Nghiên Cứu Tác Nhân Vi Khuẩn Gây Viêm Phổi Thở Máy và Gene Kháng Thuốc

Nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy và gene kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử, cung cấp thông tin quan trọng cho y học.

• Tác giả: Trần Minh Giang
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Văn Ngọc
• Trường học: Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Hồi sức cấp cứu và chống độc
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Nhân Vi Khuẩn Gây Viêm Phổi Thở Máy và Gene Kháng Thuốc
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ Y Học
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tỉ lệ mới mắc của viêm phổi thở máy
• 1.2. Tỉ lệ tử vong
• 1.3. Các yếu tố nguy cơ
• 1.4. Thực hiện kháng sinh đồ trên vi khuẩn phân lập đƣợc từ VPTM
• 1.5. Ứng dụng sinh học phân tử trong phát hiện gene kháng thuốc
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 2.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Thời gian nghiên cứu
• 2.4. Đối tượng nghiên cứu. Cỡ mẫu và công thức tính cỡ mẫu
• 2.5. Tiêu chuẩn chọn mẫu
• 2.6. Phương pháp tiến hành
• 2.7. Thu thập số liệu và phân tích dữ liệu
• 2.8. Đạo đức trong nghiên cứu
• 2.9. Liệt kê và định nghĩa các biến số
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đặc điểm chung. Định danh vi khuẩn dựa trên vi sinh kinh điển
• 3.2. Định danh vi khuẩn dựa trên giải trình tự gene 16S-rRNA
• 3.3. Tổng số loài vi khuẩn phát hiện đƣợc trên từng mẫu dịch rửa phế quản phế nang
• 3.4. So sánh giữa giải trình tự gene 16S-rRNA và vi sinh kinh điển trong định danh vi khuẩn
• 3.5. Thời gian nằm ICU và tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy
• 3.6. Kết quả kháng sinh đồ
• 3.7. Kết quả kháng sinh đồ MIC dựa trên E-test
• 3.8. Kết quả PCR tìm gene kháng thuốc
• 3.9. Kết quả điều trị
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Định danh vi khuẩn
• 4.2. Kết quả kháng sinh đồ
• 4.3. Xác định gene kháng thuốc và mối liên quan với đề kháng kháng sinh
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Vi Khuẩn Gây Viêm Phổi Thở Máy

Nghiên cứu về vi khuẩn gây viêm phổi thở máy (VPTM) là một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. VPTM không chỉ là một vấn đề lâm sàng nghiêm trọng mà còn là một thách thức lớn trong điều trị. Tại Việt Nam, tỉ lệ mắc VPTM dao động từ 20% đến 52%, cho thấy sự cần thiết phải nghiên cứu sâu hơn về các tác nhân gây bệnh và cơ chế kháng thuốc. Việc xác định chính xác gene kháng thuốc và các loại vi khuẩn gây bệnh sẽ giúp cải thiện hiệu quả điều trị và giảm tỉ lệ tử vong.

1.1. Định Nghĩa Viêm Phổi Thở Máy và Tác Nhân Gây Bệnh

Viêm phổi thở máy được định nghĩa là viêm nhu mô phổi xảy ra sau 48 giờ thở máy qua nội khí quản. Các tác nhân gây bệnh chủ yếu bao gồm các loại vi khuẩn như Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa và Klebsiella pneumoniae. Việc xác định chính xác các tác nhân này là rất quan trọng để có phương pháp điều trị hiệu quả.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Gene Kháng Thuốc

Nghiên cứu về gene kháng thuốc giúp xác định các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để kháng lại các loại kháng sinh. Điều này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về sự phát triển của kháng sinh mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới. Việc phát hiện gene kháng thuốc cũng giúp theo dõi sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc trong cộng đồng.

II. Vấn Đề Kháng Thuốc Trong Vi Khuẩn Gây Viêm Phổi Thở Máy

Kháng thuốc là một trong những thách thức lớn nhất trong điều trị viêm phổi thở máy. Sự gia tăng của các chủng vi khuẩn kháng thuốc đã làm cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn. Theo nghiên cứu, tỉ lệ vi khuẩn kháng thuốc tại Việt Nam đang gia tăng nhanh chóng, đặc biệt là các chủng như Acinetobacter baumannii. Việc hiểu rõ về tình hình kháng thuốc sẽ giúp các bác sĩ có những quyết định điều trị chính xác hơn.

