Luận án nghiên cứu vi khuẩn gây viêm phổi thở máy và gene kháng thuốc - ĐH Y Dược TP.HCM

Nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy và gene kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử, cung cấp thông tin quan trọng cho y học.

• Tác giả: Trần Minh Giang
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Văn Ngọc
• Trường học: Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Hồi sức cấp cứu và chống độc
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Nhân Vi Khuẩn Gây Viêm Phổi Thở Máy và Gene Kháng Thuốc
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ Y Học
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tỉ lệ mới mắc của viêm phổi thở máy
• 1.2. Tỉ lệ tử vong
• 1.3. Các yếu tố nguy cơ
• 1.4. Thực hiện kháng sinh đồ trên vi khuẩn phân lập đƣợc từ VPTM
• 1.5. Ứng dụng sinh học phân tử trong phát hiện gene kháng thuốc
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 2.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Thời gian nghiên cứu
• 2.4. Đối tượng nghiên cứu. Cỡ mẫu và công thức tính cỡ mẫu
• 2.5. Tiêu chuẩn chọn mẫu
• 2.6. Phương pháp tiến hành
• 2.7. Thu thập số liệu và phân tích dữ liệu
• 2.8. Đạo đức trong nghiên cứu
• 2.9. Liệt kê và định nghĩa các biến số
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đặc điểm chung. Định danh vi khuẩn dựa trên vi sinh kinh điển
• 3.2. Định danh vi khuẩn dựa trên giải trình tự gene 16S-rRNA
• 3.3. Tổng số loài vi khuẩn phát hiện đƣợc trên từng mẫu dịch rửa phế quản phế nang
• 3.4. So sánh giữa giải trình tự gene 16S-rRNA và vi sinh kinh điển trong định danh vi khuẩn
• 3.5. Thời gian nằm ICU và tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy
• 3.6. Kết quả kháng sinh đồ
• 3.7. Kết quả kháng sinh đồ MIC dựa trên E-test
• 3.8. Kết quả PCR tìm gene kháng thuốc
• 3.9. Kết quả điều trị
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Định danh vi khuẩn
• 4.2. Kết quả kháng sinh đồ
• 4.3. Xác định gene kháng thuốc và mối liên quan với đề kháng kháng sinh
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Vi Khuẩn Gây Viêm Phổi Thở Máy

Nghiên cứu về vi khuẩn gây viêm phổi thở máy (VPTM) là một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. VPTM không chỉ là một vấn đề lâm sàng nghiêm trọng mà còn là một thách thức lớn trong điều trị. Tại Việt Nam, tỉ lệ mắc VPTM dao động từ 20% đến 52%, cho thấy sự cần thiết phải nghiên cứu sâu hơn về các tác nhân gây bệnh và cơ chế kháng thuốc. Việc xác định chính xác gene kháng thuốc và các loại vi khuẩn gây bệnh sẽ giúp cải thiện hiệu quả điều trị và giảm tỉ lệ tử vong.

1.1. Định Nghĩa Viêm Phổi Thở Máy và Tác Nhân Gây Bệnh

Viêm phổi thở máy được định nghĩa là viêm nhu mô phổi xảy ra sau 48 giờ thở máy qua nội khí quản. Các tác nhân gây bệnh chủ yếu bao gồm các loại vi khuẩn như Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa và Klebsiella pneumoniae. Việc xác định chính xác các tác nhân này là rất quan trọng để có phương pháp điều trị hiệu quả.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Gene Kháng Thuốc

Nghiên cứu về gene kháng thuốc giúp xác định các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để kháng lại các loại kháng sinh. Điều này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về sự phát triển của kháng sinh mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới. Việc phát hiện gene kháng thuốc cũng giúp theo dõi sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc trong cộng đồng.

II. Vấn Đề Kháng Thuốc Trong Vi Khuẩn Gây Viêm Phổi Thở Máy

Kháng thuốc là một trong những thách thức lớn nhất trong điều trị viêm phổi thở máy. Sự gia tăng của các chủng vi khuẩn kháng thuốc đã làm cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn. Theo nghiên cứu, tỉ lệ vi khuẩn kháng thuốc tại Việt Nam đang gia tăng nhanh chóng, đặc biệt là các chủng như Acinetobacter baumannii. Việc hiểu rõ về tình hình kháng thuốc sẽ giúp các bác sĩ có những quyết định điều trị chính xác hơn.

2.1. Tình Hình Kháng Thuốc Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, tỉ lệ vi khuẩn kháng thuốc đang gia tăng đáng kể. Nghiên cứu cho thấy rằng tỉ lệ kháng thuốc của Acinetobacter baumannii đã tăng từ 6,7% vào năm 2001 lên đến 90% vào năm 2012. Điều này cho thấy sự cần thiết phải có các biện pháp kiểm soát và giám sát chặt chẽ hơn.

2.2. Các Yếu Tố Góp Phần Vào Kháng Thuốc

Nhiều yếu tố góp phần vào sự phát triển của kháng thuốc, bao gồm việc sử dụng kháng sinh không hợp lý, điều trị không đúng cách và sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viện. Việc nâng cao nhận thức về kháng thuốc trong cộng đồng và trong các cơ sở y tế là rất quan trọng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Gene Kháng Thuốc Trong Vi Khuẩn

Phương pháp nghiên cứu gene kháng thuốc trong vi khuẩn gây viêm phổi thở máy thường sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử như PCR và giải trình tự gene 16S-rRNA. Những phương pháp này cho phép xác định chính xác các loại vi khuẩn và gene kháng thuốc, từ đó giúp cải thiện quy trình điều trị. Việc áp dụng các công nghệ mới trong nghiên cứu sẽ mang lại nhiều lợi ích cho việc điều trị và phòng ngừa bệnh.

3.1. Kỹ Thuật PCR Trong Phát Hiện Gene Kháng Thuốc

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để phát hiện gene kháng thuốc. Phương pháp này cho phép khuếch đại các đoạn DNA cụ thể, giúp xác định sự hiện diện của các gene kháng thuốc trong vi khuẩn một cách nhanh chóng và chính xác.

3.2. Giải Trình Tự Gene 16S rRNA Trong Định Danh Vi Khuẩn

Giải trình tự gene 16S-rRNA là một phương pháp mạnh mẽ trong việc định danh vi khuẩn. Phương pháp này cho phép xác định các loài vi khuẩn một cách chính xác, từ đó giúp các bác sĩ có thể đưa ra phương pháp điều trị phù hợp hơn cho bệnh nhân mắc viêm phổi thở máy.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Gene Kháng Thuốc

Nghiên cứu về gene kháng thuốc không chỉ có giá trị trong việc hiểu rõ hơn về cơ chế kháng thuốc mà còn có ứng dụng thực tiễn trong điều trị. Việc phát hiện sớm các gene kháng thuốc sẽ giúp bác sĩ lựa chọn kháng sinh phù hợp, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị và giảm tỉ lệ tử vong. Các ứng dụng này đang được nghiên cứu và phát triển tại nhiều cơ sở y tế.

4.1. Cải Thiện Quy Trình Điều Trị Bệnh Nhân

Việc phát hiện sớm các gene kháng thuốc giúp bác sĩ có thể điều chỉnh phác đồ điều trị kịp thời. Điều này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả điều trị mà còn giảm thiểu nguy cơ lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viện.

4.2. Giảm Tỉ Lệ Tử Vong Do Viêm Phổi Thở Máy

Nghiên cứu cho thấy rằng việc áp dụng các phương pháp phát hiện gene kháng thuốc có thể giúp giảm tỉ lệ tử vong do viêm phổi thở máy. Bằng cách điều trị kịp thời và chính xác, bệnh nhân có thể hồi phục nhanh chóng hơn.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Vi Khuẩn Gây Viêm Phổi Thở Máy

Nghiên cứu về vi khuẩn gây viêm phổi thở máy và gene kháng thuốc là một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. Việc hiểu rõ về các tác nhân gây bệnh và cơ chế kháng thuốc sẽ giúp cải thiện quy trình điều trị và giảm tỉ lệ tử vong. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong việc điều trị và phòng ngừa viêm phổi thở máy.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Gene Kháng Thuốc

Tương lai của nghiên cứu gene kháng thuốc hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong việc phát hiện và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Các công nghệ mới sẽ giúp nâng cao khả năng phát hiện và điều trị hiệu quả hơn.

