CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm, khả năng gây bệnh và phác đồ điều trị vi khuẩn Helicobacter pylori 1.1 Đặc điểm vi khuẩn Helicobacter pylori 1.1 Hình dạng vi khuẩn Helicobacter pylori là vi khuẩn hình xoắn, hơi cong, gram âm, đường kính 0,3 - 1,0 µm, dài 1,5 - 5 µm. Trong bệnh phẩm sinh thiết niêm mạc dạ dày - tá tràng, khi nhuộm gram vi khuẩn có hình cong, mảnh (hình cánh chim hải âu, hình dấu ngã, chữ S,…) [5].2 Tính chất nuôi cấy Helicobacter pylori là vi khuẩn rất khó nuôi cấy, thuộc nhóm vi hiếu khí, chỉ mọc được trên môi trường chọn lọc và giàu dinh dưỡng như thạch máu (Muller Hinton Horse Blood Agar [15]) với pH từ 5,5 - 8,5 (tối ưu ở pH trung tính) [5]. Cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn một số kháng sinh như: Amphotericin , Trimethoprin, Nalidixic acid, Vancomycin, Polymycin để ức chế sự phát triển của vi nấm và một số vi khuẩn khác [5]. Khi nuôi cấy Helicobacter pylori cần 3 - 5% O2 , 5% - 10% CO2 và ủ ở 370C [5].3 Tính chất sinh hóa Helicobacter pylori không phân giải hydrat cacbon, không lên men và không oxi hóa.
Nhưng chúng lại có men urease hoạt động mạnh nhất trong các loại vi khuẩn có khả năng sinh sản ra men urease để phân hủy ure trong dạ dày tạo môi trường kiềm hóa bao quanh vi khuẩn giúp vi khuẩn sống được trong môi trường acid của dịch vị. Helicobacter pylori cũng có hoạt tính mạnh về catalase, oxidase, phosphatase kiềm và acid, không khử được nitrat cũng như không phân giải hipurat [9].2 Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Helicobacter pylori Viêm dạ dày được dùng để chỉ tất cả các trường hợp chậm tiêu mà không có tổn thương thực thể nào được xác định. Với bác sĩ nội soi, trước tiên nó gợi ra khi có một sự biến đổi về màu sắc niêm mạc, đối với nhà điện quang khi có sự biến đổi của nếp niêm mạc dạ dày [7]. Loét dạ dày - tá tràng là một bệnh mạn tính, diễn biến có tính chu kỳ.
Tổn thương là những ổ loét ở niêm mạc dạ dày - tá tràng, ổ loét này có thể xâm lấn sâu hơn qua lớp dưới niêm mạc, vị trí ổ loét ở dạ dạ dày hoặc hành tá tràng [10].1 Đường lây Helicobacter pylori lây truyền từ người sang người thông qua các đường: dạ dày - miệng, miệng - miệng, phân - miệng [16].2 Cơ chế gây bệnh Helicobacter pylori gây viêm kéo dài trong dạ dày người có khả năng tiết men urease phân giải ure thành ammoniac. Ammoniac có phản ứng kiềm tạo thành lớp đệm bao quanh vi khuẩn giúp tránh môi trường acid trong dạ dày. Mặt khác amoniac sinh ra cũng gây độc trực tiếp đối với niêm mạc dạ dày. Các men catalase, lipase và glycoproteinase của Helicobacter pylori phân giải chất nhầy giúp cho chúng xâm nhập vào niêm mạc sâu hơn và bộc lộ các thụ thể tế bào giúp cho Helicobacter pylori gắn vào đó và dần phá hủy tế bào.