2.1. Tình Hình Kháng Thuốc Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, tỉ lệ vi khuẩn kháng thuốc đang gia tăng đáng kể. Nghiên cứu cho thấy rằng tỉ lệ kháng thuốc của Acinetobacter baumannii đã tăng từ 6,7% vào năm 2001 lên đến 90% vào năm 2012. Điều này cho thấy sự cần thiết phải có các biện pháp kiểm soát và giám sát chặt chẽ hơn.

2.2. Các Yếu Tố Góp Phần Vào Kháng Thuốc

Nhiều yếu tố góp phần vào sự phát triển của kháng thuốc, bao gồm việc sử dụng kháng sinh không hợp lý, điều trị không đúng cách và sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viện. Việc nâng cao nhận thức về kháng thuốc trong cộng đồng và trong các cơ sở y tế là rất quan trọng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Gene Kháng Thuốc Trong Vi Khuẩn

Phương pháp nghiên cứu gene kháng thuốc trong vi khuẩn gây viêm phổi thở máy thường sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử như PCR và giải trình tự gene 16S-rRNA. Những phương pháp này cho phép xác định chính xác các loại vi khuẩn và gene kháng thuốc, từ đó giúp cải thiện quy trình điều trị. Việc áp dụng các công nghệ mới trong nghiên cứu sẽ mang lại nhiều lợi ích cho việc điều trị và phòng ngừa bệnh.

3.1. Kỹ Thuật PCR Trong Phát Hiện Gene Kháng Thuốc

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để phát hiện gene kháng thuốc. Phương pháp này cho phép khuếch đại các đoạn DNA cụ thể, giúp xác định sự hiện diện của các gene kháng thuốc trong vi khuẩn một cách nhanh chóng và chính xác.

3.2. Giải Trình Tự Gene 16S rRNA Trong Định Danh Vi Khuẩn

Giải trình tự gene 16S-rRNA là một phương pháp mạnh mẽ trong việc định danh vi khuẩn. Phương pháp này cho phép xác định các loài vi khuẩn một cách chính xác, từ đó giúp các bác sĩ có thể đưa ra phương pháp điều trị phù hợp hơn cho bệnh nhân mắc viêm phổi thở máy.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Gene Kháng Thuốc

Nghiên cứu về gene kháng thuốc không chỉ có giá trị trong việc hiểu rõ hơn về cơ chế kháng thuốc mà còn có ứng dụng thực tiễn trong điều trị. Việc phát hiện sớm các gene kháng thuốc sẽ giúp bác sĩ lựa chọn kháng sinh phù hợp, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị và giảm tỉ lệ tử vong. Các ứng dụng này đang được nghiên cứu và phát triển tại nhiều cơ sở y tế.

4.1. Cải Thiện Quy Trình Điều Trị Bệnh Nhân

Việc phát hiện sớm các gene kháng thuốc giúp bác sĩ có thể điều chỉnh phác đồ điều trị kịp thời. Điều này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả điều trị mà còn giảm thiểu nguy cơ lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viện.

4.2. Giảm Tỉ Lệ Tử Vong Do Viêm Phổi Thở Máy

Nghiên cứu cho thấy rằng việc áp dụng các phương pháp phát hiện gene kháng thuốc có thể giúp giảm tỉ lệ tử vong do viêm phổi thở máy. Bằng cách điều trị kịp thời và chính xác, bệnh nhân có thể hồi phục nhanh chóng hơn.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Vi Khuẩn Gây Viêm Phổi Thở Máy

Nghiên cứu về vi khuẩn gây viêm phổi thở máy và gene kháng thuốc là một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. Việc hiểu rõ về các tác nhân gây bệnh và cơ chế kháng thuốc sẽ giúp cải thiện quy trình điều trị và giảm tỉ lệ tử vong. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong việc điều trị và phòng ngừa viêm phổi thở máy.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Gene Kháng Thuốc

Tương lai của nghiên cứu gene kháng thuốc hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong việc phát hiện và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Các công nghệ mới sẽ giúp nâng cao khả năng phát hiện và điều trị hiệu quả hơn.

5.2. Vai Trò Của Nghiên Cứu Trong Y Học Hiện Đại

Nghiên cứu về vi khuẩn và gene kháng thuốc đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện sức khỏe cộng đồng. Việc phát hiện và điều trị kịp thời sẽ giúp giảm thiểu các bệnh lý nghiêm trọng và nâng cao chất lượng cuộc sống.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm phổi thở máy (VPTM) là một vấn đề lâm sàng quan trọng không chỉ ở Việt Nam mà còn trên thế giới vì tần suất mắc bệnh và tử vong tăng cao. Tại Canada, VPTM là 18 ca trên 1000 ngày thở máy [75]. Các quốc gia Á Châu VPTM là 18% [43]. Tại Việt Nam, VPTM dao động từ 20% - 52%, [2], [5], [7], [8], [11], [16], [17].