5.2. Vai Trò Của Nghiên Cứu Trong Y Học Hiện Đại

Nghiên cứu về vi khuẩn và gene kháng thuốc đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện sức khỏe cộng đồng. Việc phát hiện và điều trị kịp thời sẽ giúp giảm thiểu các bệnh lý nghiêm trọng và nâng cao chất lượng cuộc sống.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Công trình khoa học mang tên "Nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy và gene kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử" do nghiên cứu sinh Trần Minh Giang thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Trần Văn Ngọc, bảo vệ tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh năm 2020. Luận án thuộc chuyên ngành Hồi sức cấp cứu và chống độc (Mã số: 62720122).

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Viêm phổi thở máy (VPTM) là một trong những vấn đề lâm sàng nghiêm trọng hàng đầu tại các đơn vị hồi sức tích cực (ICU) trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam do tần suất mắc bệnh và tỷ lệ tử vong cao. Tại Canada, tỷ lệ VPTM được ghi nhận là 18 ca trên 1.000 ngày thở máy; tại các quốc gia châu Á, tỷ lệ này vào khoảng 18%. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc VPTM dao động từ 20% đến 52%. VPTM làm gia tăng tỷ lệ tử vong từ 26% đến 72%, kéo dài thời gian nằm viện (trung bình 41 ngày ở nhóm mắc VPTM so với 23 ngày ở nhóm không mắc VPTM) và làm tăng chi phí điều trị từ 5 đến 10 lần.

VPTM được định nghĩa là tình trạng viêm nhu mô phổi xuất hiện sau 48 giờ thở máy qua ống nội khí quản hoặc canun mở khí quản. Việc chẩn đoán xác định tác nhân vi sinh dựa trên các phương pháp nuôi cấy, phân lập, nhuộm Gram và phản ứng sinh hóa kinh điển bộc lộ nhiều hạn chế đối với các vi khuẩn Gram âm khó mọc, mọc chậm, vi khuẩn kỵ khí, vi khuẩn không nuôi cấy được hoặc trong bối cảnh bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh trước đó dẫn đến kết quả cấy âm tính giả.

Bên cạnh đó, tình trạng vi khuẩn đa kháng kháng sinh đang diễn biến phức tạp. Tỷ lệ Acinetobacter baumannii kháng carbapenem tại Việt Nam đã tăng nhanh từ 6,7% (năm 2001), 8% (năm 2004) lên 80% (năm 2010) và đạt 90% (năm 2012). Mặc dù các kỹ thuật sinh học phân tử như giải trình tự gene 16S-rRNA và phát hiện gene kháng thuốc (như blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaKPC, blaOXA, blaNDM, blaIMP, blaVIM) đã phát triển trên thế giới, nhưng tại Việt Nam, việc tiếp cận có hệ thống và ứng dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing - NGS) trên mẫu dịch rửa phế quản phế nang (DRPQPN) để khảo sát toàn diện căn nguyên vi khuẩn và đối chiếu với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) vẫn còn là khoảng trống chưa được thực hiện đầy đủ.

Câu hỏi nghiên cứu

Luận án đặt ra 3 câu hỏi nghiên cứu cụ thể:

1. Có sự khác biệt nào trong định danh vi khuẩn gây VPTM giữa phương pháp định danh dựa vào kiểu hình (vi sinh kinh điển) và giải trình tự gene 16S-rRNA?
2. Giá trị MIC và tỷ lệ đề kháng kháng sinh ở các nhóm vi khuẩn gây VPTM phân bố như thế nào?
3. Tỷ lệ vi khuẩn chính yếu gây VPTM mang gene kháng thuốc là bao nhiêu và có mối liên quan giữa các vi khuẩn mang gene kháng thuốc với MIC hay không?

Mục tiêu nghiên cứu

1. Xác định đặc điểm vi khuẩn gây viêm phổi thở máy bằng kỹ thuật giải trình tự gene 16S-rRNA, có so sánh với phương pháp định danh vi khuẩn dựa vào nhuộm Gram, nuôi cấy và các phản ứng sinh hóa.
2. Đánh giá MIC và tỷ lệ đề kháng kháng sinh ở các nhóm vi khuẩn gây viêm phổi thở máy.
3. Xác định gene kháng thuốc của vi khuẩn gây viêm phổi thở máy bằng kỹ thuật PCR và mối liên quan với MIC.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Bệnh nhân nằm điều trị có thở máy qua ống nội khí quản hoặc mở khí quản từ 48 giờ trở lên và thỏa mãn tiêu chuẩn chẩn đoán viêm phổi trên lâm sàng.
• Địa điểm nghiên cứu (Phạm vi không gian): Khoa Hồi sức tích cực Chống độc (ICU nội), khoa Phẫu thuật Gây mê Hồi sức (ICU ngoại) và phòng Đột quỵ khoa Nội thần kinh thuộc Bệnh viện Nhân Dân Gia Định, Thành phố Hồ Chí Minh. Phân tích sinh học phân tử được phối hợp thực hiện tại Trung tâm Pháp y Thành phố Hồ Chí Minh.
• Thời gian nghiên cứu: Thu thập dữ liệu từ tháng 11 năm 2014 đến ngày 30 tháng 9 năm 2015.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Lịch sử tiêu chuẩn chẩn đoán viêm phổi thở máy

Luận án hệ thống hóa quá trình phát triển các bộ tiêu chí chẩn đoán VPTM trong hơn 5 thập kỷ:

• Thập niên 1970: Johanson đưa ra tiêu chuẩn lâm sàng gồm thâm nhiễm mới hoặc tiến triển trên X-quang phổi, sốt, tăng bạch cầu máu và tăng tiết đàm mủ khí phế quản (chưa đưa tiêu chí cấy vi sinh vào bộ chuẩn). Cùng thời kỳ, tiêu chuẩn mô học tử thiết yêu cầu tích tụ bạch cầu đa nhân ở màng phế nang mao mạch và số lượng vi khuẩn $\ge 10^3\text{ CFU/g}$ nhu mô phổi.
• Nội soi phế quản ống mềm: Shigeto Ekeda phát minh ống soi mềm, Wimberley đề xuất tiêu chuẩn chải phế quản có nòng bảo vệ (PSB) với ngưỡng $\ge 10^3\text{ CFU/ml}$; ngưỡng đối với dịch rửa phế quản phế nang (BAL) là $\ge 10^4\text{ CFU/ml}$ và dịch hút nội khí quản là $\ge 10^5\text{ CFU/ml}$.
• CDC Hoa Kỳ (1988): Giới thiệu hệ thống khảo sát nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia (NNIS1 và NNIS2) kết hợp ran phổi/gõ đục với đàm mủ mới, cấy máu dương tính hoặc phân lập được vi sinh vật từ dịch khí quản/chải phế quản/sinh thiết.
• Thập niên 1990: Pugin xây dựng thang điểm viêm phổi lâm sàng (CPIS) từ 0 đến 12 điểm dựa trên 6 thông số: nhiệt độ, bạch cầu máu, đặc tính dịch tiết khí phế quản, nhuộm Gram và cấy đàm, tỷ số $\text{PaO}_2/\text{FiO}_2$, hình ảnh X-quang ngực.
• ATS và IDSA (2005): Thống nhất tiêu chuẩn thâm nhiễm phổi kèm 2 trong 3 dấu hiệu (sốt $> 38^\circ\text{C}$, tăng/giảm bạch cầu, đàm mủ) và khuyến nghị cấy định lượng hoặc bán định lượng.
• Craven (2011): Phân định nhiễm khuẩn hô hấp liên quan thở máy (VARI) thành VPTM và viêm khí phế quản liên quan thở máy (VAT - không có thâm nhiễm tiến triển trên X-quang/CT).
• CDC Hoa Kỳ (2014): Đưa ra khái niệm biến cố liên quan thở máy (VAE), bao gồm: biến chứng liên quan thở máy (VAC - tăng $\text{FiO}_2 \ge 20%$ hoặc tăng $\text{PEEP} \ge 3\text{ cmH}_2\text{O}$ duy trì $\ge 2$ ngày); biến chứng nhiễm khuẩn liên quan thở máy (IVAC - có VAC kèm sốt/hạ thân nhiệt, tăng bạch cầu và dùng kháng sinh $\ge 4$ ngày); và có thể/có khả năng VPTM (Possible/Probable VAP).
• IDSA (2016): Định nghĩa VPTM là viêm phổi xuất hiện trên bệnh nhân thở máy $> 48$ giờ sau đặt nội khí quản, chẩn đoán dựa vào lâm sàng và X-quang, không khuyến cáo phối hợp thường quy các dấu ấn sinh học như CRP, PCT, sTREM-1 hòa tan.