Helicobacter pylori cũng tiết ra các độc tố tế bào, các độc tố này cũng gây độc và phá hủy tế bào gây hoại tử, tổn thương, viêm [9].3 Đặc điểm lâm sàng và vị trí tổn thương của bệnh nhân viêm dạ dày - tá tràng do nhiễm Helicobacter pylori Viêm dạ dày – tá tràng do nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori thường mắc phải từ sớm với các triệu chứng rất thường gặp trên lâm sàng như đau bụng vùng thượng vị, nóng rác thượng vị, ợ hơi, ợ chua, đầy bụng khó tiêu, 5 buồn nôn và nôn [10]. Bệnh viêm dạ dày – tá tràng do nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori thường khởi phát với hình ảnh viêm ở hang vị, rồi đến thân vị hoặc viêm toàn bộ dạ dày [44]. Nếu không được điều trị tiệt trừ, 100% bệnh nhân nhiễm Helicobacter pylori giai đoạn cấp sẽ chuyển thành viêm mạn, trong đó 20% viêm mạn ở vị trí hang vị sẽ dẫn đến loét tá tràng, 10% viêm dạ dày thân vị hoặc viêm teo đa ổ chuyển thành loét dạ dày và 2% sẽ tiến triển thành ung thư dạ dày [26].3 Phác đồ điều trị vi khuẩn Helicobacter pylori Hướng dẫn điều trị Helicobacter pylori theo đồng thuận Maasstricht IV [40] ảng 1.1 Phác đồ điều trị Helicobacter pylori Tỉ lệ đề kháng với kháng sinh clarithromycin trong vùng < 20% ≥ 20% Điều trị PPI + clarithromycin Phác đồ 4 thuốc có bismuth, lần đầu (Amoxicillin/metronidazole) nếu không có sẵn hoặc Phác đồ 4 thuốc không bismuth Phác đồ 4 thuốc có bismuth (nối tiếp hoặc đồng thời) Điều trị Phác đồ 4 thuốc có bismuth PPI + LVX + AMX sau thất bại hoặc lần đầu PPI + LVX + AMX Điều trị Điều trị tiệt trừ dựa vào test nhạy cảm kháng sinh Helicobacter sau 2 lần pylori thất bại 6 1.4 Một số kỹ thuật xét nghiệm xác định nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori hiện nay 1.1 Xét nghiệm nhanh Xét nghiệm test nhanh kháng nguyên Helicobacter pylori Nguyên lý: Phát hiện định tính nhanh kháng nguyên của Helicobacter pylori trong phân người theo nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch. Kỹ Thuật: Để mẫu, túi đựng test và dung dịch xét nghiệm về nhiệt độ phòng trước khi tiến hành xét nghiệm.
Hút dung môi pha loãng lên tới vạch rồi nhỏ vào ống nghiệm. Thực hiện thao tác này 2 lần. Dùng tăm bông lấy khoảng 50 mg phân đưa vào ống nghiệm và xoay tăm bông khoảng 10 lần. Sau đó ép chặt tăm bông lên thành ống nghiệm rồi loại bỏ tăm bông.
Đậy nắp nhỏ giọt vào ống nghiệm. Nhỏ 3 giọt dung dịch pha loãng vào giếng đặt mẫu. Đọc kết quả sau 10-15 phút, không được đọc sau 15 phút. Dương tính khi trên thanh thử xuất hiện 2 vạch màu: C là vạch chứng (Control), T là vạch thử nghiệm (Test).
Chỉ xuất hiện 1 vạch C là âm tính [1]. Xét nghiệm test nhanh kháng thể kháng Helicobacter pylori Nguyên lý: Xét nghiệm nhanh kháng thể IgG và CIM dựa trên nguyên lý kỹ thuật sắc ký miễn dịch gián tiếp. Kỹ thuật: Nếu bệnh phẩm là huyết thanh/huyết tương: Hút 25 l bệnh phẩm nhỏ vào giếng hình vuông. Chờ tới khi bệnh phẩm di chuyển tới vạch màu hồng Just past (vạch A) thì nhỏ 2 giọt Chase buffer vào giếng hình tròn đầu thanh thử.
Kéo miếng mika có chữ HP cho tới khi gặp sức cản không kéo được nữa thì nhỏ 1 giọt Chase buffer vào giếng nhỏ bệnh phẩm hình vuông. Nếu bệnh phẩm là máu toàn phần: Hút 25 l bệnh phẩm nhỏ vào giếng nhỏ bệnh phẩm hình vuông, nhỏ 1 giọt Chase buffer vào giếng. Chờ tới khi bệnh phẩm di chuyển tới vạch màu hồng Just past (vạch A) thì nhỏ 3 giọt Chase buffer vào giếng hình tròn đầu thanh thử. Đọc kết quả trong vòng 15 phút.
7 Hiện tượng Kết quả Vạch A (chứng) Vạch (CIM) Vạch C (IgG) + + + Dương tính + - + Dương tính + - - Âm tính - ± ± Không có giá trị + + - Không có giá trị Nếu chỉ có IgG dương tính: Người bệnh đã từng nhiễm Helicobacter pylori. Nếu cả IgG và CIM dương tính: Người bệnh hiện đang bị nhiễm Helicobacter pylori [1].2 Nuôi cấy, định danh vi khuẩn Helicobacter pylori Nguyên lý: Sử dụng môi trường chọn lọc để phân lập, phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori. Định danh dựa trên các đặc điểm nuôi cấy, một số tính chất sinh hóa, các đặc điểm về hình thái học. Kỹ thuật: Lấy bệnh phẩm mảnh sinh thiết dạ dày qua ống nội soi.
