuếch đại 16S rDNA: Phản ứng PCR với cặp mồi Hp-16S thu được sản phẩm có kích thước đặc hiệu khoảng 0,5 kb, thẩm định chính xác sự hiện diện của H. pylori trong mẫu bệnh phẩm.
  • Kết quả khuếch đại vùng 3' gen Cag A: PCR với cặp mồi tự thiết kế cho ra băng sản phẩm đơn nhất, đặc hiệu ở kích thước khoảng 1,2 kb; sản phẩm sau tinh sạch bằng kit GeneJET đạt độ tinh sạch cao để giải trình tự.
  • Đặc điểm phân tử và motif EPIYA: Căn chỉnh chuỗi amino acid suy diễn của 5 chủng phân lập (Hp5, Hp13, Hp102a, Hp9, Hp201) xác định cả 5 chủng đều mang motif EPIYA-A, EPIYA-B và EPIYA-D ở đầu 3' của protein Cag A, hoàn toàn thuộc nhóm kiểu gen Đông Á (East Asian type). Không có chủng nào mang motif EPIYA-C của phương Tây.
  • Độ tương đồng nucleotide và phân tích phả hệ: Ma trận so sánh thành phần nucleotide cho thấy các chủng nghiên cứu có độ tương đồng trên 90% so với các chủng nhóm Đông Á và Việt Nam trên GenBank, trong khi độ tương đồng với các chủng phương Tây rất thấp (chỉ đạt từ 80,10% đến 80,92%). Cây phát sinh chủng loại (Neighbor-Joining) phân lập rõ rệt các chủng nghiên cứu thành cụm riêng biệt, nằm chung nhánh phát sinh với các chủng H. pylori Việt Nam đã công bố trước đây.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã ghi nhận các kết quả thực nghiệm và số liệu cụ thể được tổng hợp trong các bảng dữ liệu sau:

Thông số kỹ thuật mồi PCR Gen đích Trình tự mồi (5’ – 3’) Kích thước sản phẩm
Hp-16S-F / Hp-16S-R 16S rDNA TAAGAGATCAGCCTATGTCC / TCCCACGCTTTAAGCGCAAT 0,5 kb (500 bp)
Cag A-F / Cag A-R 3' gen Cag A TGGAAAAAATTCTGATCTAC / TTAAGATTTTTGGAAACCAC 1,2 kb (1.200 bp)
Thành phần phản ứng PCR (tổng 25 µl) Thể tích sử dụng Chu trình nhiệt PCR Thông số nhiệt độ và thời gian
DreamTaq PCR Master Mix (2X) 12,5 µl Biến tính ban đầu 94°C trong 5 phút (1 chu kỳ)
Mồi xuôi (10 pmol/µl) 1,0 µl Chu kỳ khuếch đại (35 chu kỳ) 94°C (30 giây) – 55°C (30 giây) – 72°C (1 phút)
Mồi ngược (10 pmol/µl) 1,0 µl Kéo dài bổ sung 72°C trong 10 phút (1 chu kỳ)
Dimethyl sulfoxide (DMSO) 1,0 µl Làm lạnh 4°C (≤ 24 giờ)
DNA khuôn 2,0 µl Bảo quản mẫu -20°C
Nước khử ion 7,5 µl - -
Mẫu nghiên cứu Bệnh viện 19 - 8 Sản phẩm PCR 16S rDNA Sản phẩm PCR vùng 3' gen Cag A Cấu trúc motif EPIYA suy diễn Nhóm kiểu gen Cag A
Hp5 0,5 kb 1,2 kb EPIYA - A - B - D Đông Á (East Asian)
Hp13 0,5 kb 1,2 kb EPIYA - A - B - D Đông Á (East Asian)
Hp102a 0,5 kb 1,2 kb EPIYA - A - B - D Đông Á (East Asian)
Hp9 0,5 kb 1,2 kb EPIYA - A - B - D Đông Á (East Asian)
Hp201 0,5 kb 1,2 kb EPIYA - A - B - D Đông Á (East Asian)

Về mức độ tương đồng chuỗi nucleotide, các phân tích chỉ rõ:

  • Tỷ lệ tương đồng giữa 5 chủng nghiên cứu với các chủng thuộc nhóm Đông Á (Việt Nam, Nhật Bản, Trung Quốc) đạt trên 90%.
  • Tỷ lệ tương đồng giữa các chủng nghiên cứu với các chủng thuộc nhóm phương Tây (Tây Âu, Châu Mỹ) chỉ đạt từ 80,10% đến 80,92%.