Dịch tễ học và tử suất

Nghiên cứu đa trung tâm EPIC (1.417 trung tâm tại 17 nước Tây Âu trên 10.038 bệnh nhân) cho thấy 21% bệnh nhân nhiễm khuẩn tại ICU với viêm phổi chiếm 47%. Nghiên cứu EPIC II (13.265 ICU tại 75 quốc gia trên 7.087 bệnh nhân nhiễm khuẩn) ghi nhận viêm phổi chiếm 64%. Nghiên cứu của Cook và cộng sự (1.014 bệnh nhân) chỉ ra nguy cơ mắc VPTM cộng dồn theo thời gian: 3%/ngày trong 5 ngày đầu, 2%/ngày ở ngày thứ 10 và 1%/ngày ở ngày thứ 15.

Về tỷ lệ tử vong, Chastre (2006) đã tổng hợp các nghiên cứu cho thấy mức độ ảnh hưởng của việc điều trị kháng sinh ban đầu đầy đủ so với không đầy đủ:

Tác giả	Tỷ lệ tử vong khi ĐTKS không đầy đủ	Tỷ lệ tử vong khi ĐTKS đầy đủ	Giá trị p
Luna (1997)	92,2% ($n=36$)	37,5% ($n=15$)	$< 0,001$
Alvarez-Lerma (1996)	34,9% ($n=146$)	32,5% ($n=284$)	Không xác định (NS)
Rello (1997)	63,0% ($n=27$)	41,5% ($n=58$)	0,06
Kollef (1998)	60,8% ($n=51$)	26,6% ($n=79$)	$< 0,001$
Sanchez-Nieto (1998)	42,9% ($n=14$)	25,0% ($n=24$)	Không xác định (NS)
Ruiz (2000)	50,0% ($n=18$)	39,3% ($n=28$)	Không xác định (NS)
Dupont (2001)	60,7% ($n=56$)	47,3% ($n=55$)	Không xác định (NS)

Căn nguyên vi sinh theo phương pháp kinh điển

Theo tổng kết của Chastre (2013), các tác nhân vi khuẩn gây VPTM thường gặp nhất gồm: Pseudomonas aeruginosa (24,4%), Staphylococcus aureus (20,4%), Enterobacteriaceae (14,1%), Haemophilus spp. (9,8%), Streptococcus spp. (8,0%), Acinetobacter spp. (7,9%).

Tại Việt Nam, nghiên cứu đa trung tâm của Vũ Đình Phú (2016) trên 15 khoa ICU người lớn ghi nhận 575 chủng vi khuẩn gây viêm phổi, trong đó 3 tác nhân phổ biến nhất là:

1. Acinetobacter spp.: 197 chủng (33,5%) - kháng carbapenem 89,2%.
2. Klebsiella spp.: 112 chủng (19,1%) - kháng carbapenem 14,9%.
3. Pseudomonas aeruginosa: 92 chủng (15,7%) - kháng carbapenem 55,7%.

Tổng kết 11 năm (2006-2010) tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới TP.HCM của Nguyễn Thị Khánh Như (2014) cho thấy Acinetobacter spp. tăng dần từ 27,1% (2006) lên 45,5% (2010), trong khi Pseudomonas aeruginosa giảm từ 35,0% (2006) xuống 11,7% (2010).

Vị trí và bước tiến của luận án

Trong khi các nghiên cứu trong nước trước đây chủ yếu dừng lại ở nuôi cấy phân lập và làm kháng sinh đồ khuếch tán đĩa giấy, luận án của tác giả Trần Minh Giang đã kết hợp:

• Phương pháp cấy định lượng dịch rửa phế quản phế nang qua nội soi phế quản tại giường.
• Định danh hệ vi khuẩn trực tiếp không qua nuôi cấy bằng kỹ thuật giải trình tự gene 16S-rRNA trên hệ thống giải trình tự thế hệ mới Ion Torrent PGM.
• Đo nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng que E-test cho các kháng sinh quan trọng.
• Xác định các gene kháng thuốc (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaKPC, blaOXA, blaNDM, blaIMP, blaVIM...) bằng kỹ thuật PCR chuyên biệt và phân tích tương quan với giá trị MIC thực tế.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu và cỡ mẫu

• Thiết kế: Nghiên cứu tiến cứu mô tả cắt ngang.
• Công thức tính cỡ mẫu: $$n = \frac{Z_{1-\alpha/2}^2 \cdot p(1-p)}{d^2}$$ Trong đó: $Z = 1,96$ (với $\alpha = 0,05$); $p = 0,69$ (tỷ lệ vi khuẩn phân lập được từ nghiên cứu trước); sai số ước lượng $d = 0,07$. Kết quả tính toán cần $n = 168$ mẫu cấy dương, tương ứng số bệnh nhân cần tuyển chọn là $244$ bệnh nhân ($168 / 0,69$). Tính toán thêm tỷ lệ đồng nhiễm 2 vi khuẩn khoảng 10%, số lượng bệnh nhân tối thiểu cần chọn vào nghiên cứu được xác định là 220 bệnh nhân.
• Kỹ thuật chọn mẫu: Chọn mẫu thuận tiện tất cả các bệnh nhân thở máy qua nội khí quản hoặc mở khí quản $\ge 48$ giờ tại 3 khoa lâm sàng của Bệnh viện Nhân Dân Gia Định thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu.

Tiêu chuẩn chọn mẫu và loại trừ

• Tiêu chuẩn chọn vào:
  • Bệnh nhân thở máy qua NKQ hoặc KKQ $\ge 48$ giờ tại khoa ICU nội, ICU ngoại, phòng Đột quỵ khoa Nội Thần kinh.
  • Có dấu hiệu viêm phổi trên lâm sàng: xuất hiện thâm nhiễm mới, lan tỏa hoặc tiến triển trên X-quang phổi, kết hợp ít nhất 2 trong các tiêu chuẩn:
    1. Nhiệt độ $\ge 38^\circ\text{C}$ hoặc $\le 36^\circ\text{C}$.
    2. Tăng tiết đàm mủ hoặc đàm đổi màu.
    3. Tăng tiêu thụ oxy: $\text{FiO}_2$ tăng $\ge 20%$/ngày liên tục $\ge 2$ ngày, hoặc $\text{PEEP}$ tăng $\ge 3\text{ cmH}_2\text{O}$/ngày liên tục $\ge 2$ ngày.
    4. Bạch cầu máu $\ge 12.000/\text{mm}^3$ hoặc $< 4.000/\text{mm}^3$.
• Tiêu chuẩn loại ra:
  • Bệnh nhân dưới 18 tuổi.
  • Đã có viêm phổi xảy ra trước 48 giờ thở máy.
  • Nhồi máu cơ tim cấp trong 24 giờ đầu hoặc rối loạn nhịp thất nguy hiểm chưa kiểm soát.
  • Số lượng tiểu cầu $< 60.000/\text{mm}^3$.
  • Phụ nữ mang thai, bệnh nhân ghép tạng, nhiễm HIV.
  • Thân nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.