VPTM là nguyên nhân hàng đầu gây tăng tỉ lệ tử vong (26% - 72%), kéo dài thời gian nằm viện (41 so với 23 ngày ở nhóm có và không VPTM) và tăng chi phí điều trị (5 – 10 lần) [5], [41]. VPTM đƣợc định nghĩa là viêm nhu mô phổi xảy ra sau 48 giờ thở máy qua nội khí quản hoặc qua khai khí quản [42], [61]. Chẩn đoán VPTM đƣợc thiết lập dựa trên chứng cứ lâm sàng và vi sinh. Việc xác định vi khuẩn (VK) gây bệnh thông qua cấy định lƣợng hoặc bán định lƣợng đàm hút qua nội khí quản đơn thuần hoặc qua nội soi phế quản [34], [41], [50].

Việc định danh VK bằng nhuộm Gram, nuôi cấy, đặc tính mọc và các phản ứng sinh hóa là chuẩn mực. Tuy nhiên phƣơng pháp vi sinh kinh điển này không thể áp dụng trong các trƣờng hợp sau: VK Gram âm khó mọc, mọc chậm; VK hiếm hoặc chỉ biểu hiện một vài đặc tính về sinh hóa. Cũng nhƣ các VK yếm khí, VK không cấy đƣợc và bệnh lý nhiễm khuẩn có kết quả cấy âm tính, nhất là trên bệnh nhân (BN) sử dụng kháng sinh trƣớc đó [50], [57], [73], [74], [83], [97], [114]. Chẩn đoán phân tử, ngày nay, đã trở thành phƣơng pháp tham chiếu để chẩn đoán vi sinh học của nhiều bệnh lý hô hấp [73].

Vai trò của giải trình tự gene 16S - rRNA trong định danh VK càng đƣợc chứng tỏ và đƣợc áp dụng rộng rãi trên lâm sàng [57], [58], [80], [116], [117]. Phƣơng pháp giải trình tự gene 16S - rRNA có thể phát hiện đƣợc hệ vi sinh trên đƣờng hô hấp của ngƣời khỏe và BN [29], [44], [88]. Tại Việt Nam số liệu từ các NC về định danh VK dựa trên sinh học phân tử ở các BN VPTM chƣa nhiều và chƣa đƣợc hệ thống đầy đủ. 2 Ngày nay, VK đa kháng kháng sinh là một thách thức toàn cầu [58].

Đặc biệt là các quốc gia Á Châu, kể cả Việt Nam [12], [20], [59], [74], [78], [101]. baumannii kháng Carbapenem tăng lên nhanh chóng 6,7% (2001) [8]; 8% (2004) [17]; 80% (2010) [11]; 90% (2012) [5]. Tuy nhiên, kháng sinh đồ định lƣợng MIC bằng que E-test chƣa đƣợc áp dụng rộng rãi và số liệu chƣa đƣợc hệ thống đầy đủ. Các VK mang gene SHV, TEM, IMP, OXA, NDM thủy phân phổ rộng các cephalosporin là thƣờng gặp [81].

Trong nƣớc, việc tiếp cận có hệ thống gene kháng thuốc của VK chính yếu gây VPTM chƣa đƣợc ghi nhận và hệ thống hóa đầy đủ. Ở Việt Nam, chƣa có nghiên cứu nào áp dụng giải trình tự thế hệ mới trong việc xác định VK gây VPTM trên các mẫu dịch rửa phế quản phế nang. Chúng tôi đặt ra 3 câu hỏi nghiên cứu: (a) Có sự khác biệt nào trong định danh VK gây VPTM giữa hai phƣơng pháp định danh VK dựa vào kiểu hình và giải trình tự gene 16S- rRNA; (b) Giá trị MIC và tỉ lệ đề kháng kháng sinh ở các nhóm VK gây VPTM phân bố nhƣ thế nào?; (c) Tỉ lệ VK chính yếu gây VPTM mang gene kháng thuốc là bao nhiêu và có mối liên quan giữa các VK mang gene kháng thuốc với MIC hay không? Trả lời những câu hỏi nghiên cứu trên sẽ cung cấp những kiến thức quan trọng về qui mô đề kháng kháng sinh và xác lập đƣợc những tác nhân liên quan đến VPTM, giúp cho việc điều trị BN tốt hơn. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu: 1.