Các đóng góp mới của đề tài do tác giả công bố gồm:

  1. Đã thiết kế thành công cặp mồi đặc hiệu để nhân bản và giải trình tự phân đoạn nucleotide vùng đầu 3' của gen Cag A ở các chủng H. pylori phân lập từ bệnh nhân viêm dạ dày tại Bệnh viện 19 - 8.
  2. Xác định chính xác cấu trúc motif phosphoryl hóa tyrosine của cả 5 chủng nghiên cứu đều mang dạng EPIYA-A-B-D đặc trưng cho khu vực Đông Á – kiểu motif có hoạt tính gây độc tế bào và nguy cơ sinh ung cao.
  3. So sánh đối chiếu trình tự thu nhận được với ngân hàng dữ liệu GenBank quốc tế và xây dựng thành công cây phát sinh chủng loại, chứng minh mối quan hệ di truyền gần gũi nhất của các chủng nghiên cứu với các chủng H. pylori tại Việt Nam.
  4. Cung cấp dữ liệu sinh học phân tử làm cơ sở khoa học để định hướng nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm (kit) chẩn đoán bệnh lý dạ dày bằng chỉ thị phân tử tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận có một số hạn chế căn cứ trên phạm vi và nội dung thực nghiệm được trình bày trong văn bản:

  • Quy mô mẫu phân tích giải trình tự chuyên sâu còn hạn chế: Mặc dù thu nhận 40 mẫu sinh thiết dạ dày từ bệnh nhân, tác giả mới chỉ thực hiện phân tích và công bố kết quả giải trình tự nucleotide, phân tích motif và dựng cây phả hệ chi tiết trên 5 chủng đại diện (Hp5, Hp13, Hp102a, Hp9, Hp201).
  • Phạm vi mục tiêu phân tử chỉ tập trung vào phân đoạn 1,2 kb ở đầu 3' của gen Cag A và đoạn 0,5 kb gen 16S rDNA; chưa thực hiện giải trình tự toàn bộ chiều dài gen Cag A (3,5 kb) hay toàn bộ hệ gen (whole genome sequencing) của các chủng phân lập.
  • Nghiên cứu chưa phân tích đồng thời các locus gen độc lực quan trọng khác đã được tổng quan (như Vac A, Ice A, Bab A, Hop Z) trên cùng tập mẫu để đánh giá tổ hợp kiểu gen hoàn chỉnh.
  • Chưa có số liệu đối chiếu dịch tễ học và lâm sàng chi tiết giữa các biến thể nucleotide với mức độ tổn thương mô bệnh học dạ dày thực tế của từng bệnh nhân tại bệnh viện.

Hướng nghiên cứu tiếp được đề xuất dựa trên các hạn chế trên bao gồm việc mở rộng quy mô giải trình tự trên số lượng mẫu bệnh phẩm lớn hơn; phối hợp phân tích đa locus độc lực (Cag A, Vac A, Ice A) và ứng dụng các kết quả thiết kế mồi vào thử nghiệm chế tạo kit chẩn đoán phân tử phục vụ lâm sàng.

Giá trị tham khảo

Khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với:

  • Đối tượng: Sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Sinh học phân tử, Y sinh học và các bác sĩ chuyên khoa Tiêu hóa.
  • Nội dung tham khảo hữu ích:
    • Quy trình xử lý và bất hoạt nhiệt mẫu sinh thiết niêm mạc dạ dày phục vụ tách chiết DNA an toàn, hạn chế tối đa nguy cơ lây nhiễm sinh học.
    • Quy trình kỹ thuật chuẩn về tách chiết DNA từ mẫu mô động vật/người sử dụng cột ly tâm silica; thành phần phản ứng và chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA và phân đoạn 3' gen Cag A.
    • Thông số thiết kế cặp mồi đặc hiệu Cag A-F và Cag A-R phục vụ khuếch đại vùng biến đổi của gen Cag A.
    • Phương pháp xử lý chuỗi giải trình tự Sanger và quy trình ứng dụng các phần mềm tin sinh học (BioEdit, GENEDOC, MEGA X) để căn chỉnh chuỗi, suy diễn chuỗi amino acid, nhận diện motif chức năng và dựng cây phát sinh loài vi sinh vật.