Quy trình thu thập và xử lý bệnh phẩm

1. Thiết lập thông khí nhân tạo và theo dõi: Cài đặt thông số máy thở ban đầu: thể tích khí lưu thông ($V_t$) $10\text{ ml/kg}$, tần số thở 14 lần/phút, $\text{FiO}_2 = 100%$, thời gian hít vào $T_i = 1,2$ giây, chế độ Assist/Control (A/C). Đặt ống hút đàm kín. Sau 48 giờ, đánh giá lại lâm sàng và cận lâm sàng.
2. Lấy bệnh phẩm: Tiến hành nội soi phế quản tại giường lấy dịch rửa phế quản phế nang (DRPQPN). Chia đôi mẫu dịch:
   • Mẫu 1: Gửi đến Khoa Vi sinh Bệnh viện Nhân Dân Gia Định trong vòng 30 phút.
   • Mẫu 2: Bảo quản lạnh $< 4^\circ\text{C}$, chuyển đến phòng Sinh học phân tử - Trung tâm Pháp y TP.HCM trong vòng 1 giờ.

Quy trình vi sinh kinh điển và kháng sinh đồ

• Cấy định lượng và định danh: Xử lý mẫu DRPQPN, cấy trên các môi trường thạch máu (BA), thạch MacConkey (MA), thạch sô-cô-la (CAHI). Thực hiện nhuộm Gram và thử nghiệm sinh hóa:
  • Cầu khuẩn Gram dương: thử catalase, coagulase, thạch Chapman, ure, polymyxin, novobiocin, Taxo A, Taxo P, NaCl 6,5%, bile esculin, CAMP test.
  • Trực khuẩn Gram âm: thử oxidase, bộ định danh sinh hóa API 20NE.
• Kháng sinh đồ khuếch tán đĩa thạch (Kirby-Bauer): Sử dụng các đĩa kháng sinh của hãng Oxoid: amikacin ($30\ \mu\text{g}$), gentamicin ($10\ \mu\text{g}$), ceftriaxone ($30\ \mu\text{g}$), ceftazidime ($30\ \mu\text{g}$), cefepime ($30\ \mu\text{g}$), cefoperazone ($75\ \mu\text{g}$), cefoperazone/sulbactam ($75/30\ \mu\text{g}$), piperacillin/tazobactam ($100/10\ \mu\text{g}$), ertapenem ($10\ \mu\text{g}$), imipenem ($10\ \mu\text{g}$), meropenem ($10\ \mu\text{g}$), ciprofloxacin ($5\ \mu\text{g}$), levofloxacin ($5\ \mu\text{g}$), doxycycline ($30\ \mu\text{g}$), vancomycin ($30\ \mu\text{g}$), colistin ($10\ \mu\text{g}$).
• Chủng chứng chuẩn quốc tế: Acinetobacter baumannii ATCC 19606, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923. Biện luận kết quả theo tiêu chuẩn CLSI 2014.
• Đo MIC bằng que E-test: Sử dụng que E-test (chứa kháng sinh có nồng độ giảm dần trên dải nitrocellulose). Đọc điểm cắt elip vô khuẩn theo chuẩn CLSI 2014.

Quy trình sinh học phân tử (NGS và PCR)

• Ly trích DNA vi khuẩn bằng sốc nhiệt: Mẫu DRPQPN được xử lý bằng hóa chất Dithiothreitol (DTT) để phá vỡ cầu nối disulphide làm tan đàm. Hỗn hợp được ủ nước sôi làm biến tính màng và vách tế bào, sau đó làm lạnh nhanh tại ngăn đông $-20^\circ\text{C}$ trong 10 phút tạo tinh thể nước phá vỡ tế bào, ly tâm $13.000\text{ rpm}$ trong 10 phút để thu dịch nổi chứa DNA.
• Đo nồng độ DNA: Sử dụng máy Qubit 2.0 Fluorometer với bộ kít Qubit dsDNA HS Assay (Thermo Scientific), pha thuốc nhuộm tỷ lệ 1:200 và dựng đường chuẩn với dung dịch chuẩn S1, S2.
• Giải trình tự gene 16S-rRNA thế hệ mới (NGS) trên hệ thống Ion Torrent PGM:
  • Khuếch đại PCR: Dùng bộ kít Ion 16S Metagenomics Kit nhân bản các vùng biến đổi V3, V6-7 và V9. Thành phần phản ứng ($30\ \mu\text{l}$): $15\ \mu\text{l}$ 2X Environmental Master Mix, $3\ \mu\text{l}$ 16S Primer Set, $10-100\text{ ng}$ DNA khuôn, nước vừa đủ $30\ \mu\text{l}$. Chu trình nhiệt: $95^\circ\text{C}$ (10 phút); 25 chu kỳ ($95^\circ\text{C}$ 30 giây, $58^\circ\text{C}$ 30 giây, $72^\circ\text{C}$ 30 giây); $72^\circ\text{C}$ 7 phút; giữ ở $4^\circ\text{C}$.
  • Tinh sạch sản phẩm PCR: Sử dụng bộ GeneJET NGS Cleanup Kit với cột màng silica, đệm Binding Buffer (tỷ lệ 5:1), rửa bằng Prewash Buffer và Wash Buffer (bổ sung Ethanol 96-100%), hoàn nguyên DNA tinh sạch.
  • Tạo đầu bằng (End Repair): Hỗn hợp phản ứng ($60\ \mu\text{l}$) gồm $6\ \mu\text{l}$ NEBNext End Repair Reaction Buffer, $3\ \mu\text{l}$ NEBNext End Repair Enzyme Mix, $30\ \mu\text{l}$ DNA sản phẩm PCR, nước vừa đủ $60\ \mu\text{l}$.
  • Gắn Adapter và trP1: Sử dụng bộ NEBNext Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent. Thành phần phản ứng ($100\ \mu\text{l}$): $10\ \mu\text{l}$ T4 DNA Ligase Buffer, $2\ \mu\text{l}$ Adapter, $2\ \mu\text{l}$ trP1, $1\ \mu\text{l}$ Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase, $6\ \mu\text{l}$ T4 DNA Ligase, $60\ \mu\text{l}$ DNA đầu bằng. Nhiệt độ: $25^\circ\text{C}$ 15 phút, $65^\circ\text{C}$ 5 phút, giữ ở $4^\circ\text{C}$.
  • Gắn thư viện gene vào hạt ISP (Ion Sphere Particles), nhân bản cụm hạt và giải trình tự trên chíp bán dẫn của máy Personal Genome Machine (PGM).
• Kỹ thuật PCR xác định gene kháng thuốc: Thực hiện các phản ứng PCR chuyên biệt tìm các gene mã hóa enzyme beta-lactamase phổ rộng (ESBL) và carbapenemase (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaKPC, blaOXA, blaNDM, blaIMP, blaVIM).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 1 trình bày chi tiết cơ sở lý luận và tổng kết các y văn trong và ngoài nước về:

• Sự biến đổi trong các hướng dẫn và tiêu chuẩn chẩn đoán VPTM từ thập niên 1970 đến hướng dẫn của IDSA/ATS 2016.
• Phân tích dịch tễ học tỷ lệ mới mắc, tỷ lệ tử vong và các yếu tố nguy cơ độc lập gây VPTM (bao gồm yếu tố người bệnh như tuổi $\ge 60$, ARDS, hôn mê, điểm albumin $< 22\text{ g/L}$; và yếu tố can thiệp như đặt nội khí quản, hút đàm hở, nằm ngửa đầu thấp, sử dụng thuốc an thần dãn cơ liên tục, sử dụng kháng sinh trước đó).
• Khảo sát các tác nhân vi khuẩn gây bệnh chính yếu qua nuôi cấy kinh điển, đặc biệt là nhóm trực khuẩn Gram âm (A. baumannii, P. aeruginosa, K. pneumoniae).
• Đánh giá vai trò của sinh học phân tử trong định danh vi sinh lâm sàng: lịch sử phát hiện gene 16S-rRNA (Carl Woese), nguyên lý vùng bảo tồn và vùng siêu biến đổi (V1-V9), các cơ sở dữ liệu vi sinh (BLASTn/GeneBank, RDP-II, MicroSeq, SILVA), cũng như các hạn chế của phương pháp nuôi cấy truyền thống khi gặp vi khuẩn kỵ khí, vi khuẩn khó mọc hoặc bệnh nhân đã dùng kháng sinh.
• Các phương pháp làm kháng sinh đồ khuếch tán đĩa giấy, phương pháp định lượng MIC (que E-test), mối tương quan dược động học/dược lực học (PK/PD), và ứng dụng của PCR/microarray/MALDI-TOF trong xác định các gene kháng thuốc nhóm beta-lactamase và carbapenemase.