Xác định đặc điểm vi khuẩn gây viêm phổi thở máy bằng kỹ thuật giải trình tự gene 16S - rRNA, có so sánh với phƣơng pháp định danh vi khuẩn dựa vào nhuộm Gram, nuôi cấy và các phản ứng sinh hóa. Đánh giá MIC và tỉ lệ đề kháng kháng sinh ở các nhóm vi khuẩn gây viêm phổi thở máy. Xác định gene kháng thuốc của vi khuẩn gây viêm phổi thở máy bằng kỹ thuật PCR và mối liên quan với MIC. 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Định nghĩa Viêm phổi thở máy (VPTM) đƣợc định nghĩa là viêm nhu mô phổi xảy ra sau 48 giờ thở máy qua nội khí quản hoặc qua khai khí quản [42], [61]. Ngay từ những thập niên đầu áp dụng thở máy xâm nhập đã có nhiều định nghĩa về VPTM. Từ những thập niên 70, Johanson đã áp dụng tiêu chuẩn chẩn đoán cho VPTM bao gồm thâm nhiễm mới hoặc tiến triển trên X-quang ngực; sốt; bạch cầu máu tăng và tăng tiết đàm mủ khí phế quản. Ngoài ra tác giả này còn đƣa ra định nghĩa có thể có khả năng VPTM bao gồm sốt, tăng bạch cầu máu kèm theo hoặc thâm nhiễm mới hay tiến triển trên X-quang ngực hoặc hiện diện đàm mủ.

Kết quả cấy vi sinh không đƣợc áp dụng trong bộ tiêu chí này [60]. Tiêu chuẩn chẩn đoán VPTM dựa vào mô học cũng đƣợc giới thiệu trong giai đoạn này. Các tiêu chí bao gồm tích tụ bạch cầu đa nhân trong màng phế nang mao mạch và số lƣợng VK ≥ 103 cfu/g nhu mô phổi ở ít nhất một mẫu sinh thiết [47]. Từ khi giáo sƣ Shigeto Ekeda giới thiệu nội soi phế quản ống mềm, các nghiên cứu (NC) về VPTM dựa vào đó để tiếp cận chất tiết đƣờng hô hấp dƣới.

Winberley áp dụng nội soi phế quản ống mềm và đề xuất tiêu chuẩn cho nội soi phế quản có nòng bảo vệ với ngƣỡng 103 cfu/ml đƣợc gọi là dƣơng tính [55], [108]. Đối với dịch rửa phế quản phế nang cần ≥ 104 cfu/ml và dịch hút qua nội khí quản cần ≥ 105 cfu/ml đƣợc gọi là dƣơng tính [42]. Năm 1988, CDC đƣa ra định nghĩa cho VP. Bộ tiêu chí đƣợc xây dựng dựa trên hệ thống khảo sát nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia Hoa Kỳ (NNIS1).

Các tiêu chí bao gồm ran hoặc gõ đục ở phổi kèm theo các dấu chứng sau: (a) đàm mủ mới xuất hiện; (b) phân lập đƣợc vi sinh vật từ máu; (c) phân lập đƣợc tác nhân gây bệnh từ dịch hút khí quản, chải phế quản hoặc sinh thiết. Ngoài ra, CDC còn giới thiệu NNIS2 bao gồm thâm nhiễm mới hoặc tiến triển, đông đặc, tạo hang hoặc tràn dịch màng phổi trên X-quang ngực kèm theo ít nhất một trong ba tiêu chí (a), (b), (c) của NNIS1 ở trên [51]. 4 Vào thập niên 90, Pugin giới thiệu thang điểm VP trên lâm sàng (CPIS) từ 0 đến 12 điểm bao gồm nhiệt độ; bạch cầu máu kể cả dạng non; đặc tính dịch tiết khí phế quản; nhuộm Gram và cấy đàm; PaO2/FiO2; X-quang ngực [84]. Năm 2005 ATS và IDSA đƣa ra định nghĩa VPTM trên lâm sàng bao gồm: thâm nhiễm mới hoặc tiến triển trên X-quang ngực kèm theo hai trong ba tiêu chí sau: T0 > 380C, bạch cầu tăng hoặc giảm và tăng tiết đàm mủ.