Câu hỏi thường gặp

1. Nghiên cứu sử dụng cặp mồi nào để khuếch đại vùng biến đổi đầu 3' của gen Cag A và sản phẩm PCR có kích thước bao nhiêu?
Nghiên cứu sử dụng cặp mồi đặc hiệu tự thiết kế là Cag A-F (5'-TGGAAAAAATTCTGATCTAC-3') và Cag A-R (5'-TTAAGATTTTTGGAAACCAC-3'). Kích thước sản phẩm khuếch đại PCR thu nhận được là 1,2 kb (khoảng 1.200 bp).

2. Cấu trúc motif EPIYA của các chủng H. pylori phân lập tại Bệnh viện 19 - 8 thuộc dạng nào và mang đặc điểm gì?
Kết quả căn chỉnh chuỗi amino acid suy diễn xác định cả 5 chủng nghiên cứu (Hp5, Hp13, Hp102a, Hp9, Hp201) đều mang motif EPIYA-A-B-D ở đầu 3' của protein Cag A. Cấu trúc này thuộc nhóm kiểu gen Đông Á (East Asian Cag A), trong đó phân đoạn EPIYA-D có ái lực gắn kết với phosphatase SHP-2 cao hơn phân đoạn EPIYA-C của các chủng phương Tây.

3. Tỷ lệ tương đồng nucleotide vùng 3' gen Cag A giữa các chủng nghiên cứu với các chủng trên thế giới được ghi nhận như thế nào?
Độ tương đồng thành phần nucleotide giữa 5 chủng nghiên cứu với các chủng thuộc nhóm Đông Á (Việt Nam, Nhật Bản, Trung Quốc) đạt trên 90%. Ngược lại, mức độ tương đồng giữa các chủng nghiên cứu với các chủng thuộc nhóm phương Tây rất thấp, chỉ dao động trong khoảng từ 80,10% đến 80,92%.

4. Mục đích của việc kiểm tra mẫu bệnh phẩm bằng phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA là gì?
Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA sử dụng cặp mồi Hp-16S-F và Hp-16S-R (kích thước sản phẩm 0,5 kb) nhằm mục đích thẩm định và khẳng định chính xác sự hiện diện của vi khuẩn H. pylori trong mẫu mô sinh thiết dạ dày đã có xét nghiệm urease dương tính, trước khi tiến hành khuếch đại vùng gen độc lực Cag A.

5. Mẫu bệnh phẩm mảnh sinh thiết dạ dày được xử lý an toàn sinh học ban đầu theo quy trình nào trước khi tách chiết DNA?
Mẫu bệnh phẩm sau khi vận chuyển lạnh từ Bệnh viện 19 - 8 về phòng thí nghiệm được tiến hành bất hoạt nhiệt ở 100°C trong thời gian 20 phút để tiêu diệt các mầm bệnh truyền nhiễm, sau đó được bảo quản ở nhiệt độ -80°C cho đến khi thực hiện các bước tách chiết DNA tổng số.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Công Toán đã giải mã và phân tích thành công đặc điểm phân tử vùng đầu 3' gen kháng nguyên Cag A của các chủng vi khuẩn Helicobacter pylori phân lập từ bệnh nhân viêm dạ dày tại Bệnh viện 19 - 8 Hà Nội. Kết quả thực nghiệm xác định 100% các chủng phân tích đều mang motif EPIYA-A-B-D thuộc nhóm kiểu gen Đông Á, có mức độ tương đồng nucleotide trên 90% với các chủng trong khu vực và có quan hệ phả hệ gần gũi nhất với các chủng vi khuẩn tại Việt Nam đã công bố trên GenBank. Công trình cung cấp dẫn liệu khoa học xác thực về mặt di truyền vi sinh vật y học, tạo cơ sở cho việc nghiên cứu và định hướng phát triển các bộ kít chẩn đoán bệnh lý dạ dày bằng chỉ thị sinh học phân tử.