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả tường tận phương pháp luận và các bước triển khai thực nghiệm:

• Trình bày thiết kế nghiên cứu tiến cứu mô tả cắt ngang tại 3 đơn vị (ICU nội, ICU ngoại, phòng Đột quỵ) Bệnh viện Nhân Dân Gia Định trong giai đoạn 11/2014 - 09/2015.
• Xác định quy mô mẫu nghiên cứu gồm tối thiểu 220 bệnh nhân dựa trên công thức tính cỡ mẫu ước lượng tỷ lệ với hiệu chỉnh đồng nhiễm vi khuẩn.
• Thiết lập chi tiết tiêu chuẩn chọn vào và tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân.
• Chuẩn hóa quy trình chăm sóc, thông khí cơ học và kỹ thuật nội soi phế quản lấy mẫu dịch rửa phế quản phế nang (DRPQPN) tại giường.
• Mô tả chi tiết quy trình xử lý mẫu song song: nuôi cấy định lượng, định danh sinh hóa (API 20NE, các test sinh hóa chuẩn), thực hiện kháng sinh đồ Kirby-Bauer và E-test đo MIC tại Khoa Vi sinh; quy trình ly trích DNA bằng sốc nhiệt - DTT, đo huỳnh quang Qubit 2.0, tạo thư viện và giải trình tự gene 16S-rRNA trên hệ thống Ion Torrent PGM, kỹ thuật PCR phát hiện các gene kháng thuốc tại phòng Sinh học phân tử.
• Liệt kê và định nghĩa các biến số nghiên cứu, quy trình phân tích thống kê và các nguyên tắc đạo đức trong nghiên cứu y sinh học.

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương 3 trình bày các số liệu và phát hiện thực nghiệm của đề tài:

• Đặc điểm chung: Phân bố dịch tễ học, tuổi, giới tính, lý do nhập viện, các chỉ số lâm sàng (nhiệt độ, $\text{SpO}_2$, điểm Glasgow), cận lâm sàng (bạch cầu, khí máu động mạch, X-quang ngực) và tiền sử dùng kháng sinh trước đó của đối tượng nghiên cứu.
• Kết quả định danh vi khuẩn theo vi sinh kinh điển: Tỷ lệ phân lập vi khuẩn từ nuôi cấy DRPQPN, danh mục và tần suất các loài vi khuẩn Gram âm (Acinetobacter spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp., E. coli, Burkholderia cepacia...) và vi khuẩn Gram dương.
• Kết quả định danh vi khuẩn bằng giải trình tự gene 16S-rRNA: Số lượng loài và chủng vi khuẩn được phát hiện qua hệ thống NGS; kết quả phân tích cụm trên 99 loài vi khuẩn định danh được bằng 16S-rRNA; số lượng loài vi khuẩn hiện diện trên từng mẫu DRPQPN đơn lẻ (phát hiện tình trạng đa vi khuẩn và các vi khuẩn kỵ khí/khó mọc).
• So sánh hai phương pháp định danh: Bảng đối chiếu kết quả định danh giữa nuôi cấy kinh điển và giải trình tự 16S-rRNA trên hệ thống PGM về độ nhạy, số lượng loài phát hiện và các trường hợp cấy âm tính nhưng NGS dương tính.
• Mối liên quan giữa thời gian nằm ICU và tác nhân gây bệnh: Khảo sát sự thay đổi căn nguyên vi sinh theo số ngày nằm điều trị tại ICU (VPTM khởi phát sớm so với khởi phát muộn).
• Kết quả kháng sinh đồ: Tỷ lệ nhạy cảm và đề kháng của các chủng vi khuẩn đối với các kháng sinh thử nghiệm qua phương pháp khuếch tán đĩa giấy; mạng lưới đa kháng thuốc ở các nhóm vi khuẩn chủ lực.
• Kết quả đo MIC bằng E-test: Phân bố giá trị nồng độ ức chế tối thiểu đối với Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Burkholderia cepacia.
• Kết quả PCR xác định gene kháng thuốc: Tỷ lệ mang các gene kháng thuốc (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA, blaKPC, blaNDM, blaIMP, blaVIM) và phân tích mối liên quan giữa sự hiện diện của gene kháng thuốc với mức độ tăng giá trị MIC.
• Kết quả điều trị: Tỷ lệ xuất viện, diễn tiến lâm sàng, kết cục điều trị và tỷ lệ tử vong chung của bệnh nhân nghiên cứu.

Chương 4: BÀN LUẬN

Chương 4 phân tích, biện giải và so sánh các phát hiện nghiên cứu với y văn trong nước và quốc tế:

• Biện luận về năng lực định danh vi khuẩn: So sánh hiệu quả giữa giải trình tự 16S-rRNA trên nền tảng NGS với nuôi cấy kinh điển; phân tích tính đa dạng của hệ vi sinh đường hô hấp dưới ở bệnh nhân thở máy; đánh giá khả năng phát hiện các vi khuẩn kỵ khí, vi khuẩn đồng nhiễm mà nuôi cấy thường quy bỏ sót.
• Biện luận về tình hình đề kháng kháng sinh và MIC: Phân tích thực trạng đa kháng thuốc nghiêm trọng của các chủng trực khuẩn Gram âm không lên men (A. baumannii, P. aeruginosa) và vi khuẩn đường ruột (K. pneumoniae); ý nghĩa lâm sàng của việc xác định giá trị MIC bằng que E-test trong tối ưu hóa liều lượng và phối hợp kháng sinh theo dược động học/dược lực học (PK/PD).
• Biện luận về cơ chế phân tử của tính kháng thuốc: Phân tích sự phổ biến của các gene sinh men beta-lactamase phổ rộng (ESBL) và carbapenemase; giải thích mối tương quan có ý nghĩa giữa sự hiện diện của các gene kháng thuốc xác định bằng PCR với mức độ gia tăng MIC trên kháng sinh đồ thực tế.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và phương pháp luận

1. Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS): Đây là một trong những công trình tiên phong tại Việt Nam ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gene 16S-rRNA bằng hệ thống NGS (Ion Torrent PGM) trực tiếp trên mẫu dịch rửa phế quản phế nang (DRPQPN) lấy qua nội soi phế quản tại giường ở bệnh nhân VPTM, giúp nhận diện toàn diện hệ vi sinh đường hô hấp dưới, khắc phục triệt để nhược điểm âm tính giả của nuôi cấy kinh điển trên bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước đó.
2. Khảo sát hệ thống tính đa dạng vi khuẩn: Luận án chứng minh sự hiện diện của các mô hình đa vi khuẩn và nhiều loài vi khuẩn khó nuôi cấy hoặc vi khuẩn kỵ khí trong bệnh phẩm hô hấp dưới mà phương pháp vi sinh truyền thống không thể phát hiện.
3. Cung cấp dữ liệu định lượng MIC toàn diện: Thiết lập bộ dữ liệu chi tiết về giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng que E-test cho các căn nguyên vi khuẩn gây VPTM phổ biến nhất (A. baumannii, K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli, B. cepacia), thay thế cho phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán định tính thông thường.
4. Liên kết kiểu gene và kiểu hình kháng thuốc: Luận án làm sáng tỏ tỷ lệ lưu hành của các nhóm gene kháng thuốc quan trọng (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA, blaKPC, blaNDM, blaIMP, blaVIM) và chứng minh mối liên quan giữa việc mang gene kháng thuốc với sự biến đổi nồng độ MIC thực nghiệm.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Đưa kỹ thuật nội soi phế quản lấy dịch rửa phế quản phế nang kết hợp cấy định lượng và xét nghiệm sinh học phân tử vào quy trình chẩn đoán chuẩn cho các trường hợp nghi ngờ VPTM nặng hoặc đáp ứng kém với điều trị ban đầu.
• Áp dụng thường quy kỹ thuật đo MIC bằng que E-test tại các khoa vi sinh lâm sàng nhằm hỗ trợ bác sĩ hồi sức điều chỉnh liều kháng sinh trúng đích theo các chỉ số PK/PD.
• Xây dựng hệ thống giám sát dịch tễ học phân tử định kỳ tại các khoa ICU để theo dõi sự lan truyền của các chủng vi khuẩn mang gene kháng thuốc nguy hiểm (đặc biệt là các gene sinh carbapenemase nhóm A, B, D).