Xác định tác nhân gây bệnh bằng cấy định lƣợng hoặc bán định lƣợng đàm hút qua nội khí quản hoặc nội soi phế quản. Tiêu chuẩn CPIS và CPIS hiệu chỉnh đƣợc khuyên áp dụng cho chẩn đoán VPTM [24]. Năm 2011 Craven đã đƣa ra tiêu chuẩn chẩn đoán nhiễm khuẩn hô hấp liên quan thở máy (ventilator – associated respiratory infections: VARI), bao gồm các tiêu chí chẩn đoán VPTM nhƣ trên và viêm khí phế quản liên quan thở máy (ventilator – associated tracheobronchitis: VAT). Các tiêu chí viêm khí phế quản liên quan thở máy bao gồm các triệu chứng cơ năng, thực thể và thời gian thở máy giống nhƣ VPTM.

Nhƣng không có thâm nhiễm lan tỏa hay tiến triển ở hai phổi khi dựa vào hình ảnh X-quang hoặc CT ngực và bằng chứng vi sinh khi dựa vào tiêu chí chẩn đoán xâm lấn bằng nội soi phế quản tại giƣờng [40], [86]. CDC 2014 đƣa ra khái niệm biến cố liên quan thở máy (VAE) gồm biến chứng liên quan thở máy, biến chứng liên quan nhiễm khuẩn trên BN thở máy, có thể VPTM, có thể có khả năng VPTM. Trong đó, biến chứng liên quan thở máy (VAC) bao gồm sau hai ngày thở máy, BN có ít nhất một trong hai tiêu chí sau: (1) Tăng tiêu thụ oxy: tăng FiO2 ≥ 20% mỗi ngày, liên tục trong hai ngày liên tiếp. (2) Tăng nhu cầu PEEP: tăng PEEP ≥ 3 cmH20 mỗi ngày, liên tục trong hai ngày liền.

Biến chứng liên quan nhiễm khuẩn trên BN thở máy (IVAC) bao gồm sau 3 – 4 ngày thở máy, BN có VAC kèm hai tiêu chí sau: (1) T0 > 380C hoặc < 360C, hoặc bạch cầu máu > 12. (2) Sử dụng kháng sinh ≥ 4 ngày liền. Có thể VPTM bao gồm sau 3 – 4 ngày thở máy, BN có VAC và IVAC kèm một trong các tiêu chí sau: (1) tăng tiết đàm mủ, (2) cấy đàm dƣơng tính. Có thể có khả năng VPTM gồm sau 3 – 4 ngày thở máy, BN có VAC và IVAC kèm một trong các tiêu chí sau: (1) tăng tiết đàm mủ kèm cấy định lƣợng dƣơng tính.

Tiêu chí cho. 5 cấy định lƣợng bao gồm nếu đàm hút qua nội khí quản cần ≥ 105 cfu/ml, đối với dịch rửa phế quản phế nang và mô phổi cần ≥ 104 cfu/ml, còn tiêu chí chải phế quản có nòng bảo vệ chỉ cần ≥ 103 cfu/ml. (2) Hoặc một trong các tiêu chí sau: (i) cấy dƣơng tính dịch màng phổi, (ii) cấy dƣơng tính mô bệnh học phổi, (iii) xét nghiệm dƣơng tính với Legionella spp, xét nghiệm dƣơng tính với virus từ dịch tiết phổi. Gần đây nhất, năm 2016 IDSA đƣa ra hƣớng dẫn về VP nhƣ sau: thâm nhiễm mới trên phổi cùng với các bằng chứng lâm sàng chứng tỏ thâm nhiễm này có nguồn gốc từ nhiễm khuẩn.

Các bằng chứng lâm sàng bao gồm: mới khởi phát sốt, mới tiết đàm mủ, mới tăng bạch cầu và mới giảm oxy hóa máu. VPTM đƣợc định nghĩa nhƣ là VP trên BN thở máy > 48 giờ sau đặt nội khí quản [61]. Nói tóm lại VPTM có thể đƣợc định nghĩa là viêm nhu mô phổi xảy ra sau 48 giờ thở máy qua nội khí quản hoặc qua khai khí quản [42], [61]. Mặc dù khái niệm rõ ràng nhƣ vậy, nhƣng hơn năm thập niên qua liên tiếp có rất nhiều định nghĩa VPTM đƣợc ra đời nhƣ định nghĩa của CDC 2014, nhƣng không có định nghĩa nào đƣợc chấp nhận rộng rãi toàn cầu.

Thậm chí định nghĩa VPTM dựa vào các dấu hiệu mô học từ tử thiết cũng không đƣợc chắc chắn đồng thuận hoặc tán thành.