Chuyển bệnh phẩm sinh thiết vào nước muối sinh lý vô trùng vận chuyển đến khoa xét nghiệm Vi sinh. Tiến hành kỹ thuật nhuộm Gram và nuôi cấy, ủ ở môi trường vi hiếu khí, ấm 35- 37 độ trong 3 - 7 ngày. Định danh trên môi trường nuôi cấy, khuẩn lạc nghi ngờ Helicobacter pylori là những khuẩn lạc nhỏ, không màu. Nhuộm Gram có hình cong, xoắn nhẹ, Gram âm, oxydase (+), catalase (+) và urease (+).Từ đĩa nuôi cấy có khuẩn lạc vi khuẩn Helicobacter pylori thuần khiết: Tạo huyền dịch vi khuẩn nồng độ 3 McFarland trong canh thang Mueller Hinton + 5% huyết thanh ngựa hoặc canh thang BHI + 5% huyết thanh ngựa.
Sau khi ria đều vi khuẩn lên mặt thạch, đặt E-test lên mặt thạch sao cho mặt có ghi dải nồng độ hướng lên trên và phải đảm bảo toàn bộ bề mặt của thanh E-test được tiếp xúc hoàn toàn với 8 mặt thạch; đặt tối đa 1 thanh E-test trên đĩa 90mm. Đặt đĩa thạch vào trong bình Jar có túi tạo môi trường vi hiếu khí, ủ ấm 35- 37oC, 72 giờ [1],[15]. Nuôi cấy có thể âm tính giả nếu người bệnh gần đây đã dùng các thuốc kháng sinh hoặc chất ức chế bơm Proton, nên dừng thuốc ức chế bơm Proton 2 tuần và thuốc kháng sinh 4 tuần trước khi nội soi để có kết quả chính xác.3 Xét nghiệm miễn dịch Nguyên lý: Xác định định tính kháng thể IgM hoặc IgG hoặc IgA dựa trên nguyên lý của kỹ thuật Elisa (miễn dịch gắn enzym). Kỹ thuật: ộ sinh phẩm Serion Elisa classic H.
pylori IgA/IgG/IgM (Serion). Để sinh phẩm về nhiệt độ phòng 30 phút trước khi làm xét nghiệm, sắp xếp bệnh phẩm và viết sơ đồ theo thứ tự. Chuẩn bị dung dịch rửa. Pha loãng chứng và mẫu bệnh phẩm.
Xử lý trước mẫu với chất hấp thụ yếu tố dạng thấp (RF) trước khi phát hiện IgM. Cho chứng (1 giếng trống, 1 chứng âm, 2 giếng chuẩn) và bệnh phẩm vào các giếng của phiến nhựa theo hướng dẫn của quy trình. Đậy tấm và ủ. Rửa phiến nhựa.
Chuẩn bị chất cộng hợp. Đậy tấm và ủ. Rửa phiến nhựa. Nhỏ dung dịch hiện màu vào mỗi giếng.
Ủ phiến nhựa, không đậy tấm và tránh ánh sáng. Nhỏ dung dịch dừng phản ứng. Đọc độ hấp thụ bước sóng 405 và 650nm trong vòng 30 phút sau khi dừng phản ứng. Đọc kết quả: OD giếng trống phải < 0.
Chứng âm phải cho kết quả âm tính. Giá trị OD của chứng dương và giá trị OD trung bình của huyết thanh chuẩn phải trong khoảng tham chiếu hợp lệ ghi trong giấy kiểm tra chất lượng bộ kit. Sự dao động giá trị OD của huyết thanh chuẩn không được cao hơn 20%. Nếu một trong các điều kiện trên không đạt, chạy lại xét nghiệm.
Đánh giá xét nghiệm dựa trên giấy chứng nhận kiểm tra chất lượng đặc hiệu số lô với đường chuẩn có trong các bộ thuốc thử để các giá trị OD thu 9 được có thể phản ánh sự hoạt động của kháng thể tương ứng. Giá trị OD của giếng trống phải được trừ ra trước khi tính toán. Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thông thường do: Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn. Chứng âm và những mẫu bệnh phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/ huyết tương có nồng độ kháng thể cao.