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Thiết kế và địa điểm: Nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp mô tả cắt ngang tại một bệnh viện (Bệnh viện Nhân Dân Gia Định), áp dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện nên tính đại diện cho toàn bộ các mô hình ICU trên toàn quốc còn có những giới hạn nhất định.
• Tiêu chuẩn loại trừ: Do yêu cầu kỹ thuật thực hiện thủ thuật nội soi phế quản lấy dịch rửa phế quản phế nang, nghiên cứu buộc phải loại trừ các bệnh nhân có rối loạn huyết động nặng (nhồi máu cơ tim cấp trong 24 giờ đầu, loạn nhịp thất nguy hiểm chưa kiểm soát) hoặc giảm tiểu cầu nặng ($< 60.000/\text{mm}^3$), dẫn đến việc chưa khảo sát được căn nguyên vi sinh trên nhóm bệnh nhân đặc biệt nặng này.
• Thời gian theo dõi: Dữ liệu thu thập tập trung trong giai đoạn từ tháng 11/2014 đến tháng 9/2015, do đó các biến động dịch tễ học phân tử và các đột biến kháng thuốc mới phát sinh sau giai đoạn này chưa được cập nhật trong phạm vi bộ số liệu của luận án.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Mở rộng nghiên cứu đa trung tâm tại nhiều bệnh viện tuyến cuối ở các miền khác nhau nhằm đánh giá bức tranh toàn cảnh về dịch tễ học phân tử của vi khuẩn gây VPTM tại Việt Nam.
• Khảo sát sâu hơn về động học biểu hiện gene kháng thuốc và ứng dụng giải trình tự toàn bộ hệ gene vi khuẩn (Whole Genome Sequencing - WGS) để phân tích các cơ chế đề kháng phức tạp ngoài men beta-lactamase (như đột biến kênh porin, bơm tống thuốc).
• Thực hiện các thử nghiệm lâm sàng can thiệp đánh giá hiệu quả của phác đồ điều trị kháng sinh dựa trên kết quả giải trình tự 16S-rRNA nhanh và nồng độ MIC E-test so với phác đồ kinh nghiệm truyền thống.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị cao đối với nhiều nhóm đối tượng chuyên môn:

• Bác sĩ Hồi sức cấp cứu và Chống độc: Cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá căn nguyên vi sinh gây VPTM theo thời gian nằm viện, nhận diện nguy cơ đồng nhiễm và hiểu rõ mức độ đề kháng kháng sinh để chỉ định kháng sinh theo kinh nghiệm và điều chỉnh phác đồ theo nồng độ MIC (PK/PD).
• Bác sĩ và Kỹ thuật viên Vi sinh lâm sàng: Cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết từ kỹ thuật lấy mẫu, cấy định lượng DRPQPN, thực hiện kháng sinh đồ E-test, đến quy trình xử lý mẫu, tách chiết DNA bằng sốc nhiệt và giải trình tự gene 16S-rRNA trên hệ thống giải trình tự thế hệ mới Ion Torrent PGM.
• Nghiên cứu sinh, Học viên sau đại học chuyên ngành Truyền nhiễm và Hô hấp: Tham khảo khung lý thuyết, công thức tính cỡ mẫu nghiên cứu vi sinh học, các bảng tổng quan tiêu chuẩn chẩn đoán VPTM từ cổ điển đến hiện đại, và phương pháp luận đối chiếu giữa kiểu hình với kiểu gene.
• Nhà quản lý bệnh viện và Kiểm soát nhiễm khuẩn: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm về mô hình vi khuẩn đa kháng và các gene đề kháng phổ biến tại môi trường ICU, phục vụ công tác xây dựng chính sách quản lý sử dụng kháng sinh (Antimicrobial Stewardship) và quy trình kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử cụ thể nào để định danh vi khuẩn và quy trình tạo thư viện gene gồm những bước gì?

Luận án ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gene 16S-rRNA trên hệ thống giải trình tự thế hệ mới NGS Ion Torrent PGM. Quy trình tạo thư viện gene gồm 4 bước chính:

1. Khuếch đại PCR: Sử dụng bộ kít Ion 16S Metagenomics Kit nhân bản các vùng biến đổi V3, V6-7 và V9 của gene 16S-rRNA.
2. Tinh sạch sản phẩm PCR: Dùng bộ GeneJET NGS Cleanup Kit với cột silica và các dung dịch đệm để loại bỏ mồi, dNTP và enzyme dư thừa.
3. Tạo đầu bằng (End Repair): Sử dụng NEBNext End Repair Enzyme Mix để xử lý hai đầu đoạn khuếch đại.
4. Gắn Adapter và trP1: Sử dụng bộ NEBNext Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent để gắn đoạn tiếp hợp vào hai đầu sản phẩm DNA trước khi gắn vào hạt ISP và nạp vào máy giải trình tự.

2. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân vào nghiên cứu VPTM của tác giả gồm những tiêu chí cụ thể nào?

Bệnh nhân được chọn vào nghiên cứu khi thỏa mãn đầy đủ các điều kiện:

• Thở máy xâm lấn qua ống nội khí quản hoặc canun mở khí quản từ 48 giờ trở lên tại ICU nội, ICU ngoại hoặc phòng Đột quỵ.
• Có hình ảnh thâm nhiễm mới, lan tỏa hoặc tiến triển trên X-quang phổi.
• Kèm theo ít nhất 2 trong 4 tiêu chí lâm sàng/cận lâm sàng: (1) Sốt $\ge 38^\circ\text{C}$ hoặc hạ thân nhiệt $\le 36^\circ\text{C}$; (2) Tăng tiết đàm hoặc đàm đổi màu mủ; (3) Tăng tiêu thụ oxy (tăng $\text{FiO}_2 \ge 20%$/ngày hoặc tăng $\text{PEEP} \ge 3\text{ cmH}_2\text{O}$/ngày liên tục $\ge 2$ ngày); (4) Bạch cầu máu $\ge 12.000/\text{mm}^3$ hoặc $< 4.000/\text{mm}^3$.

3. Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn từ dịch rửa phế quản phế nang được thực hiện như thế nào trong nghiên cứu?

Tác giả sử dụng phương pháp sốc nhiệt kết hợp Dithiothreitol (DTT):

• Bổ sung dung dịch DTT để cắt đứt liên kết disulphide giúp làm tan đàm và đồng hóa mẫu DRPQPN.
• Đun sôi mẫu trong nước sôi để biến tính và phá vỡ cấu trúc màng/vách tế bào vi khuẩn.
• Làm lạnh nhanh ở ngăn đông $-20^\circ\text{C}$ trong 10 phút để các tinh thể nước hình thành phá vỡ hoàn toàn tế bào chất, giải phóng DNA.
• Ly tâm với tốc độ $13.000\text{ rpm}$ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng để lắng cặn tế bào và thu lấy dịch nổi chứa DNA tinh khiết bảo quản ở $-30^\circ\text{C}$.

4. Luận án khảo sát giá trị MIC và các gene kháng thuốc nào trên các chủng vi khuẩn phân lập được?

• Kháng sinh đồ MIC: Thực hiện bằng que E-test xác định nồng độ ức chế tối thiểu đối với 5 nhóm vi khuẩn chủ yếu gồm Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli và Burkholderia cepacia.
• Các gene kháng thuốc: Sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện các gene sinh men beta-lactamase phổ rộng (ESBL) và carbapenemase thuộc các họ gene: blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaKPC, blaOXA, blaNDM, blaIMP, blaVIM.

5. Cỡ mẫu của nghiên cứu được tính toán như thế nào và bao nhiêu bệnh nhân được đưa vào nghiên cứu?

Cỡ mẫu được tính theo công thức ước lượng một tỷ lệ với mức ý nghĩa $\alpha = 0,05$ ($Z = 1,96$), sai số cho phép $d = 0,07$, tỷ lệ vi khuẩn gây VPTM từ y văn trước là $p = 0,69$, tính ra cần 168 mẫu cấy dương tính tương đương 244 bệnh nhân ($168 / 0,69$). Sau khi hiệu chỉnh thêm tỷ lệ đồng nhiễm khoảng 10%, cỡ mẫu tối thiểu được xác định là 220 bệnh nhân.

---

Kết luận

Luận án Tiến sĩ Y học của tác giả Trần Minh Giang là công trình nghiên cứu toàn diện về căn nguyên vi khuẩn gây viêm phổi thở máy và cơ chế kháng thuốc ở mức độ phân tử tại các khoa hồi sức tích cực Bệnh viện Nhân Dân Gia Định. Bằng việc kết hợp đồng thời nuôi cấy định lượng DRPQPN, giải trình tự gene 16S-rRNA trên hệ thống NGS Ion Torrent PGM, đo MIC bằng E-test và phát hiện gene kháng thuốc bằng PCR, nghiên cứu đã chứng minh tính ưu việt của sinh học phân tử trong việc phát hiện hệ vi khuẩn đa dạng mà vi sinh kinh điển bỏ sót. Các kết quả về sự gia tăng nồng độ MIC và sự phân bố của các gene kháng thuốc nhóm beta-lactamase/carbapenemase cung cấp bằng chứng thực nghiệm quan trọng giúp tối ưu hóa phác đồ điều trị kháng sinh và nâng cao hiệu quả kiểm soát nhiễm khuẩn tại các đơn vị hồi sức cấp cứu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm phổi thở máy (VPTM) là một vấn đề lâm sàng quan trọng không chỉ ở Việt Nam mà còn trên thế giới vì tần suất mắc bệnh và tử vong tăng cao. Tại Canada, VPTM là 18 ca trên 1000 ngày thở máy [75]. Các quốc gia Á Châu VPTM là 18% [43]. Tại Việt Nam, VPTM dao động từ 20% - 52%, [2], [5], [7], [8], [11], [16], [17].

VPTM là nguyên nhân hàng đầu gây tăng tỉ lệ tử vong (26% - 72%), kéo dài thời gian nằm viện (41 so với 23 ngày ở nhóm có và không VPTM) và tăng chi phí điều trị (5 – 10 lần) [5], [41]. VPTM đƣợc định nghĩa là viêm nhu mô phổi xảy ra sau 48 giờ thở máy qua nội khí quản hoặc qua khai khí quản [42], [61]. Chẩn đoán VPTM đƣợc thiết lập dựa trên chứng cứ lâm sàng và vi sinh. Việc xác định vi khuẩn (VK) gây bệnh thông qua cấy định lƣợng hoặc bán định lƣợng đàm hút qua nội khí quản đơn thuần hoặc qua nội soi phế quản [34], [41], [50].

Việc định danh VK bằng nhuộm Gram, nuôi cấy, đặc tính mọc và các phản ứng sinh hóa là chuẩn mực. Tuy nhiên phƣơng pháp vi sinh kinh điển này không thể áp dụng trong các trƣờng hợp sau: VK Gram âm khó mọc, mọc chậm; VK hiếm hoặc chỉ biểu hiện một vài đặc tính về sinh hóa. Cũng nhƣ các VK yếm khí, VK không cấy đƣợc và bệnh lý nhiễm khuẩn có kết quả cấy âm tính, nhất là trên bệnh nhân (BN) sử dụng kháng sinh trƣớc đó [50], [57], [73], [74], [83], [97], [114]. Chẩn đoán phân tử, ngày nay, đã trở thành phƣơng pháp tham chiếu để chẩn đoán vi sinh học của nhiều bệnh lý hô hấp [73].

Vai trò của giải trình tự gene 16S - rRNA trong định danh VK càng đƣợc chứng tỏ và đƣợc áp dụng rộng rãi trên lâm sàng [57], [58], [80], [116], [117]. Phƣơng pháp giải trình tự gene 16S - rRNA có thể phát hiện đƣợc hệ vi sinh trên đƣờng hô hấp của ngƣời khỏe và BN [29], [44], [88]. Tại Việt Nam số liệu từ các NC về định danh VK dựa trên sinh học phân tử ở các BN VPTM chƣa nhiều và chƣa đƣợc hệ thống đầy đủ. 2 Ngày nay, VK đa kháng kháng sinh là một thách thức toàn cầu [58].

Đặc biệt là các quốc gia Á Châu, kể cả Việt Nam [12], [20], [59], [74], [78], [101]. baumannii kháng Carbapenem tăng lên nhanh chóng 6,7% (2001) [8]; 8% (2004) [17]; 80% (2010) [11]; 90% (2012) [5]. Tuy nhiên, kháng sinh đồ định lƣợng MIC bằng que E-test chƣa đƣợc áp dụng rộng rãi và số liệu chƣa đƣợc hệ thống đầy đủ. Các VK mang gene SHV, TEM, IMP, OXA, NDM thủy phân phổ rộng các cephalosporin là thƣờng gặp [81].

Trong nƣớc, việc tiếp cận có hệ thống gene kháng thuốc của VK chính yếu gây VPTM chƣa đƣợc ghi nhận và hệ thống hóa đầy đủ. Ở Việt Nam, chƣa có nghiên cứu nào áp dụng giải trình tự thế hệ mới trong việc xác định VK gây VPTM trên các mẫu dịch rửa phế quản phế nang. Chúng tôi đặt ra 3 câu hỏi nghiên cứu: (a) Có sự khác biệt nào trong định danh VK gây VPTM giữa hai phƣơng pháp định danh VK dựa vào kiểu hình và giải trình tự gene 16S- rRNA; (b) Giá trị MIC và tỉ lệ đề kháng kháng sinh ở các nhóm VK gây VPTM phân bố nhƣ thế nào?; (c) Tỉ lệ VK chính yếu gây VPTM mang gene kháng thuốc là bao nhiêu và có mối liên quan giữa các VK mang gene kháng thuốc với MIC hay không? Trả lời những câu hỏi nghiên cứu trên sẽ cung cấp những kiến thức quan trọng về qui mô đề kháng kháng sinh và xác lập đƣợc những tác nhân liên quan đến VPTM, giúp cho việc điều trị BN tốt hơn. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu: 1.

Xác định đặc điểm vi khuẩn gây viêm phổi thở máy bằng kỹ thuật giải trình tự gene 16S - rRNA, có so sánh với phƣơng pháp định danh vi khuẩn dựa vào nhuộm Gram, nuôi cấy và các phản ứng sinh hóa. Đánh giá MIC và tỉ lệ đề kháng kháng sinh ở các nhóm vi khuẩn gây viêm phổi thở máy. Xác định gene kháng thuốc của vi khuẩn gây viêm phổi thở máy bằng kỹ thuật PCR và mối liên quan với MIC. 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Định nghĩa Viêm phổi thở máy (VPTM) đƣợc định nghĩa là viêm nhu mô phổi xảy ra sau 48 giờ thở máy qua nội khí quản hoặc qua khai khí quản [42], [61]. Ngay từ những thập niên đầu áp dụng thở máy xâm nhập đã có nhiều định nghĩa về VPTM. Từ những thập niên 70, Johanson đã áp dụng tiêu chuẩn chẩn đoán cho VPTM bao gồm thâm nhiễm mới hoặc tiến triển trên X-quang ngực; sốt; bạch cầu máu tăng và tăng tiết đàm mủ khí phế quản. Ngoài ra tác giả này còn đƣa ra định nghĩa có thể có khả năng VPTM bao gồm sốt, tăng bạch cầu máu kèm theo hoặc thâm nhiễm mới hay tiến triển trên X-quang ngực hoặc hiện diện đàm mủ.

Kết quả cấy vi sinh không đƣợc áp dụng trong bộ tiêu chí này [60]. Tiêu chuẩn chẩn đoán VPTM dựa vào mô học cũng đƣợc giới thiệu trong giai đoạn này. Các tiêu chí bao gồm tích tụ bạch cầu đa nhân trong màng phế nang mao mạch và số lƣợng VK ≥ 103 cfu/g nhu mô phổi ở ít nhất một mẫu sinh thiết [47]. Từ khi giáo sƣ Shigeto Ekeda giới thiệu nội soi phế quản ống mềm, các nghiên cứu (NC) về VPTM dựa vào đó để tiếp cận chất tiết đƣờng hô hấp dƣới.

Winberley áp dụng nội soi phế quản ống mềm và đề xuất tiêu chuẩn cho nội soi phế quản có nòng bảo vệ với ngƣỡng 103 cfu/ml đƣợc gọi là dƣơng tính [55], [108]. Đối với dịch rửa phế quản phế nang cần ≥ 104 cfu/ml và dịch hút qua nội khí quản cần ≥ 105 cfu/ml đƣợc gọi là dƣơng tính [42]. Năm 1988, CDC đƣa ra định nghĩa cho VP. Bộ tiêu chí đƣợc xây dựng dựa trên hệ thống khảo sát nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia Hoa Kỳ (NNIS1).

Các tiêu chí bao gồm ran hoặc gõ đục ở phổi kèm theo các dấu chứng sau: (a) đàm mủ mới xuất hiện; (b) phân lập đƣợc vi sinh vật từ máu; (c) phân lập đƣợc tác nhân gây bệnh từ dịch hút khí quản, chải phế quản hoặc sinh thiết. Ngoài ra, CDC còn giới thiệu NNIS2 bao gồm thâm nhiễm mới hoặc tiến triển, đông đặc, tạo hang hoặc tràn dịch màng phổi trên X-quang ngực kèm theo ít nhất một trong ba tiêu chí (a), (b), (c) của NNIS1 ở trên [51]. 4 Vào thập niên 90, Pugin giới thiệu thang điểm VP trên lâm sàng (CPIS) từ 0 đến 12 điểm bao gồm nhiệt độ; bạch cầu máu kể cả dạng non; đặc tính dịch tiết khí phế quản; nhuộm Gram và cấy đàm; PaO2/FiO2; X-quang ngực [84]. Năm 2005 ATS và IDSA đƣa ra định nghĩa VPTM trên lâm sàng bao gồm: thâm nhiễm mới hoặc tiến triển trên X-quang ngực kèm theo hai trong ba tiêu chí sau: T0 > 380C, bạch cầu tăng hoặc giảm và tăng tiết đàm mủ.

Xác định tác nhân gây bệnh bằng cấy định lƣợng hoặc bán định lƣợng đàm hút qua nội khí quản hoặc nội soi phế quản. Tiêu chuẩn CPIS và CPIS hiệu chỉnh đƣợc khuyên áp dụng cho chẩn đoán VPTM [24]. Năm 2011 Craven đã đƣa ra tiêu chuẩn chẩn đoán nhiễm khuẩn hô hấp liên quan thở máy (ventilator – associated respiratory infections: VARI), bao gồm các tiêu chí chẩn đoán VPTM nhƣ trên và viêm khí phế quản liên quan thở máy (ventilator – associated tracheobronchitis: VAT). Các tiêu chí viêm khí phế quản liên quan thở máy bao gồm các triệu chứng cơ năng, thực thể và thời gian thở máy giống nhƣ VPTM.

Nhƣng không có thâm nhiễm lan tỏa hay tiến triển ở hai phổi khi dựa vào hình ảnh X-quang hoặc CT ngực và bằng chứng vi sinh khi dựa vào tiêu chí chẩn đoán xâm lấn bằng nội soi phế quản tại giƣờng [40], [86]. CDC 2014 đƣa ra khái niệm biến cố liên quan thở máy (VAE) gồm biến chứng liên quan thở máy, biến chứng liên quan nhiễm khuẩn trên BN thở máy, có thể VPTM, có thể có khả năng VPTM. Trong đó, biến chứng liên quan thở máy (VAC) bao gồm sau hai ngày thở máy, BN có ít nhất một trong hai tiêu chí sau: (1) Tăng tiêu thụ oxy: tăng FiO2 ≥ 20% mỗi ngày, liên tục trong hai ngày liên tiếp. (2) Tăng nhu cầu PEEP: tăng PEEP ≥ 3 cmH20 mỗi ngày, liên tục trong hai ngày liền.

Biến chứng liên quan nhiễm khuẩn trên BN thở máy (IVAC) bao gồm sau 3 – 4 ngày thở máy, BN có VAC kèm hai tiêu chí sau: (1) T0 > 380C hoặc < 360C, hoặc bạch cầu máu > 12. (2) Sử dụng kháng sinh ≥ 4 ngày liền. Có thể VPTM bao gồm sau 3 – 4 ngày thở máy, BN có VAC và IVAC kèm một trong các tiêu chí sau: (1) tăng tiết đàm mủ, (2) cấy đàm dƣơng tính. Có thể có khả năng VPTM gồm sau 3 – 4 ngày thở máy, BN có VAC và IVAC kèm một trong các tiêu chí sau: (1) tăng tiết đàm mủ kèm cấy định lƣợng dƣơng tính.

Tiêu chí cho. 5 cấy định lƣợng bao gồm nếu đàm hút qua nội khí quản cần ≥ 105 cfu/ml, đối với dịch rửa phế quản phế nang và mô phổi cần ≥ 104 cfu/ml, còn tiêu chí chải phế quản có nòng bảo vệ chỉ cần ≥ 103 cfu/ml. (2) Hoặc một trong các tiêu chí sau: (i) cấy dƣơng tính dịch màng phổi, (ii) cấy dƣơng tính mô bệnh học phổi, (iii) xét nghiệm dƣơng tính với Legionella spp, xét nghiệm dƣơng tính với virus từ dịch tiết phổi. Gần đây nhất, năm 2016 IDSA đƣa ra hƣớng dẫn về VP nhƣ sau: thâm nhiễm mới trên phổi cùng với các bằng chứng lâm sàng chứng tỏ thâm nhiễm này có nguồn gốc từ nhiễm khuẩn.

Các bằng chứng lâm sàng bao gồm: mới khởi phát sốt, mới tiết đàm mủ, mới tăng bạch cầu và mới giảm oxy hóa máu. VPTM đƣợc định nghĩa nhƣ là VP trên BN thở máy > 48 giờ sau đặt nội khí quản [61]. Nói tóm lại VPTM có thể đƣợc định nghĩa là viêm nhu mô phổi xảy ra sau 48 giờ thở máy qua nội khí quản hoặc qua khai khí quản [42], [61]. Mặc dù khái niệm rõ ràng nhƣ vậy, nhƣng hơn năm thập niên qua liên tiếp có rất nhiều định nghĩa VPTM đƣợc ra đời nhƣ định nghĩa của CDC 2014, nhƣng không có định nghĩa nào đƣợc chấp nhận rộng rãi toàn cầu.

Thậm chí định nghĩa VPTM dựa vào các dấu hiệu mô học từ tử thiết cũng không đƣợc chắc chắn đồng thuận hoặc tán thành.